Name: Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a cultivar variantes de colonia pequeña de Pseudomonas aeruginosa y a cuantificar su alginato mediante ELISA. Este método mejora la selección bacteriana y ofrece una cuantificación más segura y sensible del exopolisacárido.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R44GM113545 y P20GM103434.

1. Condiciones de crecimiento del SCV y activación fisiológica de la vía de salvamento
<ol><li>Detección de SCV.<ol>
<li>Las cepas p. aeruginosa PAO1, PAO1pyrD,PAO581 y PAO581en placas de agar de aislamiento Pseudomonas (PIA) precalentadas y crecen a 37oC durante 48 h. En la placa de crecimiento identificar un aislado de colonia única que tiene el fenotipo SCV (tamaño de la colonia de 1 x 3 mm en comparación con el tamaño normal de la colonia de 3 x 5 mm).</li>
		<li>Repita el paso 1.1.1 para obtener un aislado puro del SCV. NOTA: El crecimiento puede requerir hasta 72 h debido a la lenta tasa de crecimiento de las colonias de SCV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Activación fisiológica de la vía de salvamento.<ol>
<li>Usando un bucle de inoculación estéril, escoja la colonia SCV de la placa PIA y la raya en un PIA precalentado complementado con 0,1 mM de uracilo. Cultivar la placa a 37oC durante 24 x 48 h. NOTA: Todas las placas PIA utilizadas en este protocolo contienen 20 ml/L de glicerol añadido a la mezcla antes del autoclave. Después de la autoclave y después de la temperatura de la mezcla es inferior a 55 oC añadir 11,21 mg/L de uracilo (0,1 mM) al medio líquido antes de verter las placas. Este método ayudaría a identificar mutaciones de pirimidina que causan fenotipo SCV en P. aeruginosa. Si el fenotipo SCV es el resultado de dicha mutación, entonces el crecimiento normal de la colonia y el tamaño (3 x 5 mm) se observarían en las placas PIA suplementadas con uracilo. Si las cepas tenían la capacidad de producir alginato, entonces el fenotipo mucoide también volverá sobre la suplementación de uracilo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ensayo de ácido urónico carbazol
<ol><li>A partir de un cultivo puro de cepa deseada para ser probado, identificar una sola colonia. Usando un palillo de dientes estéril, escoja la colonia y coloque el palillo de dientes en un tubo de ensayo de cultivo que contenga 5 ml de caldo de aislamiento Pseudomonas (PIB). Crecer en una incubadora de coctelera a 37oC durante 24 h. NOTA: Las siguientes cepas PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA,PAO581carBy PAO581pyrD se cultivaron en placas PIA o placas PIA complementadas con uracilo de 0,1 mM para cosechar alginato para la medición.</li>
	<li>En una placa PIA precalentada añadir 150 l de caldo PIB cultivado (para placas de 15 mm x 100 mm) o 450 l de caldo (para placas de 15 mm x 150 mm). Usando un esparcidor de células estériles, esparza el caldo sobre el plato. Cultivar la placa a 37oC durante 24 h. NOTA: Aspirar cualquier exceso de líquido, si lo hay, de la placa usando un pipeta inclinando la placa hacia un lado. Las placas PIB y PIA utilizadas en el protocolo contienen 20 ml/L de glicerol para ser utilizados por las células como fuente de carbono para ayudar en la producción de alginato.</li>
	<li>Usando un controlador de pipeta y una pipeta estéril de 50 ml, agregue 0.85% NaCl al césped cultivado y recoja la muestra desguazando la placa usando un esparcidor de células. Aspirar la muestra usando un nuevo pipeta de 50 ml en un tubo de recogida de 50 ml. Vortex la muestra en alto para mezclar y colocar las muestras en hielo. NOTA: El volumen de NaCl añadido 0.85% varía dependiendo del tamaño de la placa. Para placas de 15 mm x 100 mm, utilice 10 x 30 ml y, para placas de 15 mm x 150 mm, utilice 20 x 50 ml.</li>
	<li>Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600) de las muestras añadiendo 1 ml de la muestra a una cubeta desechable y leyendo el OD utilizando un espectrofotómetro. Repita este paso 2x para obtener un triplicado de lecturas para cada muestra.</li>
