Clasificación celular activada por fluorescencia para el aislamiento de las poblaciones celulares escleractinianas
31 de mayo de 2020
Los corales crean ecosistemas biodiversos importantes tanto para los seres humanos como para los organismos marinos. Sin embargo, todavía no entendemos todo el potencial y la función de muchas células de coral. Aquí, presentamos un protocolo desarrollado para el aislamiento, etiquetado y separación de poblaciones de células de coral pedregosas.
Este protocolo facilita la identificación y el aislamiento de poblaciones vivas de células de coral a un nivel descriptivo que antes no era posible. La principal ventaja de esta técnica es que permite el acceso a un nivel de especificidad celular que hasta ahora ha sido en su mayoría inalcanzable. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Shannon Saigh, un investigador asociado del recurso compartido de citometría de flujo en el Centro Integral de Cáncer de Sylvester.
Para configurar el citómetro de flujo para la clasificación de células de coral en vivo, abra una nueva plantilla de proyecto en el software del citómetro de flujo y seleccione los láseres adecuados para el análisis en el panel láser. A continuación, cree un gráfico de dispersión lateral frente a dispersión hacia delante en las gráficas adecuadas para configurar la estrategia de medición y análisis. Para el análisis citométrico de flujo y la clasificación de las células de coral vivas, cargue la muestra celular no manchada de control en la cámara de muestra del citómetro e inicie el proceso de lectura.
Dado que las células de coral son particularmente frágiles, mantenga la presión del citometro baja para prevenir la lelisis celular. En la gráfica de dispersión, ajuste el voltaje del multiplicador de fotos para centrar los puntos y comience a grabar los eventos. En la gráfica de dispersión hacia delante frente a lado, cree una puerta alrededor de las celdas alrededor de la marca 10 a la 4a en el eje X de dispersión hacia delante.
Reemplace la muestra de control por la primera muestra de celdas manchadas y registre aproximadamente 10.000 celdas antes de pausar. A continuación, puerta y los eventos que son exclusivos del grupo de muestra manchado. Para clasificar las células de coral vivas, después de seleccionar la población celular de interés en el software del citómetro de flujo, coloque un tubo de microcentrífuga que contenga 250 a 500 microlitros de la solución de recolección adecuada en la cámara de recolección de citómetros para que cada población la clasife.
Una vez que haya pasado una cantidad apropiada de tiempo para eliminar los escombros, comience a clasificar la población deseada para recoger entre 10.000 y varios millones de células. Cada vez que se utilice una nueva mancha, especie o clasificador, clasif sino 20.000 células de interés en 500 microlitros de medios de tinción para permitir que se realice un control de pureza en la población de interés y reanalice las celdas ordenadas para confirmar que los eventos se están leyendo dentro de la puerta utilizada para la clasificación inicial. Para estudios in vitro, almacene las células ordenadas en hielo hasta que se transfieran a una incubadora o a un entorno esterilizado.
Para traer otras partículas no celulares que no comparten la misma forma o granularidad que las células de coral se pueden eliminar del análisis mediante la creación de una selección de puerta en una gráfica de dispersión hacia adelante y lateral. Las células muertas se pueden excluir comparando la señal DAPI de las suspensiones de celdas no manchadas y manchadas utilizando un histograma y sacando las celdas altas que expresan DAPI. Paralelamente, las células que alojan la simbieneasia autofluorescencia se pueden eliminar mirando contra las células con la señal alta en el canal rojo lejano.
Después de este proceso iterativo de gating, las células restantes representan las poblaciones intactas de células de coral vivas que carecen de simbideneasia. Estas células se pueden clasificar en diferentes subpoblaciones celulares mediante la tinción de características tales como la actividad reactiva de especies de oxígeno y / o contenido lisosoma. Es fundamental recordar que algunas células son más frágiles que otras y ejecutar este proceso con el mayor cuidado posible.
Una vez que se han aislado células específicas, se pueden utilizar para ensayos funcionales x-vivo, como el establecimiento de cultivos celulares y la creación de perfiles transcriptómicos.
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Visión general
Este estudio aborda la necesidad de una mejor comprensión de las células de coral, que son cruciales para la biodiversidad en los ecosistemas marinos. Los autores presentan un protocolo novedoso para el aislamiento y etiquetado de poblaciones de células de coral pétreo, logrando un nivel sin precedentes de especificidad celular.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Biología de corales
- Técnicas de aislamiento celular
- Biodiversidad del ecosistema
Contexto
- Los corales forman ecosistemas esenciales para la vida marina.
- El conocimiento actual sobre las funciones de las células de coral es limitado.
- El aislamiento de poblaciones específicas de células de coral es vital para futuras investigaciones.
Métodos utilizados
- Citometría de flujo para clasificación de células vivas
- Coral pétreo como organismo modelo
- Estrategia de gating para identificar y aislar tipos específicos de células
Principales resultados
- El protocolo permite la identificación y clasificación de poblaciones de células de coral vivas.
- Garantiza la pureza y viabilidad de las células clasificadas para ensayos futuros.
- Facilita el estudio de subpoblaciones y sus funciones.
Conclusiones
- El estudio presenta un método confiable para aislar células de coral, mejorando el potencial de investigación.
- Los hallazgos aportan valiosas ideas sobre la biología de los corales y la salud del ecosistema.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from complex tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and mechanistic de-risking. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables high-resolution cellular interrogation, supporting predictive confidence in pathway-specific responses. This capability is directly applicable to biopharma discovery workflows requiring precise functional assays and transcriptomic profiling of rare or fragile cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution by isolating live populations for functional validation.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating viable cell subpopulations from debris, dead cells, and symbiont-associated signals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating purified inputs for downstream assays that clarify target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell suspensions suitable for reproducible functional assays and dose-response profiling.
- Operational Value: Establishes gating strategies that ensure assay readiness and minimize variability across experimental runs.
- Scalability: Allows collection of sufficient cell numbers (10,000 to several million) for multi-well screening and omics applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent isolation of disease-relevant cell populations for mechanistic follow-up.
- Biomarker Alignment: Facilitates staining for stress-response markers (e.g., reactive oxygen species, lysosome content) to correlate cellular phenotypes with functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Purified populations improve data reliability in preclinical models, reducing false positives from heterogeneous samples.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by enabling precise cellular inputs at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating live coral (or analogous mammalian) cell populations for pathway-specific functional interrogation.
- Screening: Delivers standardized, gated cell populations that enhance assay reproducibility and quantitative readout reliability.
- Analytics: Generates high-purity samples enabling accurate transcriptomic, proteomic, or metabolic profiling to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through consistent preparation of viable, stress-responsive cell subsets.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across projects requiring subcellular resolution, independent of model system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing noise from non-target cells and enabling mechanistic de-risking of targets.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible gating, low-pressure sorting, and viability-preserving collection methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner biological data, reducing late-stage failure risk from flawed target assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable subpopulation-specific data that informs advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, including laser selection, voltage optimization, and scatter plot gating for fragile cells.
- Dependent on instrumentation capable of low-pressure sorting and multi-parameter detection (forward/side scatter, fluorescence channels).
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, collection media, and gating thresholds to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cell fragility across species or conditions, requiring iterative optimization of shear stress and staining duration.
- Limited by sample preparation quality; enzymatic or mechanical dissociation must preserve epitope integrity and cell viability for accurate sorting.
