Name: Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprende a aislar y cultivar neuronas motoras oculomotoras, trocleares y espinales de embriones de ratón transgénico Isl1mn:GFP. Este método permite estudiar la vulnerabilidad selectiva en enfermedades como la ELA.

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Agradecemos a Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, EE. UU.) la instrucción en técnicas de disección SMN; el Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, el Immunology Division Flow Cytometry Facility of Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core, y Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neuron; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, miembros adicionales del laboratorio engle y miembros del consorcio Project ALS para asistencia técnica y discusión reflexiva. Este estudio fue apoyado por el Proyecto ELA. Además, R.F. fue financiado por la Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad y NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. contó con el apoyo del programa de capacitación NIH/NEI en las Bases Moleculares de Enfermedades Oculares (5T32EY007145-16) a través del Instituto de Investigación Ocular schepens y el Programa de Capacitación en Neurología del Desarrollo (5T32NS007473-19) a través del Hospital Infantil de Boston; M.C.W contó con el apoyo de NEI (5K08EY027850) y Children's Hospital Ofthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); y E.C.E. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

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</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Históricamente, los estudios in vitro de neuronas motoras CN3 y/o CN4 han recurrido a cultivos heterogéneos como disociados17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26</su...

El cultivo de las neuronas motoras primarias es una poderosa herramienta que permite el estudio del desarrollo neuronal, función, y la susceptibilidad a los estresores exógenos. Los cultivos de neuronas motoras son particularmente útiles para el estudio de enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)1,2, cuyos mecanismos de enfermedad se entienden incompletamente. Curiosamente, a pesar de la muerte celular significativa de las neuronas motoras espinales (SMN) tanto en pacientes con ELA como en ratones modelo DE ELA, la muerte celular en neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4s) son relativamente escasas1,3,4,5,6,7,8,9. Por lo tanto, los análisis comparativos de cultivos puros de CN3s/CN4s y SMN podrían proporcionar pistas importantes sobre los mecanismos subyacentes a la vulnerabilidad relativa. Desafortunadamente, una barrera importante a tales análisis ha sido la incapacidad para cultivar cultivos purificados de estas neuronas motoras.
Se han descrito muchos protocolos para la purificación de las SMN a partir de modelos animales. La mayoría de estos protocolos utilizan centrifugación de gradiente de densidad10,11,12 y/o p75NTR-técnicas de panoramización de clasificación celular basadas en anticuerpos13,14,15,16. La centrifugación de gradiente de densidad explota el mayor tamaño de las SMN en relación con otras células espinales, mientras que p75NTR es una proteína extracelular expresada exclusivamente por las SMN en la médula espinal. Casi 100% cultivos SMN puros han sido generados por uno o ambos de estos protocolos11,12,14. Sin embargo, estos protocolos no han tenido éxito en generar las culturas CN3/CN4 porque los CN3s/CN4 no expresan elNTRp75, y otros marcadores específicos CN3/CN4 no han sido identificados. También son más pequeños que los SMN y, por lo tanto, son más difíciles de aislar en función del tamaño. En cambio, los estudios in vitro de CN3s o CN4 se han basado endesvincular17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26, y la rebanada27,28 cultivos, que se componen de tipos de células heterogéneas, y no han existido protocolos para el aislamiento y cultura de los CN3 primarios o CN4.
Aquí, se describe un protocolo para la visualización, aislamiento, purificación y cultivo de CN3, CN4 y SMN del mismo día embrionario 11.5 (E11.5) IslMN:GFP ratones transgénicos29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etiqueta específicamente las neuronas motoras con un GFP farnesylated que se localiza en la membrana celular. Este protocolo permite la comparación de múltiples tipos de neuronas motoras con el fin de dilucidar los mecanismos patológicos en la enfermedad de las neuronas motoras.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugada cabra anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugada F(ab')2 cabra anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11072</td><td>1:400</td></tr><tr><td>B27 Suplemento (50x), sin suero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria llu SORP Citómetro de flujo</td><td>BD Bioscience</td><td>- </td><td>Este tiene 4 sistemas láser equipados con láseres de 405, 488, 594 y 640 nm.