Name: Plataforma Lab-on-a-CD para generar esferoides tridimensionales multicelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a generar esferoides multicelulares tridimensionales mediante una plataforma lab-on-a-CD con microfluidos centrífugos. Este método permite el cocultivo de diferentes tipos celulares bajo alta gravedad.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación científica básica (2016R1D1A1B03934418) y el Programa de Desarrollo de Bio y Tecnología Médica (2018M3A9H1023141) de la NRF, y financiado por el gobierno coreano, MSIT.

1. Fabricación de chips de cultivo de esferoides (CMS) de base microfluídica centrífuga
<ol><li>Haga moldes de PC para las capas superior e inferior de la viruta de cultivo CMS mediante mecanizado CNC. Las dimensiones detalladas del chip se indican en la Figura 1.</li>
	<li>Mezcle la base PDMS y el agente de curado PDMS con una proporción de 10:1 (p/p) durante 5 min y colóquelo en un desecador durante 1 h para eliminar las burbujas de aire.</li>
	<li>Después de verter la mezcla PDMS en los moldes del chip de cultivo CMS, retire las burbujas de aire durante 1 h más y cure en una cámara de calor a 80 oC durante 2 h.</li>
	<li>Colóquelos en el limpiador de plasma aspirado con las superficies a unir hacia arriba y expongalas al plasma asistido por aire a una potencia de 18 W durante 30 s.</li>
	<li>Unir las dos capas del chip de cultivo CMS y colocarlo en la cámara de calor a 80 oC durante 30 minutos para aumentar la resistencia a la adhesión.</li>
	<li>Esterilice el chip de cultivo CMS en un esterilizador de autoclave a 121 oC y 15 psi.</li>
</ol>2. Preparación celular
<ol><li>Descongelar el 1 ml del vial que contiene 5 x 105–1 x 106 hASCs o células MRC-5s en un baño de agua a 36,5 oC durante 2 min.</li>
	<li>Añadir 1 ml del medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco a un vial y mezclar suavemente con una pipeta de 1.000 ml.</li>
	<li>Poner 15 ml del DMEM precalentado a 36,5 oC en una placa Petri de 150 mm de diámetro utilizando una pipeta y añadir las células del vial.</li>
	<li>Después de 1 día, aspirar el DMEM y reemplazar con 15 mL de DMEM fresco. Posteriormente, cambie el soporte cada 2 o 3 días.</li>
	<li>Para separar las células de la placa Petri, añadir 4 ml de trippsina a los platos de Petri y colocarlas en una incubadora a 36,5 oC y 5% de CO2 durante 4 min.</li>
</ol>3. Formación de esferoides monocultivos
<ol><li>Poner 2,5 ml de solución pluronica F-127 del 4% (p/v) en el orificio de entrada del chip de cultivo CMS(Figura 2A)mientras gira el chip a 500–1.000 rpm y luego gire el chip a 4.000 rpm durante 3 minutos utilizando el sistema CMS(Figura 2B). NOTA: El recubrimiento pluónico evita la fijación celular al puerto de entrada mientras el chip gira. Asegúrese de que el aire no quede atrapado en los micropozos.</li>
	<li>Incubar el chip de cultivo CMS lleno de solución pluronica durante la noche a 36,5 oC en 5% de CO2.</li>
	<li>Retire la solución pluronic, lave la solución pluronica restante con DMEM y seque el chip durante 12 h en un banco limpio.</li>
	<li>Añadir 2,5 ml de DMEM al chip de cultivo CMS y girar el chip a 4.000 rpm durante 3 minutos para prehumedecer el interior del chip.</li>
	<li>Detenga la rotación y extraiga 100 ml de DMEM para dejar espacio para inyectar la suspensión celular.</li>
	<li>Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan 5 x 105 hASCs o 8 x 105 MRC-5s mediante pipeteo Distribuir uniformemente las células mediante pipeteo de 3 a 5x para la resuspensión.</li>
