Name: Sistema Centrífugo de Contraflujo Automatizado para Procesamiento celular a pequeña escala (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Aprenda a automatizar el intercambio de tampón y la concentración celular a pequeña escala mediante centrifugación de contraflujo. Este protocolo mejora la recuperación y eficiencia en la fabricación celular.

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Este trabajo cuenta con el apoyo del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno Victoriano y el Bono tecnológico del Gobierno Victoriano proporcionado por el Departamento de Desarrollo Económico, Empleo, Transporte y Recursos. RL es el receptor de una Beca de Desarrollo Profesional del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica. AL es el ganador de un Premio de Posgrado de Australia.

1. Preparación de reactivos y células para el intercambio de tampón
<ol><li>Prepare los búferes (consulte Tabla de materiales)en una campana de flujo laminar de clase 2. Con una jeringa y un conjunto de agujas, retire 50 ml de solución salina de una bolsa salina de 500 ml. Reemplace esto con 50 ml de albúmina sérica humana (HSA) al 20% para hacer un 2% de HSA en solución salina, que servirá como tampón de lavado.</li>
	<li>Quite las celdas de los recipientes de cultivo y realice un recuento de celdas para determinar la cantidad y viabilidad de la celda inicial mediante la exclusión azul de trypan. Cargue las celdas en una bolsa de transferencia. NOTA: En este protocolo, las células Jurkat se cultivaban en RPMI y las MSC se cultivaban en DMEM:F12. Ambos medios se complementaron con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y una solución antibiótica-antimética al 1%. Las células se cultivaban a 37 oC con un 5% de CO2. Para los CPSC o células adherentes, agregue una enzima de digestión (por ejemplo, trippsina) en los vasos de cultivo para separar las células, y sople con medios de cultivo una vez que las células estén separadas. En este protocolo se utilizó una bolsa de transferencia porque las células se expandieron en recipientes de cultivo. Sin embargo, si las células se cultivan en una bolsa de cultivo celular, se puede conectar directamente al kit de un solo uso a través de soldadura de tubo estéril. En este protocolo, se utilizaron 3 x 107 células Jurkat o 1 x 107 MSC para cada ejecución, donde las celdas se suspendieron en 40 ml de medios de cultivo.<ol>
<li>Cargue las células en una bolsa de transferencia (consulte Tabla de materiales)utilizando una jeringa y un conjunto de agujas si hay un soldador de tubo estéril disponible para conectar la bolsa de transferencia al kit de procesamiento de un solo uso.</li>
		<li>Alternativamente, utilice un par de tijeras autoclavedas para cortar el tubo de conexión con alrededor de 10 cm restantes unidos a la bolsa de transferencia y agregue un conector Luer hembra al extremo del tubo. Utilice una jeringa para aspirar células y medios y, a continuación, conecte la jeringa al conector Luer y cargue las células a la bolsa de transferencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conecte la bolsa que contiene las células, la bolsa tampón de lavado que contiene 500 ml de tampón de lavado preparado en el paso 1.1, la bolsa de desecho y la jeringa de recogida al kit de un solo uso(Figura 1B). NOTA: La posición de conexión de cada bolsa depende de la configuración del programa. En este protocolo, conectamos la bolsa de residuos en la posición A, el tampón de lavado en la posición B, la bolsa de celda en las posiciones D y F, y la jeringa de recogida en la posición H(Figura 1C).</li>
</ol>2. Programa para el protocolo automatizado de intercambio de búferes
<ol><li>Abra la interfaz gráfica de usuario (GUI) del dispositivo y pulse el botón "START" en un ordenador portátil o tableta. A continuación, "Abrir" un protocolo existente o pulse "Nuevo" para crear uno nuevo.</li>
	<li>Utilice el botón"Adelante"y"Atrás"para navegar por cada paso, seleccionar las válvulas que se abrirán/cerrarán, la velocidad centrífuga, la velocidad de la bomba, la dirección de la bomba y los disparadores de acción. La configuración de cada paso se resume en la Tabla 1. A continuación, guarde el protocolo.</li>
</ol>3. Configuración de la máquina
<ol><li>Coloque el kit de procesamiento de un solo uso en la máquina y cuelgue las bolsas conectadas en consecuencia. Pulse el botón rojo "Stop/Reset"para restablecer todas las válvulas en la posición cerrada predeterminada. NOTA: La máquina realizará una prueba cuando la puerta esté cerrada para asegurarse de que el kit se ha colocado correctamente y de que todas las válvulas funcionan correctamente.</li>
	<li>Conecte la GUI al dispositivo de procesamiento y pulse el botón"Conectar". A continuación, descargue el programa guardado. Cuando se ilumina el botón verde"Reproducir",indica que el protocolo está listo para iniciarse.</li>
	<li>Abra las abrazaderas manuales para el tubo de la bolsa de transferencia. NOTA: Si el operador olvida abrir las abrazaderas, el dispositivo se detendrá y aparecerá la advertencia del sensor de presión. Pulse el botón"Detener"para reiniciar el dispositivo y abrir las abrazaderas para volver a arrancar.</li>