	<li>Añadir 3 ml de la solución de ácido sulfúrico/borato en tubos de cultivo y dejar sentarse en el hielo. Añadir 350 l de la muestra recogida lentamente a la mezcla ácida en los tubos de ensayo y vórtice en baja brevemente.<ol>
<li>Prepare el stock de borato añadiendo 10.099 g de hidróxido de potasio (KOH) en polvo a 45 ml de agua. Añadir 24,74 g de ácido bórico (H3BO3) a la mezcla y llevar el volumen a 100 ml.</li>
		<li>Colocar 1 L de botella en un fregadero con hielo y llenar la botella con 500 ml de ácido sulfúrico concentrado. Añadir LENTAMENTE 15 ml del stock de borato preparado. Deje que la botella se enfríe.</li>
		<li>Añadir otros 10 ml de stock de borato para un total de 25 ml. Una vez enfriada la botella, lleve el volumen a 1 L. ADVERTENCIA: Este método se basa en el uso de ácido sulfúrico altamente concentrado. Se debe utilizar un equipo de protección personal adecuado para garantizar la seguridad y el protocolo de eliminación adecuado de la muestra. NOTA: Para un control positivo, una concentración conocida ded ácido -manurónico y/o muestras de alginato bacteriano conocidas cosechadas y purificadas a través de cepas productoras de alginato de P. aeruginosa (por ejemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para un control negativo utilizar 0.85% NaCl solución y / o PAO1algD (Deleción en el marco del gen algD que hace que las bacterias completamente incapaces de producir alginato). Se pueden hacer varios tubos de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare 3 x 5 tubos de cada muestra.</li>
	</ol></li>
	<li>Añadir 100 l de carbazol al 0,1% de carbazol en solución de etanol a la mezcla ácido/muestra. Tapar el tubo y el vórtice en un ajuste medio durante 5 s. Colocar en un baño seco a 55oC durante 30 min.</li>
	<li>Después de la incubación, retire los tubos y el vórtice brevemente en alto y deje enfriar durante 5 min. NOTA: El color a ver sería un tono de púrpura. El color se mantendrá estable para la medición durante 1 x 2 h.</li>
	<li>Lea el OD530 de cada tubo añadiendo 1 ml de la mezcla a una cubeta limpia y leyendo la DoDe de las muestras a 530 nm en un espectrofotómetro. Utilice el tubo con 0.85% NaCl como blanco para el espectrofotómetro.</li>
	<li>Preparar una curva estándar midiendo laDoS 530 de las diluciones en serie de las concentraciones conocidas de ácido D-Manurónico (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml y 8 g/ml). Repita 2x. Extraiga una ecuación lineal de estas lecturas. NOTA: La curva estándar solo debe realizarse una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.<ol>
<li>Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ELISA para la cuantificación de alginatos
<ol><li>Repita los pasos 2.1 a 2.4 para obtener muestras para la medición del alginato. NOTA: Las cepas utilizadas fueron PAO1, PAO1algDy PAO1 que llevaban pHERD20T-algU.</li>
	<li>Usando una micropipette añadir 50 l de la muestra recogida a una placa de 96 pocillos sin tratar. Añadir 50 l de tampón de recubrimiento (tamtón de carbonato/bicarbonato pH 9.6) a los pozos. Incubar la placa a 37oC durante 2 h. NOTA: Para un control positivo, se puede utilizar una concentración conocida de ácido D-manurónico y/o una cepa productora de alginato estable conocida (por ejemplo: PAO581-PAO1mucA25). Para un uso de control negativo 0.85% NaCl solución y / o PAO1algD (deleción en el marco del gen algD hace que la bacteria completamente incapaz de producir cualquier alginato). Se pueden hacer varios pozos de cada muestra para aumentar el número de repeticiones técnicas para ayudar en el análisis estadístico. Prepare 3 x 5 pozos de cada muestra.</li>
	<li>Usando una botella de chorro, lave los pozos de la placa 2veces con 1x solución salina tampón de fosfato (PBS) con 0.05% Tween 20 (PBS-T) llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.</li>
	<li>Usando una micropipette añadir 200 l de tampón de bloqueo (10% de leche descremada en PBS-T) a los pozos. Incubar a 4oC durante la noche. NOTA: Envuelva la placa en película de parafina o envoltorio para ayudar a evitar cualquier evaporación en el refrigerador.</li>