	<li>Gire el chip a 3.000 rpm durante 3 minutos para atrapar las células de cada micropozo por fuerza centrífuga. NOTA: La velocidad de rotación excesiva puede provocar el escape de la célula a través de orificios de eyección de la solución.</li>
	<li>Cultivo de las células durante 3 días en la incubadora a 36,5 oC, >95% de humedad y 5% CO2,girando a 1.000-2.000 rpm. Cambiar el medio cultural todos los días.</li>
</ol>4. Formación de esferoides de cocultura
<ol><li>
Formación de esferoides concéntricos
	<ol>
<li>Agregue las primeras celdas, 2,5 x 105 hASCs, y gire el chip a 3.000 rpm. Después de 3 min, agregue las segundas celdas, 4 x 105 MRC-5s, y gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min. Inyecte un total de 100 l de suspensiones celulares pipeteando. Cuando se inyectan las células, cambie la velocidad de rotación a 500-1.000 rpm.</li>
		<li>Cultivo de las células en la incubadora a 36,5 oC, >95% humedad%, y 5% CO2 girando a 1.000–2.000 rpm. Los esferoides concéntricos se crean dentro de 24 h. Para la cultura a largo plazo, cambie el medio cultural cada día.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formación de esferoides de Janus
	<ol>
<li>Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan las primeras células, 2,5 x 105 hASC, pipeteando mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.</li>
		<li>Incubar el chip a 36,5 oC, >95% de humedad y 5% de CO2 girando a 1.000–2.000 rpm durante 3 h.</li>
		<li>Añadir 100 l de las suspensiones de células que contienen el segundo conjunto de células, 4 x 105 MRC-5s, mediante pipeteo mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.</li>
		<li>Cultivo de las células en la incubadora a 36,5 oC, >95% de humedad y 5%co2 girando a 1.000–2.000 rpm. Los esferoides de Janus se crean dentro de 24 h. Para la cultura a largo plazo, cambie el medio cultural cada día.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Formación de esferoides sándwich
	<ol>
<li>Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan las primeras células, 1,5 x 105 hASC, pipeteando mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.</li>
		<li>Incubar el chip a 36,5 oC, >95% de humedad y 5% de CO2 girando a 1.000–2.000 rpm durante 3 h.</li>
		<li>Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan las segundas células, 3 x 105 MRC-5s, pipeteando mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.</li>
		<li>Incubar el chip a 36,5 oC, >95% de humedad%, y 5% CO2 girando a 1.000–2.000 rpm durante 3 h.</li>
		<li>Añadir 100 l de suspensiones celulares que contengan las terceras células, 1,5 x 105 hASC, pipeteando mientras la viruta gira a 500–1.000 rpm. A continuación, gire el chip a 3.000 rpm durante 3 min.</li>
		<li>Cultivo de las células en la incubadora a 36,5 oC, >95% humedad%, y 5% CO2 girando a 1.000–2.000 rpm. Los esferoides sándwich se crean dentro de 12 h. Para la cultura a largo plazo, cambie el medio cultural cada día.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Tinción celular
<ol><li>Calentar el tinte de fluorescencia celular a temperatura ambiente (20 oC).</li>
	<li>Añadir 20 ml de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) por vial para hacer una solución de 1 mM.</li>
	<li>Diluir la fluorescencia a una concentración de trabajo final de 1 M utilizando DMEM.</li>
	<li>Agregue la fluorescencia a la suspensión celular y resuspenda suavemente con una pipeta.</li>
	<li>Incubar 20 min a 36,5oC, humedad de >95%, y 5%CO2.</li>
</ol>