</ol>4. Intercambio automatizado de búferes
<ol><li>Pulse "Start" para iniciar el programa de intercambio de búferes. NOTA: Para alterar manualmente el proceso automatizado, pulse el botón"Siguiente"para pasar al siguiente paso antes de alcanzar el "Trigger" o pulse "Pause" para poner el proceso en espera. Esto recirculará las células a través del kit manteniendo abiertas solo las válvulas J y K(Figura 1C).</li>
	<li>Al final del paso de automatización 6(Tabla 1), el proceso se detendrá cuando el aire en la bolsa ahora vaciada active el sensor de burbujas. Pulse "Next" para mover el proceso al siguiente paso si la bolsa está realmente vacía, o pulse "Pause" para reanudar el procesamiento si el sensor fue activado por una burbuja en la línea.</li>
</ol>5. Recolectar y tomar muestras de las células
<ol><li>Cuando finalice el proceso automatizado, cierre todas las abrazaderas de tubo. Abra la puerta y saque el kit de un solo uso del dispositivo. Desconecte la jeringa para recoger las células para los procesos posteriores. Tome una muestra de las celdas recopiladas para una comprobación de recuento y viabilidad de celdas (consulte el paso 6.2).</li>
</ol>6. Validación del proceso
<ol><li>Realice experimentos de control mediante un protocolo de intercambio de búfer manual.<ol>
<li>Suspensión de células centrífugas a 200 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 30 ml de tampón de lavado celular. Centrifugar de nuevo la suspensión celular a 200 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 10 ml de tampón de lavado celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realice el recuento de celdas a través del ensayo de exclusión azul trypan para evaluar la viabilidad celular mediante un contador de celdas automatizado.</li>
	<li>Realice un ensayo MTS para cuantificar la proliferación celular a 2, 24 y 48 h. NOTA: El ensayo MTS se realizó en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una alícuota de 100 ol de medios de cultivo celular (que contiene 10.000 células Jurkat o 1.500) por pozo se platearon después del proceso de intercambio de búferes. En cada punto de tiempo, se añadieron 20 l de reactivos MTS en cada poca y se incubaron durante 2 h a 37 oC. La absorbancia se evaluó a 490 nm utilizando un lector de placas.</li>
	<li>Realice ensayos funcionales para comparar el impacto del proceso automatizado con el proceso manual en las células Jurkat y la función MSC.<ol>
<li>Cultivo de células Jurkat en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 106 células/ml estimulada con 50 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) y 1 g/ml de ionomicina (cóctel de estimulación celular) en medios DMEM:F12 que contienen 10% suero bovino fetal (FBS) durante 24 h. Incubar las células a 37oC con 5%co2.</li>
		<li>Mida la producción de interleucina-2 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando el ensayo ELISA basado en perlas (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Cultivo MSCs en una placa de 12 pocillos a la densidad de 10.000 celdas/cm2 en 1 mL de medios DMEM:F12 que contienen 10% FBS complementado con interferón 50 unidades/ml durante 48 h. Recoger supernadante para el ensayo de concentración de kynurenina para medir la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) actividad enzimática de mSCs como se describió anteriormente21.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+1%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li>
<li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factories+of+the+future%3A+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li>
<li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li>
<li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translation+of+cell-based+therapies%3A+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li>
<li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li>
<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+2%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li>
<li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li>
<li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation%3A+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li>
<li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stromal+Cells%3A+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+%28CAR+T-Cells%29+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152(2018).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li>
<li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+automation+in+process+development%2C+manufacture+of+cell%2C+gene-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li>
<li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li>
<li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+%28CFCL%2FCCE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li>
<li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+%28Elutra%E2%84%A2%29+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+%28DC%29+therapy%3A+Clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li>
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<li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li>
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</ol>