</td></tr><tr><td>BD Halcón 70&mu; m Filtros de celdas de nylon</td><td>CORNING</td><td>352350</td><td>Para filtrar las celdas disociantes antes de FACS.</td></tr><tr><td>Tubos de ensayo de fondo redondo BD Falcon con tapón a presión</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-207</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de cultivo celular, 96 pocillos, PS, fondo F (pozo de chimenea)</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>655090</td><td>Probamos varias placas de 96 pocillos y esta fue la mejor para el cultivo y los análisis después de ICC</td></tr><tr><td>Cubreobjetos circulares para microscopía</td><td>Karl Hecht & Asistente</td><td>1001/14</td><td>Utilizamos este cubreobjetos ya que el área era grande (diámetro: 14 mm).</td></tr><tr><td>CNTF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-272</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ciclopiazónico de Penicillium cyclopium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1530</td><td>CPA. Uno de los factores estresantes de la sala de emergencias.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-fenilinodol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas de acero inoxidable Tamaño de la punta 0,05 mm x 0,01 mm Biologie Tips</td><td>Roboz Instrumento quirúrgico</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25205</td><td></td></tr><tr><td>GDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-305</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E</td><td>BrainBits</td><td>HE</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E baja fluorescencia</td><td>BrainBits</td><td>HELF</td><td>La fluorescencia que dificulta la observación de las expresiones de GFP del embrión debe ser baja.</td></tr><tr><td>Suero de caballo, inactivado por calor, origen neozelandés</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Tocris Cookson</td><td>2845</td><td>Laminina de isobutilmetilxantina</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L15 mediano</td><td>Thermo Fisher Scientific 11415064</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tijeras de Disección</td><td>Roboz Instrumento Quirúrgico</td><td>RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cuchillo 4.75" 1.7 mm x 27 mm</td><td>hoja Roboz Instrumento Quirúrgico</td><td>RS-6272</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini Cuchara Perforada</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de ratón contra la clase neuronal III &beta;-tubulina (TUBB3)</td><td>BioLegend</td><td></td><td>801202 1:500, TUJ1</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia de células vivas Nikon Perfect Focus Eclipse Ti y software Elements</td><td>Nikon-Differential</td><td></td> <td>Interference Contrast Images e imágenes de inmunocitoquímica de los cultivos celulares se capturaron con estos equipos</td></tr><tr><td>Ácido nítrico 90%, fumante (ACS certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A202-212</td><td>Para enjuagar cubreobjetos</td></tr><tr><td>Microtubos Olympus de 1,7 mL, transparentes</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td>Estos son los tubos que describimos como "tubos de microcentrífuga de 1,7 mL" en el contexto.</td></tr><tr><td>Sistema de disociación de papaína</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LK003150</td><td>solución de papaína y solución inhibidor de alubumina-ovomucoide se preparan a partir de este kit.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly D-lisina (PDL)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de conejo contra Islet1</td><td>Abcam</td><td>ab109517</td><td>1:200</td></tr><tr><td>SMZ18 y microscopios estereoscópicos con zoom SMZ1500 con DS-Ri1 Se realizó una disección</td><td>Nikon</td><td></td> <td>y se capturaron imágenes de embriones y tejidos disecados bajo estos microscopios de fluorescencia.</td></tr><tr><td>Sylgard 170 Encapsulante de Silicona Negra - A+B Kit 0,9 kg</td><td>Dow Corning</td><td>1696157</td><td>Hacemos platos de disección con este kit.</td></tr><tr><td>Platos tratados con TC, 100 mm x 20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td>Hacemos platos de disección con este plato.</td></tr><tr><td>Pinza de vendaje Thum de 4,5" dentada de 2,2 mm de ancho de punta</td><td>Instrumento quirúrgico Roboz</td><td>Transductor RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>para LOGOQ e VET</td><td>GE Healthcare</td><td>L8-18i-RS</td><td>Para ultrasonido en ratones hembra</td></tr><tr><td>Ecógrafo veterinario</td><td>GE Healthcare</td><td>LOGOQ e VET</td><td>Para ultrasonido en ratones hembra</td></tr><tr><td>Zeiss LSM serie 700 Microscopio confocal de barrido láser y software Zen</td><td>Carl Zeiss</td><td>-</td><td>La imagen confocal del embrión fue capturada con estos equipos</td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de islmnprenatal :gfp ratones transgénicos