<ol><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+Advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li>
<li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+in+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li>
<li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li>
<li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).</li>
<li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li>
<li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li>
<li>Park, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li>
<li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li>
<li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li>
<li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El CMS es un sistema cerrado en el que todas las células inyectadas entran en el micropozo sin residuos, haciéndolo más eficiente y económico que los métodos convencionales de generación de esferoides basados en micropozos. En el sistema CMS, el medio se reemplaza cada 12-24 h a través de un orificio de aspiración diseñado para quitar el medio en el chip(Figura 3A). Durante el proceso de succión de medios, apenas cualquier medio escapa del interior del micropozo debido a la tensión superfici...

Es más fácil simular microambientes biológicos in vivo con cultivo de células esferoides tridimensionales (3D) que con cultivo celular bidimensional (2D) (por ejemplo, cultivo celular de placa Petri convencional) para producir un cultivo experimental experimental más fisiológicamente realista resultados1. Los métodos de formación de esferoides actualmente disponibles incluyen la técnica de gota colgante2,la técnica de superposición de líquido sin carga3,la técnica de carboximetilcelulosa4,la técnica microfluídica basada en la fuerza magnética5,y el uso de biorreactores6. Aunque cada método tiene sus propios beneficios, es necesaria una mejora adicional en la reproducibilidad, la productividad y la generación de esferoides de cocultura. Por ejemplo, mientras que la técnica microfluídica basada en la fuerza magnética5 es relativamente barata, los efectos de los campos magnéticos fuertes en las células vivas deben ser cuidadosamente considerados. Los beneficios del cultivo esferoide, particularmente en el estudio de la diferenciación y proliferación de células madre mesenquimales, se han divulgado en varios estudios7,8,9.
El sistema microfluídico centrífugo, también conocido como laboratorio en un CD (disco compacto), es útil para controlar fácilmente el fluido en el interior y explotar la rotación del sustrato y, por lo tanto, se ha utilizado en aplicaciones biomédicas como los inmunoensayos10, ensayos colorimétricos para la detección de marcadores bioquímicos11, ensayos de amplificación de ácido nucleico (PCR), sistemas automatizados de análisis de sangre12y dispositivos microfluídicos centrífugos todo en uno13. La fuerza motriz que controla el fluido es la fuerza centrípeta creada por rotación. Además, múltiples funciones de mezcla, válvula y división de muestras se pueden hacer simplemente en esta única plataforma de CD. Sin embargo, en comparación con los métodos de análisis bioquímicos antes mencionados, ha habido menos ensayos aplicando plataformas de CD a las células de cultivo, especialmente los esferoides14.
En este estudio, mostramos el rendimiento del sistema centrífugo de esferoides microfluídicos (CMS) por monocultivo o cocultivo de células madre derivadas de adiposos humanos (hASC) y fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5). Este artículo describe en detalle la metodología de investigación de nuestro grupo15. Por lo tanto, la plataforma de laboratorio en un CD de cultivo de esferoide se puede reproducir fácilmente. Se presenta un sistema de generación CMS que comprende un chip de cultivo CMS, un soporte de chip, un motor de CC, un soporte de motor y una plataforma giratoria. El soporte del motor está impreso en 3D con acrilonitrilo butadieno estireno (ABS). El soporte de viruta y la plataforma giratoria son CNC (control numérico por ordenador) mecanizado con el PC (policarbonato). La velocidad de rotación del motor se controla de 200 a 4.500 rpm mediante la codificación de un algoritmo PID (proporcional-integral-derivado) basado en la modulación de ancho de pulso. Sus dimensiones son de 100 mm x 100 mm x 150 mm y pesa 860 g, por lo que es fácil de manejar. Usando el sistema CMS, los esferoides se pueden generar bajo diversas condiciones de gravedad de 1 x g a 521 x g,por lo que el estudio de la promoción de la diferenciación celular bajo alta gravedad se puede extender de las células 2D16,17 a 3D Esferoide. La cocultura de varios tipos de células es también una tecnología clave para imitar eficazmente el entorno in vivo18. El sistema CMS puede generar fácilmente esferoides de monocultivo, así como esferoides de cocultura de varios tipos de estructura (por ejemplo, concéntrico, janus y sándwich). El sistema CMS se puede utilizar no sólo en estudios simples de esferoides, sino también en estudios de organoides 3D, para considerar las estructuras de órganos humanos.