SW, IF y DJ son COO, CTO y CEO de Scinogy Pty. El acceso al dispositivo CFC también fue proporcionado por Scinogy.

El protocolo de intercambio de búfer automatizado descrito es simple y fácil de usar. Sin embargo, hay algunos pasos clave en este protocolo que son críticos y requieren una atención particular. En nuestra experiencia, al procesar celdas más grandes como los MSC (diámetro medio de 10–15 m) cada ejecución debe incluir al menos 1 x 107 celdas para lograr una recuperación celular óptima(Figura 4B). El procesamiento de células más pequeñas, como las células Jurkat (pr...

El panorama de la medicina moderna se ha transformado rápidamente a través de los recientes desarrollos en terapias genéticas y basadas en células (GCT). Como uno de los campos de más rápido crecimiento en la investigación traslacional, el sector GCT también se enfrenta a desafíos únicos y sin precedentes. Además de los resultados clínicos sólidos, los procesos de fabricación eficientes y rentables son esenciales para el éxito comercial de GCT, que es particularmente difícil de lograr en la fabricación a pequeña escala1. El costo del tiempo, la mano de obra y las garantías de calidad se magnifican cuando cada lote de células solo produce unas pocas dosis para un paciente en lugar de cientos o miles. A diferencia de las terapias celulares alogénicas en las que los procesos de fabricación son más parecidos a la producción de anticuerpos y proteínas recombinantes, las terapias celulares autólogas se producen típicamente como operaciones a pequeña escala1. Como fenómeno relativamente nuevo en la fabricación biofarmacéutica2, las opciones para el procesamiento celular a pequeña escala son actualmente bastante limitadas.
El intercambio de búferes es esencial para la fabricación celular. Es uno de los procesos posteriores donde las células se eliminan de los medios de cultivo y se concentran para la criopreservación o la infusión. Actualmente, la fabricación de células a pequeña escala a menudo aplica procesos similares a los del entorno de investigación académica y se basa en salas limpias especializadas para mantener la esterilidad3. Los procesos manuales aguas abajo a menudo utilizan centrífugas de sobremesa para peletizar y resuspender células para la reducción de volumen y el intercambio de búferes. Estos procesos abiertos son costosos (es decir, trabajo y mantenimiento de salas limpias) y tienen una capacidad de fabricación limitada, que no son ideales para la producción comercial2,3.
La implementación de la automatización se ha propuesto como una solución para mejorar la eficiencia de fabricación y lograr producciones a escala comercial2. La esterilidad no se puede lograr en productos a base de células a través de métodos tradicionales utilizados para los productos biológicos, como la irradiación gamma o la filtración terminal. En su lugar, se despliega un sistema cerrado automatizado para reducir los riesgos de contaminación y los operadores que dependen de salas limpias para mantener la esterilidad4. La automatización de procesos también aborda el problema de la escalabilidad al tener varios sistemas ejecutándose en paralelo (escalado horizontal) o aumentando la capacidad de procesamiento de un dispositivo individual (escalado vertical), lo que a su vez minimiza la variabilidad entre los operadores. Además, el análisis de modelado de costes de terapias autólogas sugiere que la automatización puede reducir el coste de fabricaciónde 5,6. Sin embargo, no se encontró ningún beneficio de costo en un ensayo clínico autólogo de células madre donde se utilizó una plataforma de fabricación automatizada7,lo que sugiere que el costo beneficio de la automatización puede depender del proceso de fabricación individual.