	<li>Usando una botella de chorro lavar los pozos de la placa 2x con PBS-T llenando los pozos, y luego escurrirlos volteando la placa.</li>
	<li>Usando una micropipeta añadir 100 s de anticuerpo primario diluido (anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón) a los pozos e incubar a 37 oC durante 1 x 2 h. NOTA: Se proporcionó anticuerpoprimario primario (anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón) a una concentración de 0,5 g/ml (dilución de 1:2.000 de 1 mg/ml) en solución diluyente de anticuerpos (1% de leche desnatada en 1x PBS).</li>
	<li>Usando una botella de chorro lave los pozos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.</li>
	<li>Usando una micropipeta añadir 100 s de anticuerpo secundario diluido a los pozos e incubar a 37 oC durante 1 x 2 h. NOTA: El anticuerpo secundario utilizado fue el anticuerpo poliratón de cabra perforado a una concentración de 0,25 g/ml (dilución de 1:2.000 de 0,5 mg/ml) en la solución diluyente de anticuerpos.</li>
	<li>Usando una botella de chorro lave los pozos de la placa 3 veces con PBS-T llenando los pozos, y luego escurriéndolos volteando la placa.</li>
	<li>Con un micropipeta, añadir 100 ml de solución de TMB-ELISA(Tabla de materiales)e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. NOTA: El color de una reacción positiva sería un tono de azul.</li>
	<li>Con una micropipeta, añadir 100 ml de solución de parada (2 N de ácido sulfúrico). NOTA: El color cambiará de azul a amarillo cuando se agregue la solución de parada. El color es estable hasta 30 minutos después de detener la reacción.</li>
	<li>Usando un lector de placas, lea el OD a 450 nm.</li>
	<li>Producir una curva estándar midiendo la DoC450 de las diluciones en serie de las concentraciones conocidas de ácido D-Manurónico (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml y 8 g/ml). Repita 2x. De estas lecturas extraer una ecuación lineal. NOTA: La curva estándar solo debe realizarse una vez. La ecuación lineal extraída de ella se puede utilizar para pruebas posteriores.<ol>
<li>Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis estadístico de la medición del alginato
<ol><li>En una hoja de software gráfica, establezca una columna con la ecuación lineal derivada de la curva estándar. Establezca los resultados del eje Y como la concentración de alginato y los resultados del eje X como el OD530 para el ensayo de ácido urónico y oD450 para ELISA para obtener las concentraciones de alginato en cada muestra.</li>
	<li>Para normalizar la cantidad de alginato en cada muestra a la cantidad por 5,5 x 108 CFU/ml (1 OD600),divida la concentración de cada muestra obtenida anteriormente por su respectivo valor OD600. Si se midieron varios OD600 para cada muestra, divida por la media de600OD .</li>
	<li>Realizar análisis estadísticos utilizando el software estadístico preferido (por ejemplo, GraphPad Prism 7.02).</li>
	<li>Abra el software. Elija Columna en Nueva tabla y gráfico y elija el conjunto de datos ANOVA unidireccional.</li>
	<li>Asigne un nombre a cada columna con la cepa probada y agregue las concentraciones de alginato debajo.</li>
	<li>Después de introducir todos los datos, haga clic en Analizar en el menú superior. Esto abrirá una ventana de configuración de análisis. Elija los parámetros adecuados para las pruebas e indique si es necesario ejecutar varias comparaciones. NOTA: Después del análisis, el conjunto de datos contendrá un valor p que ayudaría a determinar la significancia estadística de los datos. Los datos se considerarían estadísticamente significativos si el valor p es menor que el valor establecido (normalmente se establece el valor de valor para p < 0.01).</li>
	<li>En la pestaña de gráfico, elija el tipo Degráfico de barras. Esto trazará automáticamente los datos con el título indicado de la hoja de datos de entrada. Indique la significancia estadística de los datos según sea necesario mostrando el símbolo * sobre las líneas conectivas entre las barras de interés.</li>
</ol>