<table><tbody><tr><td>Impresora 3D</td><td>Cubicon</td><td>3DP-210F</td><td></td></tr><tr><td>Células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (hASC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Contenía un 1% de medio completado y tampón</td></tr><tr><td>CellTracker Verde CMFDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>CellTracker Rojo CMTPX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34552</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Grabador rotativo de control numérico por computadora (CNC)</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Motor DC</td><td>Nurielectricity Inc.</td><td>MB-4385E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Medio de Dulbecco modificado (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Contenía el 10% de</td></tr><tr><td>fibroblastos pulmonares humanos medios completos (MRC-5)</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Inventor 2019</td><td>Programa de diseño asistido por ordenador</td><td>Autodesk</td><td></td></tr><tr><td>3D Placa de Petri y Phi; 150 mm</td><td>JetBiofill</td><td>CAD010150</td> Limpiador de plasma <td>con tratamiento superficial</td></tr><tr><td></td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11/6/9003</td><td>Diluir con solución salina tamponada con fosfato al 4% (p/v)</td></tr><tr><td>Policarbonato (PC)</td><td>Acrílico</td><td>AC15PC</td><td>200 x 200 x 15 mm</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr></tbody></table>

plataforma lab-on-a-cd para generar esferoides tridimensionales multicelulares

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Un cultivo de células esferoides tridimensionales puede obtener resultados más útiles en experimentos celulares porque puede simular mejor los microambientes celulares del cuerpo vivo que el cultivo celular bidimensional. En este estudio, fabricamos una plataforma eléctrica de laboratorio en un CD (disco compacto), llamada sistema de cultivo de esferoides microfluídicos centrífugos (CMS), para crear esferoides celulares tridimensionales (3D) que implementan una alta fuerza centrífuga. Este dispositivo puede variar las velocidades de rotación para generar condiciones de gravedad de 1 x g a 521 x g. El sistema CMS tiene 6 cm de diámetro, tiene cien micropocillos de 400 m y se realiza mediante moldeo con polidimetilsiloxano en un molde de policarbonato prefabricado por una máquina de control numérico por ordenador. Una pared de barrera en la entrada del canal del sistema CMS utiliza fuerza centrífuga para esparcir las células uniformemente dentro del chip. Al final del canal, hay una región de diapositivas que permite que las celdas entren en los micropozos. Como demostración, los esferoides fueron generados por el monocultivo y la cocultura de células madre derivadas de adiposos humanos y fibroblastos pulmonares humanos en condiciones de alta gravedad utilizando el sistema. El sistema CMS utilizó un esquema de operación simple para producir esferoides de cocultura de varias estructuras de concéntrico, Janus y sándwich. El sistema CMS será útil en estudios de biología celular e ingeniería de tejidos que requieren esferoides y cultivo organoide de tipos de células simples o múltiples.

El chip de cultivo CMS de 6 cm de diámetro(Figura 2)se hizo con éxito siguiendo el protocolo anterior. En primer lugar, el chip se hizo por separado de una capa superior y una capa inferior y luego unido por unión por plasma. Los esferoides resultantes se pueden recoger fácilmente desplazándose el chip. El canal del chip de cultivo CMS comprende un puerto de entrada y regiones centrales, de diapositivas y de micropozos(Figura 3). Las soluciones celular, media y ...

Presentamos un dispositivo microfluídico centrífugo motorizado que puede cultivar esferoides celulares. Usando este dispositivo, los esferoides de uno o varios tipos de células podrían ser fácilmente cocultivos bajo condiciones de alta gravedad.