Existen diferentes estrategias en las que la automatización se puede introducir en un proceso de fabricación existente. Esto se puede lograr mediante la implementación de una plataforma totalmente integrada o una cadena de procesamiento modular. Hay varias plataformas totalmente integradas disponibles comercialmente para la fabricación de células autólogas, como CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) y Quantum (Terumo BCT). Estas plataformas integradas, que a menudo se describen como "GMP-in-a-box", tienen bajas demandas de infraestructura y son fáciles de operar. Sin embargo, la capacidad de fabricación de una configuración totalmente integrada puede estar restringida por la incubadora conectada al sistema. Por ejemplo, la capacidad de cultivo de Prodigy se limita a su cámarade 400 ml 8 y el cartucho Quantum tiene una superficie limitante establecida en 2,1 m2 (equivalente a 120 matraces T175)7, que puede no ser suficiente para pacientes que requieren dosis celulares más altas9,10. Además, Prodigy y Quantum tienen un atributo común que limita su uso: la unidad operativa está ocupada por un solo lote de celdas durante todo el período de expansión de la célula, limitando así el número de lotes que pueden ser fabricados por cada unidad11. El enfoque modular de la automatización es crear una cadena de fabricación con múltiples unidades modulares que simula el proceso de fabricación comercial12,13. Este enfoque, que separa el dispositivo de cultivo del dispositivo de lavado celular, puede maximizar así la eficiencia de fabricación. Un dispositivo de procesamiento ideal sería uno que sea adaptable y escalable a las necesidades de fabricación12.
La tecnología de centrifugación de contraflujo (CFC), que se remonta a la década de 1970, ha tenido una larga historia en el procesamiento celular14. Logra la concentración y separación celular equilibrando la fuerza centrífuga con una fuerza de contraflujo. Típicamente, una suspensión celular entra desde el extremo estrecho de una cámara celular bajo un caudal constante mientras está sujeta a una fuerza centrífuga(Figura 1A). El flujo del fluido se ejerce en la dirección opuesta a la fuerza centrífuga. Esto se conoce como la fuerza de contraflujo, que forma un gradiente dentro de la cámara celular. La fuerza de contraflujo disminuye a medida que la cámara celular se ensancha lejos de la punta de la cámara celular en forma de cono. Las células con mayor densidad y diámetro más grande tienen una mayor tasa de sedimentación, y por lo tanto alcanzan el equilibrio de fuerza hacia la punta de la cámara celular en forma de cono. Las partículas más pequeñas pueden alcanzar el equilibrio hacia la base de la cámara o ser demasiado pequeñas para ser retenidas en la cámara y serán lavadas. La tecnología CFC es principalmente conocida por su aplicación en el procesamiento de productos de aféresis sanguínea, tales como el isolating monocitos para terapias de células dendríticas15,16. En términos de intercambio de búferes, la tecnología CFC sólo se ha aplicado en la fabricación a gran escala17 y todavía no se ha utilizado para la fabricación a menor escala de terapias celulares autólogas.
Para hacer frente a la necesidad de un dispositivo adecuado para la fabricación de células a pequeña escala, se desarrolló recientemente un dispositivo CFC automatizado (Ver Tabla de Materiales),18. El dispositivo automatizado de procesamiento de celdas utiliza la tecnología de centrifugación de contraflujo para eliminar los desechos celulares y facilitar el intercambio de búferes. El dispositivo realiza el intercambio de búferes con un kit de un solo uso que se puede conectar estérilmente a una bolsa de transferencia de celda, lo que permite que las células se procesen dentro de un sistema estéril y cerrado. Aquí, investigamos el uso de un dispositivo centrífugo de contraflujo para realizar el intercambio de búferes en cultivos celulares de mamíferos en protocolos automatizados. En este estudio, probamos el protocolo de intercambio de búferes utilizando células Jurkat y células estromales mesenquimales (MSC) para modelar tipos de células no adherentes y adherentes, respectivamente. Las células de Jurkat son células T inmortalizadas a menudo utilizadas para el estudio de la leucemia aguda de células T19,20. Los MSC son células madre adultas que se han estudiado en ensayos clínicos en humanos para una amplia gama de enfermedades9.