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Las neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4) exhiben una notable resistencia a enfermedades degenerativas de las neuronas motoras como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en comparación con las neuronas motoras espinales (SMN). La capacidad de aislar y cultivar CN3 de ratón primario, CN4 y SMN proporcionaría un enfoque para estudiar los mecanismos subyacentes a esta vulnerabilidad selectiva. Hasta la fecha, la mayoría de los protocolos utilizan cultivos celulares heterogéneos, que pueden confundir la interpretación de los resultados experimentales. Para minimizar los problemas asociados con las poblaciones de células mixtas, los cultivos puros son indispensables. Aquí, el primer protocolo describe en detalle cómo purificar y cultivar eficientemente CN3s/CN4s junto con contrapartes SMN de los mismos embriones utilizando embrionarios día 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgénicos embriones de ratón. El protocolo proporciona detalles sobre la disección y disociación tisular, el aislamiento celular basado en FACS y el cultivo in vitro de células de núcleos CN3/CN4 y SMN. Este protocolo añade un novedoso sistema de cultivo CN3/CN4 in vitro a los protocolos existentes y proporciona simultáneamente un cultivo SMN puro para la comparación de especies y edades. Los análisis centrados en las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras son factibles en este sistema de cultivo. Este protocolo permitirá investigar los mecanismos que definen el desarrollo de neuronas motoras, la vulnerabilidad selectiva y las enfermedades.

El objetivo de este protocolo era purificar y cultivar altamente tanto los CN3/CN4 primarios como los SMN a largo plazo para permitir análisis comparativos de los mecanismos subyacentes a los trastornos de las neuronas motoras (ver Figura 1 y Figura 2 para una visión general).
Una vez que las neuronas se aislaron y cultivaron con éxito, se obtuvieron cultivos primarios ...

Este trabajo presenta un protocolo para producir cultivos celulares homogéneos de neuronas motoras primarias oculomotoras, trocleas y espinales. Estos cultivos se pueden utilizar para análisis comparativos de las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras oculares y espinales.

Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Este es el primer protocolo para purificar y cultivar simultáneamente y eficientemente las neuronas oculares primarias y motoras espinales de ratones embrionarios. Permite el estudio de los mecanismos subyacentes a la enfermedad de las neuronas motoras. Este protocolo añade un nuevo componente de cultivo oculomotor in vitro a los sistemas existentes y proporciona especies puras y cultivos de neuronas motoras espinales coincidentes con la edad para su comparación.En la esclerosis lateral amiotrófica, las neuronas motoras espinales degeneran mientras que las neuronas oculomotoras se ahorran relativamente. Comparar estos cultivos podría proporcionar información sobre el mecanismo de la enfermedad y la terapia. Este método facilitará los estudios de los mecanismos subyacentes al desarrollo de las neuronas motoras, enfermedad, y la vulnerabilidad selectiva.Nuestro sistema de cultivo permite la caracterización de la morfología de las neuronas motoras, la biología molecular y la electrofisiología. Para los nuevos en esta técnica, recomendamos mucha práctica. La disección puede ser técnicamente difícil y se pueden requerir múltiples dissectores para obtener suficientes neuronas para el cultivo primario.Comience por cosechar embriones positivos islet1 EGF de un ratón embarazada aproximadamente 11,5 días después de la fertilización. Rocíe bien el abdomen con etanol y retire el útero con tijeras estériles de microdisección y fórceps para el pulgar. Lave brevemente el útero en PBS estéril.A continuación, transfiéralo a la placa de disección llena de PBS estéril preenfriado. Bajo la luz brillante del microscopio, retire cuidadosamente los embriones del útero usando tijeras de microdisección, fórceps de apósito para el pulgar y pinzas Dumont 5. A continuación, utilice una mini cuchara perforada Moria estéril para transferir cada embrión a un pozo separado de un plato de 24 pozos lleno de hibernación pre-enfriada E medio de baja fluorescencia complementado con 1X V27.Mientras mantiene la placa sobre hielo, transfiera un embrión a una placa de disección estéril y cúbrala completamente con la solución de sal equilibrada de Hank estéril helada o HBSS. Use pinzas para extraer la cara del embrión y la cola sin dañar el cerebro medio. A continuación, coloque el embrión propenso con las extremidades entrelazadas y la cola apuntando hacia la parte delantera del microscopio.Utilice pinzas para abrir el techo del cuarto ventrículo con el fin de generar una pequeña abertura. Utilice esta abertura para enganchar pinzas en el espacio creado entre el cuarto ventrículo y su techo. Diseccionar a lo largo de la superficie dorsal del embrión rostral a la corteza y lateral a la placa del suelo y la columna motora.A continuación, abra el tejido diseccionado de una manera de libro abierto para revelar los núcleos POSITIVOS de GFP CN3 y CN4. Separe cuidadosamente el cerebro medio ventral del embrión y retire el tejido meningeal con pinzas y un cuchillo de microdisección. Diseccionar los núcleos bilaterales positivos de GFP CN3 y CN4 lejos de la placa del suelo y otros tejidos circundantes positivos de GFP teniendo cuidado de evitar tocar o dañar las neuronas.Si recoge núcleos CN3 y CN4 separados, corte a lo largo del cerebro medio de estos dos núcleos y utilice una pipeta P1000 para recoger el tejido ventral de cerebro medio diseccionado con un mínimo de HBSS. Colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros con un medio de disección etiquetado y guárdelo sobre hielo hasta su disociación. Continúe tirando de los midbrains ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo hasta que el número total cumpla con los requisitos experimentales.Para diseccionar la médula espinal ventral, mantenga el embrión propenso con la cabeza mirando hacia la parte frontal del microscopio. Sosténgaselo con un par de pinzas e inserta la punta del otro par en la parte caudal sin abrir del cuarto ventrículo. Abra el resto del cerebro trasero y la médula espinal dorsal sobre toda la extensión rostrocaudal del embrión.Cortar el tejido dorsal a partir del cuarto ventrículo y trabajar hacia el canal central de la médula espinal caudal usando los fórceps como tijeras. A continuación, sostenga el embrión con un conjunto de pinzas y pellizca el colgajo del tejido dorsal a cada lado con el otro par. Retire la médula espinal ventral utilizando el cuchillo de microdisección para perforar directamente debajo del SMN positivo de la GFP levantando la médula espinal ventral con movimientos similares a sierras en ambos lados.Corte la médula espinal transversalmente en el límite superior de la extremidad inferior y retire la parte lumbar cervical. Corte transversalmente directamente por encima de C1 donde se proyecta la primera bocina anterior positiva de GFP. Coloque el lado dorsal de la médula espinal ventral hacia arriba y sostén lo sostenga presionando el tejido negativo GFP entre las columnas SMN positivas de GFP con un par de pinzas.Retire el mesenquimo, los DRG y la médula espinal restante recortando ambos lados de la columna SMN positiva de GFP con el cuchillo de microdisección. Utilice una pipeta P1000 para recoger el tejido de la médula espinal ventral diseccionada con un mínimo de HBSS y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros etiquetado lleno de medio de disección. Guárdelo sobre hielo hasta la disociación y continúe extrayendo las médulas espinales ventrales de embriones adicionales en el mismo tubo.Agregue el volumen adecuado de solución de papaína a cada uno de los tubos de microcentrífuga con las muestras de tejido diseccionado. Incubar los tubos a 37 grados centígrados durante 30 minutos agitando los tubos cada 10 minutos moviendo los dedos. Después de la incubación, tritura suavemente cada suspensión ocho veces con una pipeta P200 y centrifugala a 300 veces g durante cinco minutos.Resuspender los gránulos celulares con el volumen adecuado de solución inhibidora de la albúmina ovomucoide por pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo. Repite la centrifugación. A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta P1000.Resuspender las células en el volumen apropiado de medio de disección. Filtrar las suspensiones a través de un colador celular de 70 micrómetros. A continuación, utilice la clasificación FACS para aislar las células positivas GFP diseccionadas de CN3/CN4 y SMN.Diluir las suspensiones celulares aisladas con medio de cultivo de neurona motora precaliente a 37 grados Celsius a las densidades adecuadas y añadir 200 microlitros de la suspensión a un pozo de una placa de 96 pozos recubierta de laminina PDL. Cultivo de las neuronas en un 37 grados Celsius y 5%incubadora de dióxido de carbono asegurándose de actualizar el medio de cultivo de neuronas motoras cada cinco días. Cuando las neuronas aisladas con éxito se cultivaron en cultivo, se obtuvieron y mantuvieron in vitro cultivos primarios casi puros cn3/CN4 y SMN durante 14 días in vitro.Las purezas de los cultivos a los dos días in vitro fueron del 93,5% para CN3/CN4 y del 86,7% para SMN cuando se evaluaron por inmunocitoquímica con el marcador de neurona motora Islet1 y el marcador neuronal TUJ1. Las purezas dependían en gran medida de la edad de los embriones y en el establecimiento de los umbrales adecuados para las puertas GFP durante el FACS. La pureza de las neuronas aisladas de los embriones E10.5 fue comparable a la de los embriones E11.5.Sin embargo, la pureza disminuyó significativamente cuando se utilizaron embriones E13.5. Para determinar si los CN3/CN4 primarios y las SN mostraron respuestas diferenciales a los factores estresantes de retículo endoplasmático, las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de ácido ciclopiazázónico o CPA en dos días in vitro y fijadas tres días después para la inmunocitoquímica para evaluar las relaciones de supervivencia. Se contó el número de neuronas viables en cada muestra y se calcularon las relaciones de supervivencia.Los monocultivos CN3/CN4 eran significativamente más resistentes al tratamiento con CPA en comparación con los monocultivos SMN. Después de este procedimiento, se pueden realizar muchos métodos adicionales para examinar las neuronas motoras. Algunos ejemplos incluyen estudios de electrofisiología, biología celular, transcripción o accesibilidad a la cromatina.