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</ol>

El autor Hongwei D. Yu es el Director Científico y Cofundador de Progenesis Technologies, LLC.

Tanto el SCV como el alginato son marcadores importantes de la enfermedad implicados en varias infecciones crónicas. Por lo tanto, la capacidad de aumentar el SCV, así como estudiar la regulación y producción de alginato por P. aeruginosa es parte integral del descubrimiento de nuevos tratamientos para estas enfermedades crónicas.
Las cepas de SCV son notoriamente difíciles de cultivar debido a su tasa de crecimiento lento4 en comparación con otras cepas de <em...

Las infecciones pulmonares crónicas con Pseudomonas aeruginosa son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística (CF). Durante la primera infancia, los pacientes son colonizados por múltiples patógenos bacterianos, incluyendo aislados no mucoides de P. aeruginosa1,2. La aparición de los aislados de la variante de la pequeña colonia (SCV), así como los aislados mucoides, es un marcador para el inicio de infecciones crónicas. Los aislados de SCV son altamente resistentes a los medicamentos3 debido a sus lentas tasas de crecimiento4, lo que los convierte en un grave elemento disuasorio en los regimientos de tratamiento y otras infecciones crónicas5 por P. aeruginosa. 6mostró un vínculo entre el SCV y la mucoimidicia vinculado por la biosíntesis de novo pirimidina. La inanidinación de pirimidina, debido a mutaciones en genes relacionados con la producción de pirimidina, dio lugar a fenotipo SCV en la cepa de referencia no mucoide PAO1 y el derivado mucoide, PAO581 (PAO1mucA25).
A pesar de que la sobreproducción de alginato es un marcador de enfermedad importante para las infecciones pulmonares crónicas en la FQ, no está claro si existe una correlación directa entre la cantidad de alginato y la patología pulmonar, y no está claro si el alginato se puede utilizar como marcador de pronóstico para el tratamiento7. La producción de alginato está regulada principalmente por dos operons, un operon regulador (algUmucABCD)8,9 y el operon biosintético (algD operon)10,11. La producción de alginato está estrechamente regulada por el factor sigma AlgU9,12 (también conocido como AlgT) y la degradación del factor anti-sigma MucA13. La capacidad de monitorear la producción de alginato in situ a partir de las muestras de esputo de los pacientes puede ayudar en el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.
Aquí, describimos una condición de crecimiento que detecta la presencia de SCV causado por mutantes que no pueden sintetizar la pirimidina de novo. La suplementación de uracilo y/o citosina, la base nitrogenada de nucleótido de pirimidina, al medio activa la vía de salvamento, restaurando así el crecimiento normal en mutantes. Este método de crecimiento para estos mutantes específicos del SCV se puede utilizar como método de cribado para identificar mutaciones de pirimidina en muestras de pacientes. Además, discutimos dos métodos para la detección y medición de alginato producido y secretado por P. aeruginosa. El primero es el método tradicional14,15,16 de degradar el polisacárido utilizando una alta concentración de ácido y luego añadir un indicador colorimétrico para cuantificar la concentración en la muestra. El segundo método, desarrollado en nuestro laboratorio, utiliza el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-alginato (mAb) desarrollado por QED Biosciences. El método ELISA demuestra ser más específico y sensible que el ensayo de ácido urónico y permite un uso más seguro debido a la evitación del ácido sulfúrico altamente concentrado. Con la capacidad de la ELISA para ser utilizado directamente en muestras de esputo del paciente para medir el alginato, se puede desarrollar como una herramienta de diagnóstico de monitoreo para seguir la cantidad de alginato presente en los pulmones en diferentes períodos de la infección.