<table><tbody><tr><td>20 ml Jeringas Luer lock</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>20% Albúmina sérica humana (HSA)</td><td>CSL Behring</td><td>AUST R 46283</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimetilamino)benzaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156477-25g</td><td></td></tr><tr><td>500ml Bolsa de solución salina intravenosa</td><td>Fresenius Kabi</td><td>K690521</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Thermo Fisher Scientific 15240112</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado (Countess)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de cámara de recuento de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de estimulación celular (500x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4970-93</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas de transferencia de células</td><td>Terumo</td><td>T1BBT060CBB</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>DMEM: F12 medios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Lector de placas</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A Suero</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Kit de interleucina humana 2 (IL2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>Al221C</td><td></td></tr><tr><td>Accesorios Luer (hembra)</td><td>CPC</td><td>LF41</td><td></td></tr><tr><td>PC portátil o tableta PC</td><td>ASUS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas (SpectraMax i3)</td><td>Dispositivo molecular</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano IFN-&gamma;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Rotea dispositivo de procesamiento de células centrífugas de contraflujo</td><td>Scinogy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de procesamiento de un solo uso Rotea</td><td>Scinogy N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>ProSciTech</td><td>420SS</td><td></td></tr><tr><td>Tricloroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399-250g</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul de tripano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de digestión de tripsina (Enzima TrypLE Express)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema centrífugo de contraflujo automatizado para procesamiento celular a pequeña escala

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

La comercialización exitosa de terapias basadas en genes y células requiere procesos de fabricación rentables y escalables. El intercambio de búferes y la concentración del producto son componentes esenciales para la mayoría de los procesos de fabricación. Sin embargo, en las primeras etapas del desarrollo del producto, estos pasos a menudo se realizan manualmente. La centrifugación sin salida manual para el intercambio de búferes es laboriosa, costosa y no escalable. Un sistema automatizado cerrado puede eliminar eficazmente este paso laborioso, pero la implementación puede ser difícil. Aquí, describimos un dispositivo de procesamiento celular recientemente desarrollado que es adecuado para el procesamiento de células a pequeña y mediana escala y tiene como objetivo cerrar la brecha entre el procesamiento manual y la automatización a gran escala. Este protocolo se puede aplicar fácilmente a varios tipos y procesos de células modificando el caudal y la velocidad de centrifugación. Nuestro protocolo demostró una alta recuperación de células con tiempos de procesamiento más cortos en comparación con el proceso manual. Las células recuperadas del proceso automatizado también mantuvieron sus tasas de proliferación. El dispositivo se puede aplicar como un componente modular en un proceso de fabricación cerrado para adaptarse a pasos como el intercambio de búferes, la formulación de células y la criopreservación.

En este protocolo, utilizamos células Jurkat y MSC como ejemplos representativos para demostrar el proceso automatizado de intercambio de búferes. Durante el proceso, las células y los MC de Jurkat compartieron los mismos pasos de procesamiento con diferencias en la fuerza centrífuga y la velocidad de la bomba que controlan el caudal (Tabla 1). La Figura 2 muestra imágenes representativas capturadas por la cámara de cómo puede aparecer el lecho celular fluidizado durante el ...

La automatización es clave para aumentar el escalado y la gestión de costos en la fabricación de células. Este manuscrito describe el uso de un dispositivo de procesamiento de células centrífugas de contraflujo para automatizar los pasos de intercambio de búferes y concentración celular para el bioprocesamiento a pequeña escala.

Sistema Centrífugo de Contraflujo Automatizado para Procesamiento celular a pequeña escala