isolation-culture-oculomotor-trochlear-spinal-motor-neurons-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una forma alternativa de aislar a las neuronas motoras de embriones de ratón de la médula espinal se describe. El método tiene en cuenta el hecho de que las lectinas pueden unirse a los nervios de baja afinidad p75NTR receptor del factor de crecimiento. Esta lectina preplating basado permite una purificación similar a la que con un anticuerpo específico contra el p75NTR.

Lectina basado en Aislamiento y cultivo de motoneuronas embrionarias de ratón

Aislamiento de cresta neural embrionario del tubo neural facilita el uso...

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

El video muestra el aislamiento de neuronas oculomotoras, trocleares y motoras espinales de un embrión de ratón transgénico. El embrión expresa neuronas motoras marcadas con una proteína verde fluorescente (GFP) para una fácil visualización e identificación. Las neuronas motoras se aíslan quirúrgicamente bajo un microscopio de fluorescencia y se mantienen en un medio de cultivo.

Aislamiento y cultivo de neuronas motoras oculomotoras, trocleares y espinales de un embrión de ratón

Este video muestra el cultivo ex vivo y la obtención de imágenes de cortes oculomotores de embriones de ratón transgénicos. Los embriones están aislados e incrustados en agarosa. Utilizando un vibrátomo se obtienen rodajas que contienen los núcleos oculomotores y los ojos. Las rodajas se mantienen en cultivo y se obtienen imágenes con un microscopio de fluorescencia.

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Las causas de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo durante la enfermedad de Parkinson no se comprenden completamente. Los sistemas de cultivo celular proporcionan una herramienta esencial para el estudio de las propiedades neurofisiológicas de estas neuronas. Aquí presentamos un protocolo optimizado, que se puede utilizar para el modelado in vitro de la neurodegeneración.

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Un ensayo de rebanada ex vivo permite que el crecimiento del nervio oculomotor se intermiera en tiempo real. Los cortes se generan mediante la incrustación de embriones E10.5 IslMN:GFP en agarosa, cortando en un vibratome, y creciendo en una incubadora de etapa superior. El papel de las vías de orientación de axón se evalúa mediante la adición de inhibidores a los medios de cultivo.

Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

Los ganglios ciliares son parte del sistema nervioso parasimpático. Cultivos neuronales de polluelos CG neuronas fueron demostrados para ser modelos celulares eficaces en el estudio de las interacciones musculares nerviosas. Describimos un protocolo detallado para la disección, disociación y cultivo in vitro de neuronas CG a partir de embriones de polluelos.

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Aprende a aislar y cultivar neuronas motoras oculomotoras, trocleares y espinales de embriones de ratón transgénico Isl1mn:GFP. Este método permite estudiar la vulnerabilidad selectiva en enfermedades como la ELA.

Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Isl^mnprenatal :GFP Ratones transgénicos

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