Plataforma Lab-on-a-CD para generar esferoides tridimensionales multicelulares

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Esta técnica se puede utilizar para generar esferoides celulares a partir de tipos de células individuales y múltiples utilizando una plataforma de laboratorio en un CD, un sistema pionero para la rápida generación de esferoides. La técnica utiliza la fuerza centrífuga para depositar células en micropocillos designados, permitiendo la euforia secuencial de múltiples tipos de células para la producción de diversos esferoides. Para la fabricación de virutas de cultivo CMS, primero cree moldes de policarbonato para las capas superior e inferior del chip de cultivo mediante mecanizado de control numérico por computadora.A continuación, mezcle la base de PDMS y el agente de curado PDMS en una proporción de 10 a una durante cinco minutos antes de colocar la mezcla en un desecador durante una hora para eliminar las burbujas de aire. Vierta la mezcla de PDMS desgasificación en los moldes de viruta de cultivo CMS y coloque los moldes en el desecador durante una hora más para eliminar cualquier burbuja de aire. Al final de la segunda desgasificación, curar la mezcla en una cámara de calor a 80 grados Celsius durante dos horas antes de colocar las virutas en una limpiadora de plasma aspirada con las superficies a unir hacia arriba.Exponga los chips de cultivo al plasma asistido por aire a una potencia de 18 vatios durante 30 segundos, y unir las dos capas del chip en la cámara de calor a 80 grados centígrados durante 30 minutos para aumentar la resistencia a la adhesión. A continuación, esterilizar el chip de cultivo CMS en un autoclave a 121 grados Celsius durante 15 minutos. Para preparar las células para la formación de esferoides, descongele un vial de un mililitro que contenga de cinco a 10 veces 10 a las cinco células de interés en un baño de agua de 36,5 grados Centígrados durante dos minutos antes de agregar un mililitro de DMEM a las células con una mezcla suave.A continuación, agregue las células a un plato petri de 150 milímetros de diámetro que contenga 15 mililitros de 36,5 grados de medio centígrado, y coloque el plato en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace el sobrenadante con 15 mililitros de DMEM fresco, y devuelva las células a la incubadora. Para separar las células, crea el cultivo con cuatro mililitros de trippsina durante cuatro minutos a 36,5 grados Centígrados y un 5% de dióxido de carbono, deteniendo la reacción con medio fresco cuando las células se han levantado de la parte inferior del plato.Para etiquetar las células, caliente un tinte de fluorescencia celular adecuado a temperatura ambiente antes de agregar 20 microlitros de sulfóxido de dimetil anhidro al vial para obtener una solución de un milimolar. Diluir la fluorescencia a una concentración de trabajo final de un micromolar en DMEM, y añadir el tinte a la suspensión celular de interés con una mezcla suave. Luego coloque las células en la incubadora de cultivo celular durante 20 minutos.Para la formación de esferoides monocultivos, primero agregue 2,5 mililitros de solución 4%Plurónica F-127 al orificio de entrada del chip de cultivo CMS mientras gira el chip a 500 a 1.000 rotaciones por minuto. Cuando se haya añadido toda la solución, gire el chip a 4.000 rotaciones por minuto durante tres minutos utilizando el sistema CMS. Al final de la rotación, incubar el chip de cultivo durante la noche a 36,5 grados centígrados a un 5% de dióxido de carbono.A la mañana siguiente, retire la solución Pluronic y lave el chip de cultivo con DMEM. Después de secar el chip durante 12 horas en un banco limpio, agregue 2,5 mililitros del medio al puerto de entrada y gire el chip a 4.000 rotaciones por minuto durante tres minutos. Al final de la rotación, sustituya 100 microlitros del medio en el puerto de entrada por 100 microlitros de la suspensión de celda preparada, mientras que el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto.Luego gire el chip a 3.000 rotaciones por minuto durante tres minutos durante tres minutos para atrapar las células en cada micropocillos por fuerza centrífuga antes de colocar el chip en la incubadora de cultivo celular durante tres días, actualizando el medio como se demuestra todos los días. Para la generación de cocultura esferoides concéntrica, agregue la primera población de células en 100 microlitros de medio al puerto de entrada del chip mientras el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto seguidas de tres minutos de rotación a 3.000 rotaciones por minuto. Al final de la rotación, agregue 100 microlitros de la segunda población de células mientras el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto, y gire el chip a 3.000 rotaciones por minuto durante otros tres minutos.Cuando se hayan inyectado ambos volúmenes de células, coloque el chip