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Este protocolo proporciona una solución para el intercambio automatizado cerrado de búferes y la concentración para la fabricación de células a pequeña escala. Es importante destacar que el intercambio de búferes es capaz de realizarse con una alta recuperación y una entrega de un volumen muy pequeño de producto concentrado. Los nuevos usuarios pueden tener dificultades para seguir todos los pasos de automatización.Practicar la programación de estos pasos y realizar ejecuciones de prueba con el medio son buenas maneras de familiarizarse con el dispositivo. Antes de comenzar el intercambio de tampón, en un cabezal de flujo laminar de clase dos, utilice una jeringa y un conjunto de agujas para extraer 50 mililitros de solución salina de una bolsa salina de 500 mililitros. Sustituya este volumen por 50 mililitros de albúmina sérica 20% humana, y recoja las células de interés de sus recipientes de cultivo.Después del conteo, utilice la jeringa para cargar las células en una bolsa de transferencia y utilice el bloqueo Luer para conectar la bolsa de transferencia a un kit de procesamiento de un solo uso. A continuación, conecte la bolsa de tampón de lavado previamente preparada al kit de procesamiento de un solo uso. Para configurar un intercambio de búfer automatizado, abra la interfaz gráfica de usuario del dispositivo y haga clic en el botón de inicio.Haga clic en nuevo para crear un nuevo protocolo y haga clic en el control para seleccionar las válvulas que se abrirán y cerrarán, las velocidades centrífugas y de la bomba, la dirección de la bomba y los disparadores de acción. Cuando se hayan establecido todos los parámetros, haga clic en Guardar. Cuelgue las bolsas apropiadas conectadas en el dispositivo y coloque el kit de procesamiento de un solo uso en la máquina.A continuación, haga clic en el botón de conexión y descargue el programa guardado. Cuando se enciende el botón de reproducción, el protocolo está listo para iniciarse. Para realizar el intercambio automatizado de búferes, abra las abrazaderas manuales para el tubo de la bolsa de transferencia y haga clic en Iniciar para iniciar el programa de intercambio de búferes.Al final del paso seis de automatización, el proceso se detendrá debido a la activación del sensor de burbujas por el aire en la bolsa ahora vacía. Si la bolsa está realmente vacía, presione a continuación para mover el proceso al siguiente paso. Cuando finalice el proceso automatizado, cierre todas las abrazaderas de tubo y abra la puerta del dispositivo.A continuación, retire el kit de un solo uso del dispositivo y desconecte la jeringa para permitir que las células se recojan para su posterior análisis. Típicamente, el lecho celular fluidizado aparecerá como se representa en esta imagen con las celdas que se acumulan en el medio y hacia la parte delantera del cono, un pequeño espacio en la punta de la cámara en el que las células no se acumulan, y una abertura visible dentro de la entrada de carga de la celda. El lecho celular fluidizado se puede comprimir al introducir un nuevo tampón que se encuentra en una viscosidad o densidad diferente.Se puede aplicar un alto caudal para seleccionar celdas vivas, ya que las células muertas son más pequeñas y ligeras y se pueden forzar a salir de la cámara aumentando el caudal. El proceso automatizado del tiempo de procesamiento de intercambio de búfer es más corto que el del proceso de intercambio de búfer manual. En este análisis, las tasas de recuperación entre el manual y los procesos automatizados fueron similares para ambos tipos de células probadas, y la viabilidad celular no se vio afectada por ninguno de los procesos.Las células recuperadas demostraron tasas de proliferación similares, capacidades para producir citoquinas e ideo-actividades, independientemente del tipo de procesamiento. Es importante recordar que este protocolo sirve sólo como una guía, y por lo tanto los usuarios necesitan programar el caudal y la velocidad de centrifugación de acuerdo con su tipo de celda y búfer. El intercambio de búferes es un paso intermedio en la fabricación celular que puede seguir la expansión del cultivo celular o la criopreservación y formulación.El objetivo es desarrollar formas de encerrar todo el proceso. La centrifugación de contraflujo es una plataforma muy versátil. Estudios futuros explorarán aplicaciones en la selección de células, como la eliminación de células muertas y el aislamiento de células mononucleosas de un producto de chorisis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Hemos desarrollado un cultivo de células automatizado y la plataforma de interrogación para experimentos de estimulación de células micro-escala. La plataforma ofrece un control sencillo, versátil y precisa en el cultivo y estimular las pequeñas poblaciones de células, y la recuperación de lisados ​​de análisis moleculares. La plataforma se adapta bien a los estudios que utilizan las células preciosos y / o reactivos.

Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular

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Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

Aislamiento en un solo paso de vesículas extracelulares a partir de muestras de gran volumen con un dispositivo microfluídico A4F bifurcado

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Aprenda a automatizar el intercambio de tampón y la concentración celular a pequeña escala mediante centrifugación de contraflujo. Este protocolo mejora la recuperación y eficiencia en la fabricación celular.

Sistema Centrífugo de Contraflujo Automatizado para Procesamiento celular a pequeña escala

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