Aumento de la durabilidad de cultivos de células neurales disociadas utilizando matriz coralina biológicamente activa

La importancia de este protocolo es que proporciona una nueva forma de aumentar la durabilidad y el crecimiento de las neuronas, la glía y las células madre in vitro. También es aplicable para otras células. La principal ventaja de la técnica es el uso de una matriz hecha de esqueleto de coral.

Esta matriz nutre y protege las células neuronales y promueve el rebrote. Al ser de apoyo para las células neuronales in vitro, el esqueleto de coral puede funcionar de manera similar como un implante regenerativo en sitios de lesiones cerebrales. Para empezar, utiliza un martillo para romper el esqueleto de coral y divídelo en fragmentos de 0,5 a dos centímetros.

Para disolver los residuos orgánicos y no orgánicos, remoje los fragmentos de esqueleto de coral en una solución de hipoclorito de sodio al 10% durante 10 minutos. A continuación, lavar una vez con agua destilada doble. Para eliminar los residuos orgánicos restantes, remoje los fragmentos en una solución de hidróxido de sodio de un molar durante cinco minutos, luego lávese una vez con agua destilada doble.

Continúe con la eliminación de los depósitos orgánicos remojando los fragmentos en una solución de peróxido de hidrógeno al 30% durante 10 minutos y lave los fragmentos tres veces con agua destilada doble. Retire la mayor cantidad posible de exceso de agua destilada doble y deje que los fragmentos de coral en la capucha se sequen. A continuación, limpie los cubreobjetos de vidrio sumergiéndolos en 10 mililitros de etanol al 95% en una placa de Petri de vidrio de 100 milímetros.

Después de 15 minutos, retire el etanol y lave con agua bidestilada tres veces, esperando 10 minutos entre cada lavado. Retire el agua destilada doble y coloque el plato en una placa calefactora precalentada a 80 grados centígrados. A continuación, revuelva suavemente los deslizamientos de la tapa hasta que se evapore el agua destilada doble.

Esterilizar en autoclave los cubreobjetos. Muele los fragmentos del esqueleto de coral con un mortero hasta que se descompongan por completo. Se obtiene una mezcla de granos con tamaños que van desde los 20 hasta los 200 micrómetros.

Alternativamente, muela los fragmentos de esqueleto de coral con una máquina trituradora eléctrica con una longitud de cuchilla de seis centímetros y un ancho de 0,5 a un centímetro, a una velocidad de 1000 RPM durante 30 segundos. Para purificar los granos, transfiéralos a un colador eléctrico de malla de filtro de 40 micras. Ajuste la configuración del filtro eléctrico para que vibre a 600 amplitudes por minuto y rebote seis veces por segundo.

A continuación, autoclave los granos. En condiciones estériles, agregue los granos del esqueleto de coral en una PDL de 20 microgramos por mililitro, disueltos en la solución de Hank para lograr la concentración de cinco miligramos o 10 miligramos de granos por una solución de PDL mililitro. Vierta la solución en matraces y platos a una concentración de aproximadamente dos mililitros por 25 centímetros cuadrados, e incube durante la noche a cuatro grados centígrados.

Los granos se hunden y se adhieren al fondo. Al día siguiente, lavar los frascos y platos una vez con agua estéril de doble destilación. Deje que los frascos y los platos se sequen en la campana.

Para cubrir el engobe de la cubierta de vidrio, primero agregue granos de esqueleto de coral al agua destilada doble a una concentración de cinco o 10 miligramos por mililitro. Coloque los cubreobjetos en una placa calefactora precalentada a 80 grados centígrados. A continuación, gotee 40 microlitros de la solución de grano en el centro del cubreobjetos y espere 15 minutos para que se evapore por completo.

Esto dará como resultado que los granos se adhieran al cubreobjetos. Esterilizar en autoclave los cubreobjetos recubiertos y almacenarlos en condiciones estériles. A continuación, coloque los cubreobjetos en la tapa de una placa estéril de 24 pocillos, agregue 100 microlitros de solución de PDL de 20 microgramos por mililitro a cada cubreobjetos.