<table><tbody><tr><td>Ultra TMB-ELISA de 1 paso</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Etanol absoluto (200 pruebas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Molecular Bio-grade</td></tr><tr><td>Accu Block Digital Dry Bath Labnet</td><td></td><td>NC0205808</td><td>a través de Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Placas de ensayo CoStar de 96 pocillos</td><td>2021-12-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa de trabajo Vortex-Genie 2</td><td>Industrias Científicas</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>Productos de Investigación de Ácido Bórico</td><td>Corporación Internacional.</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de armario</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Carbazol</td><td>Sigma</td><td>C-5132</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de carbonato-bicarbonato</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>via Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Tubos de ensayo para cultivos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-6D</td><td>via Fisher Cubeta Científica</td></tr><tr><td>de poliestireno (1,5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cytosine</td><td>Acros Organics</td><td>71-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Bucles de inoculación desponibles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>Ácido D-Manurónico Sigma Sódico</td><td>Aldrich</td><td>SMB00280</td><td></td></tr><tr><td>FMC Alginato</td><td>FMC</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>para biología molecular</td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal anti-alginato de ratón</td><td>QED Biosciences</td><td>N/A Lote</td><td># :15725/15726</td></tr><tr><td>Polvo salino tamponado con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP</td><td>Anticuerpo Thermo Scientific</td><td>32230</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>1310-58-3</td><td>a través</td>de</tr><tr><td>Fisher Scientific Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas Agar de aislamiento (PIA)</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas Caldo de aislamiento (PIB)</td><td>Alpha Biosciences</td><td>P16-115</td><td>a través de Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Palillos de dientes redondos</td><td>Diamante</td><td></td><td>Cualquier marca</td></tr><tr><td>Alginato de algas marinas (Protanal CR 8133)</td><td>FMC Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leche descremada</td><td>Difco</td><td>232100</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Espectrofotómetro</td><td>BioRad</td><td>170-2525</td><td>o proveedor preferido</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x Lector de microplacas multimodo</td><td>Molecular Devices</td><td>i3x</td><td>o proveedor preferido</td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril de 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A298-212</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico de grado técnico (2 soluciones normales de parada)</td><td>R& D Systems</td><td>DY994</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Acros Organics</td><td>66-22-8</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo de la pequeña colonia variante de pseudomonas aeruginosa y cantidad de su alginato

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista, puede producir en exceso un alginato de exopolisacárido, lo que resulta en un fenotipo único llamado mucoidy. El alginato está relacionado con infecciones pulmonares crónicas que provocan un mal pronóstico en pacientes con fibrosis quística (CF). Comprender las vías que regulan la producción de alginato puede ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la formación de alginato. Otro fenotipo relacionado con la enfermedad es la variante de la pequeña colonia (SCV). El SCV se debe al lento crecimiento de bacterias y a menudo se asocia con una mayor resistencia a los antimicrobianos. En este artículo, primero mostramos un método de cultivo de una forma definida genéticamente de P. aeruginosa SCV debido a mutaciones en la biosíntesis de pirimidina. La suplementación de bases nitrogenadas, uracilo o citosina, devuelve el crecimiento normal a estos mutantes, demostrando la presencia de una vía de salvamento que barre las bases libres del medio ambiente. A continuación, analizamos dos métodos para la medición del alginato bacteriano. El primer método se basa en la hidrólisis del polisacárido a su monómero de ácido urónico seguido de derivatización con un reactivo cromogénico, el carbazol, mientras que el segundo método utiliza un ELISA basado en un mAb específico del alginato disponible comercialmente. Ambos métodos requieren una curva estándar para la cuantificación. También demostramos que el método inmunológico es específico para la cuantificación de alginato y puede utilizarse para la medición del alginato en las muestras clínicas.

La Figura 1 muestra las placas de PAO1 y PAO581 con o sin deleción en el marco en el gen de la pirretrosa (un gen en la vía de biosíntesis de pirimidina) que da como resultado el SCV6. El mutante PAO1 SCV fue restaurado al crecimiento normal en respuesta a la suplementación con uracilo(Figura 1A,B). Además, el mutante PAO581pyrDSCV fue devuelto a la mucoide con el mismo t...

Aquí, describimos una condición de crecimiento para cultivar la pequeña variante de colonia de Pseudomonas aeruginosa. También describimos dos métodos separados para la detección y cuantificación del alginato de exopolisacárido producido por P. aeruginosa utilizando un ensayo tradicional de ácido urónico carbazol y un anticuerpo monoclonal específico de alginato (mAb) basado en ELISA.

Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

La variante de colonia pequeña o técnica SCV permite la selección y el crecimiento de pequeñas variantes de colonias de Pseudomonas aeruginosa. El método es muy definitivo y permite una selección más fácil que los métodos normales. Este protocolo también detalla un método ELISA más seguro y sensible para la cuantificación de alginatos en comparación con el método estándar de carbazole de ácido urónico, lo que permite la cuantificación directa del alginato en muestras sin cautela ni manipulación de muestras.Demostrando el procedimiento estarán Brandon Kirby, un técnico de laboratorio, y Roy Al Ahmar, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para detectar la variante de colonia pequeña o SCV, primero raya la cepa P.aeruginosa PAO1 delta PYRD en placas PIA precalejadas. Crecer las cepas a 37 grados Celsius durante 48 horas.En la placa de crecimiento, identifique un aislado de una sola colonia que tenga el fenotipo SCV caracterizado por un tamaño de colonia de uno a tres milímetros en comparación con el tamaño normal de colonia de tres a cinco milímetros. Vuelva a rayar las colonias seleccionadas para obtener un aislado puro del SCV. Para realizar la activación fisiológica de la vía de salvamento, utilice un bucle de inoculación estéril para recoger la colonia SCV de la placa PIA.Rayar la colonia seleccionada en una placa PIA precalentada complementada con 0,1 uracilo mililolar. Haga crecer la placa a 37 grados centígrados durante 24 a 48 horas. Para comenzar el ensayo de carbazole de ácido urónico, identifique una sola colonia de un cultivo puro de la cepa deseada para ser probada y elija la colonia usando un palillo de dientes estéril.Coloque el palillo de dientes en un tubo de ensayo de cultivo que contenga cinco mililitros de PIB. Crecer en una incubadora de coctelera a 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, agregue una alícuota del caldo PIB cultivado en una placa de PIA precalemada.Usando un esparcidor celular estéril, esparza el caldo sobre el plato y crece a 37 grados Celsius durante 24 horas. Usando un controlador de pipeta y una pipeta estéril de 50 mililitros, agregue 0.85%cloruro de sodio al césped adulto y recoja la muestra raspando la placa usando un esparcidor celular. Aspirar la muestra con una pipeta fresca de 50 mililitros y transferir en un tubo de recogida de 50 mililitros.Vórtice la muestra en alto para mezclar y colocar las muestras en hielo. Para medir el OD600 de las muestras, primero en blanco el espectrofotómetro utilizando un mililitro de cloruro de sodio al 0,85%. A continuación, agregue un mililitro de la muestra a una nueva cubeta desechable y lea la OD. Repita este paso dos veces para obtener un triplicado de lecturas para cada muestra.Ahora agregue tres mililitros de la solución de borato de ácido sulfúrico en tubos de cultivo y deje reposar sobre hielo. Añadir 350 microlitros de la muestra recogida lentamente a la mezcla de ácido en los tubos de ensayo. Después de vórtices brevemente en bajo, añadir 100 microlitros de 0.1%carbazole y solución de etanol a la mezcla de muestra ácida.Tapa el tubo y el vórtice en el ajuste medio durante cinco segundos. A continuación, colocar en un baño seco a 55 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, vórtice los tubos brevemente en alto y dejar enfriar durante cinco minutos.Utilice el tubo con cloruro de sodio al 0,85% en blanco para el espectrofotómetro. A continuación, añada un mililitro de la mezcla a una cubeta limpia y lea la OD de las muestras a 530 nanómetros en un espectrofotómetro. Preparar una curva estándar midiendo el OD530 de diluciones en serie de concentraciones conocidas de ácido d-mannurónico.Repita dos veces y extraiga una ecuación lineal de estas lecturas. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600. Con una micropipeta, agregue 50 microlitros de la muestra recogida a una placa de 96 pozos sin tratar.A continuación, agregue 50 microlitros de tampón de recubrimiento ELISA a los pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante dos horas. Con una botella de chorro, lave los pozos de la placa dos veces con PBS-T llenando los pozos y luego drenando el plato volteando la placa.Añadir 200 microlitros de tampón de bloqueo a los pozos con una micropipeta e incubar a cuatro grados Centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave el plato dos veces con PBS-T como antes. A continuación, agregue 100 microlitros de anticuerpo primario diluido a los pozos e incubar a 37 grados centígrados durante una o dos horas.Después de la incubación, lave los pozos de la placa tres veces con PBS-T como antes. A continuación, añadir 100 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos a los pozos e incubar a 37 grados centígrados durante una o dos horas. Después de lavar la placa de nuevo tres veces, utilice una micropipeta para añadir 100 microlitros de solución TMB ELISA.Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad colocando la placa en un cajón o envolviendo en papel de aluminio. A continuación, agregue 100 microlitros de solución de parada. Utilice un lector de placas para medir el diámetro de propiedad a 450 nanómetros.Produzca una curva estándar midiendo el OD450 de diluciones en serie de concentraciones conocidas de ácido d-mannurónico. Repita las mediciones dos veces y extraiga una ecuación lineal. Calcular la concentración del alginato en cada muestra utilizando la curva estándar y dividir la concentración de alginato de la ecuación lineal por OD600 para obtener la cantidad total de alginato por OD600.Aquí se muestran muestras de PAO581 y PAO581 con mutaciones en genes que regulan la pirimidina de novo biosíntesis cultivada en PIA y PIA complementadas con 0,1 milimolar de uracilo. Los datos muestran que la presencia de uracilo en los medios de comunicación da lugar a la conversión de la cepa mutante de nuevo a mucoidy como se ve en la producción de alginato restaurado. Aquí, se muestran los resultados de la ELISA basada en anticuerpos monoclonales antialginato.Las colonias se cultivan en placas PIA con arabinosa para la inducción del promotor PBAD y el plásmido pHERD-20T. Se muestran PAO1, PAO1 que llevan la expresión plásmido pHERD-20T con el principal factor sigma específico de alginato algU, y PAO1 con una eliminación en el marco del gen algD en la codificación de la enzima biosintética de alginato clave GDP-mannosa deshidrogenasa. Estos datos comparan los niveles no mucoide de alginato medidos para PAO1 y PAO1 delta algD con los niveles mucoide de alginato medidos para PAO1 con pHERD-20T algU.ElISA antialginato también se probó en muestras de esputo del paciente sin crecimiento previo en placas. Tres muestras de esputo de CF que tuvieron crecimiento de mucoide P.aeruginosa mostraron alginato detectable en comparación con dos muestras de esputo paciente que contenían un crecimiento no mucoide P.aeruginosa o ningún crecimiento de P.aeruginosa. La preparación de las curvas estándar para la cuantificación del alginato es muy crucial, ya que esto permitirá una medición precisa y precisa del alginato dentro de la muestra.La solución ácida utilizada en el método de carbazole es muy peligrosa, por lo que se deben utilizar equipos de protección personal adecuados y precauciones para garantizar la seguridad. Después de aislar los SGV, se pueden hacer más perfiles genéticos para comprender mejor las mutaciones que ocurren y la patogenicidad asociada con tales mutaciones. El método ELISA se puede adaptar para controlar la infección pulmonar crónica en pacientes con fibrosis quística.Además, nuestro método de crecimiento podría ayudar a diagnosticar infecciones causadas por SCVs específicos.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Fuente: Al Ahmar, R., et al. Cultivo de la variante de colonias pequeñas de Pseudomonas aeruginosa y cuantificación de su alginato. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra un inmunoensayo colorimétrico para cuantificar el alginato, un exopolisacárido protector producido por Pseudomonas aeruginosa. El procedimiento consiste en recubrir una microplaca con la muestra, aplicar anticuerpos específicos y utilizar una reacción enzima-sustrato para generar un cambio de color medible. Luego se usa una...

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Aprende a cultivar variantes de colonia pequeña de Pseudomonas aeruginosa y a cuantificar su alginato mediante ELISA. Este método mejora la selección bacteriana y ofrece una cuantificación más segura y sensible del exopolisacárido.

Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato

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