en la incubadora de cultivo celular en 1.000 a 2.000 rotaciones por minuto durante 24 horas. Para la formación de esferoides Janus, agregue 100 microlitros de la primera población de células mientras el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto seguido de tres minutos a 3.000 rotaciones por minuto. Al final de la rotación, coloque el chip en la incubadora de cultivo celular para la rotación en 1.000 a 2.000 rotaciones por minuto durante tres horas.Al final de la incubación, agregue 100 microlitros de la segunda población de células mientras que el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto antes de girar el chip a 3.000 rotaciones por minuto durante tres minutos. Luego coloque las células en la incubadora de cultivo celular en 1.000 a 2.000 rotaciones por minuto durante 24 horas. Para la formación de esferoides sándwich, primero agregue 100 microlitros de la primera población celular mientras el chip está girando a 500 a 1.000 rotaciones por minuto seguido de tres minutos de rotación a 3.000 rotaciones por minuto.Al final de la rotación, coloque el chip en un rotador en la incubadora de cultivo celular durante dos horas a 1.000 a 2.000 rotaciones por minuto antes de agregar 100 microlitros de la segunda población de células mientras el chip está girando a 500 a 1.000 rotaciones por minuto. Gire el chip a 3.000 RPM durante tres minutos y vuelva a colocar el chip en la incubadora para una incubación de tres horas con rotación. Luego agregue 100 microlitros adicionales de la primera población celular mientras que el chip gira a 500 a 1.000 rotaciones por minuto, y gire y haga cultivo de las células como se acaba de demostrar durante 12 horas.Siguiendo el protocolo como se ha demostrado, un chip de cultivo CMS de seis centímetros de diámetro se puede fabricar con éxito. El canal del chip de cultivo CMS comprende un puerto de entrada y regiones centrales, de diapositivas y de micropocillos. Las imágenes de lapso de tiempo de dos tipos de cultivo celular tomadas a 2.000 rotaciones por minuto durante las primeras 24 horas de cultivo dentro de chips CMS individuales, como se ha demostrado, muestran la formación exitosa de esferoides.Las imágenes de los micropocillos después de tres días de cultivo muestran que los esferoides demuestran una excelente uniformidad y esfericidad. También se pueden generar esferoides cocultivos con estructuras conenestricales, Janus y sándwiches. Además, los cultivos celulares expuestos a alta gravedad durante siete días, seguidos de manchas vivas/muertas, demuestran que la mayoría de las células sobreviven al cultivo a largo plazo dentro de los chips.Las capas superior e inferior del chip de cultivo CMS deben alinearse cuidadosamente cuando están unidas, de lo contrario el número de células en cada micropozo puede no ser igual. Este estudio puede reducir la barrera de entrada para la investigación del esferoide de cocultura y puede ser ampliamente utilizado en estudios de cocultura, por ejemplo, para la detección de nuevos fármacos de interés.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe un método simple, rápido de generación de 3D, como los tejidos esferoides y su potencial aplicación para cuantificar las diferencias en las interacciones célula-célula.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Los esferoides son un tipo de modelo de cultivo celular en 3D que se utiliza para representar con mayor precisión el entorno de una célula en comparación con los modelos monocapa de cultivo celular en 2D. En el protocolo de ejemplo, veremos a los científicos generar esferoides a partir de una línea celular de cáncer colorrectal y aplicar imágenes de células vivas para rastrear el crecimiento de los esferoides.

Generación de esferoides a partir de líneas celulares: un método de cultivo celular tridimensional (3D)

Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Aquí, describimos la producción a gran escala de esferoides estromales /células madre (ASC) derivados de tejido adiposo utilizando un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Estos esferoides ASC se pueden utilizar como bloques de construcción para enfoques de bioimpresión 3D.

Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D

Este protocolo detalla un método para la producción de tres tipos diferentes de esferoides de una manera que los hace adecuados para la detección y el análisis de alto contenido a gran escala. Además, se presentan ejemplos que muestran cómo se pueden analizar a nivel de células esferoides e individuales.

Un método robusto para la producción a gran escala de esferoides para aplicaciones de detección y análisis de alto contenido

El presente protocolo describe una técnica para producir esferoides tisulares a gran escala de forma rentable utilizando un dispositivo similar a un sello impreso en 3D.

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