Use la punta para asegurarse de que el líquido cubra toda la región del grano y el resto de la superficie de deslizamiento de la cubierta. Cubra la tapa con la parte inferior del plato y envuelva los lados del lugar con una película de parafina. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, lave los cubrecubiertos una vez con agua destilada doble y séquelos en la campana. Después de preparar las cabezas de los cachorros de rata, sujételos de la boca con pinzas grandes. Corta la piel que cubre el cráneo con una tijera pequeña.

Con unas tijeras limpias, introduzca por debajo del cráneo en el lado del cerebelo y corte el cráneo a la derecha y a la izquierda para permitir su extracción. Con unas pinzas pequeñas, despegue el cráneo del cerebro. Separe el cerebro de la cabeza y póngalo en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga dos mililitros de MEM frío.

Bajo un microscopio estereoscópico, use dos pinzas pequeñas para diseccionar el hipocampo. Transfiera los hipocampos al plato preparado de 35 milímetros que contiene MEM. Corta los hipocampos en rodajas de aproximadamente un milímetro con el bisturí.

Agrega 200 microlitros de solución de tripsina. Mezcle suavemente e incube a 37 grados centígrados y de cinco a 10% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Después de la incubación, agregue dos mililitros de MEM frío al plato para desactivar la tripsina.

A continuación, utilice una pipeta Pasteur de vidrio con el diámetro más grande para transferir el tejido tripsinizado a un tubo de 15 mililitros que contiene un mililitro de medio del primer día, precalentado a 37 grados centígrados. Triture el tejido pasándolo por la pipeta de vidrio de mayor diámetro de 10 a 15 veces. A continuación, repita este proceso utilizando la pipeta de vidrio con el diámetro medio.

Continúe triturando con la pipeta de menor diámetro. Evite burbujear para reducir la muerte celular. Deje que los trozos de tejido disociados se hundan durante dos a cinco minutos.

Luego transfiera el sobrenadante a otro tubo de 15 mililitros. Cuente las células con un hemocitómetro. Para lograr la densidad celular preferible entre 200, 000 y 400, 000 celdas por mililitro.

Use el medio del primer día para diluir. A continuación, siembra 100 microlitros de células en cada cubreobjetos de vidrio. Asegúrate de cubrir todo el cubreobjetos con celdas.

Incubar a 37 grados centígrados y entre un 5 y un 10% de dióxido de carbono. Al día siguiente, agregue 500 microlitros de medio de crecimiento neuronal a los pocillos. Con unas pinzas, retire el medio del primer día inclinando el cubreobjetos y transfiriendo suavemente cada cubreobjetos a su pocillo apropiado.

Succiona el medio restante de la tapa. Incubar la placa a 37 grados centígrados y entre un 5 y un 10% de dióxido de carbono. Mantenga la incubadora humidificada al máximo utilizando una bandeja con agua en la parte inferior de la incubadora.

No reemplace el medio. Los cultivos se pueden mantener en estas condiciones hasta un mes. En este estudio, la molienda manual y la molienda eléctrica arrojaron resultados similares, con una mezcla de granos que oscilaban entre los 20 y los 200 micrómetros de tamaño.

Los filtros manuales o eléctricos producían dos tipos de mezclas de granos. Uno con granos que van de 40 a 200 micrómetros de tamaño, y el segundo con un tamaño de 40 micrómetros o menos. Las micrografías de contraste de fase muestran que el cultivo de células del hipocampo en cubreobjetos recubiertos con granos de esqueleto de coral formaron redes neuronales complejas en ausencia y presencia de la matriz.

La tinción de los núcleos celulares indicó que 14 días después de la siembra, la densidad celular era mayor en la matriz que en los cubreobjetos sin recubrimiento. La tinción con la proteína dos asociada a microtúbulos mostró que se formó una red neuronal y dendrítica compleja en la matriz en comparación con el control. Además, las células gliales cultivadas en la matriz del esqueleto de coral visualizadas utilizando la proteína ácida fibrilar glial sufrieron cambios morfológicos significativos.

Adquirieron una apariencia más puntiaguda, con procesos más largos, que las células gliales cultivadas en el sustrato de control, donde parecían más redondas y planas. Al aislar las células, es importante recordar trabajar rápido, mantener el pH agregando CO2 si es necesario y trabajar lo más suavemente posible para evitar el desprendimiento de los granos de coral.