Name: Diseño de un Stent Traqueal De la Droga-Eluting Biocompatible en Ratones con Estenosis Laringotraqueal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a colocar stents liberadores de fármacos por vía transoral en ratones con estenosis laringotraqueal. Este método minimamente invasivo permite investigar terapias locales para reducir la formación de cicatrices en vías respiratorias.

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Instituto Nacional sobre la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio 1K23DC014082 y 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Este estudio también fue apoyado financieramente por la Sociedad Tríológica y el Colegio Americano de Cirujanos (Alexander Hillel), la American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) y una beca de capacitación T32 NIDCD (Kevin Motz).

<ol><li>Minnigerode, B., Richter, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+subglottic+tracheal+stenosis+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood.</a> Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+disease+and+the+T%28H%291%2FT%28H%292+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).</li>
<li>Kaplan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Toxicity+Following+Administration+of+Sirolimus+%28formerly+Rapamycin%29+for+Psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis.</a> Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).</li>
<li>Kalra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New-Generation+Coronary+Stents%3A+Current+Data+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Currrent+Atherosclerosis+Reports%22%5BJournal%5D)">New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions.</a> Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14(2017).</li>
<li>Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+cisplatin-eluting+tracheal+stent+for+malignant+airway+obstruction%3A+in+vivo+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies.</a> Chest. 144 (1), 193-199 (2013).</li>
<li>Duvvuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+immunomodulatory+drug-eluting+stent+to+treat+laryngotracheal+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis.</a> Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).</li>
<li>Mugru, S. D., Colt, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+of+silicone+stent+insertion+in+patients+with+expiratory+central+airway+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse.</a> Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).</li>
<li>Hillel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+situ%2C+in+vivo+murine+model+for+the+study+of+laryngotracheal+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Otolaryngolology+Head+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis.</a> JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).</li>
<li>Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+PLLA%2FPCL+blends+and+paclitaxel+release+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles.</a> AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel+Drug-eluting+Tracheal+Stent+Could+Reduce+Granulation+Tissue+Formation+in+a+Canine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).</li>
<li>Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stent+implantation+into+the+tracheo-bronchial+system+in+rabbits%3A+histopathologic+sequelae+in+bare+metal+vs.+drug-eluting+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecularand+Cellular+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents.</a> Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10(2015).</li>
<li>Robey, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+internal+bioabsorbable+PLGA+%22finger-type%22+stents+in+a+rabbit+tracheal+reconstruction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology+Head+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model.</a> Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos más críticos para construir y usar con éxito un stent de elución de drogas in vivo son 1) determinar la relación PLLA-PCL óptima para la tasa de elución de fármacos deseable, 2) determinar la concentración adecuada de fármaco a eluir, 3) moldear los stents alrededor del angiocatéter para uso in vivo, y 4) entrega transoralmente el stent en los ratones después de la inducción LTS sin causar obstrucción fatal de las vías respiratorias.
Si bien existen varios métodos para la administrac...

La estenosis laringotraqueal (LTS) es un estrechamiento patológico de la tráquea más a menudo debido a una lesión iatrogénica después de la intubación. La combinación de la colonización bacteriana, la respuesta del cuerpo extraño a una traqueotomía o tubo endotraqueal, y los factores específicos del paciente conducen a una respuesta inflamatoria aberrante. Esta respuesta inmunitaria maladaptista conduce a la deposición de colágeno en la tráquea, lo que resulta en estrechamiento luminal de la tráquea y la estenosis posterior1,2. Como el tratamiento actual para esta enfermedad es principalmente quirúrgico, se ha estudiado el desarrollo de un paradigma de tratamiento alternativo basado en la medicina dirigido a las vías inflamatorias y profibroticas aberrantes que conducen a la deposición excesiva de colágeno. La rapamicina, que inhibe el complejo de señalización mTOR, ha demostrado tener efectos inmunosupresores, así como un efecto antifibroblasto robusto. Sin embargo, cuando se administra rapamicina sistémicamente, efectos secundarios comunes (por ejemplo, hiperlipidemia, anemia, trombocitopenia) pueden pronunciarse3. El propósito de nuestra metodología es desarrollar un vehículo para la administración local de drogas factible para su uso en las vías respiratorias que disminuiría estos efectos sistémicos. Nuestras evaluaciones se centran en investigar la respuesta inmune local a la construcción de administración de fármacos, así como su capacidad para inhibir la función de fibroblastos y alterar el microambiente inmune local. Los resultados específicos de la enfermedad incluyen pruebas in vivo que evalúan marcadores de fibrosis.
Los stents biodegradables para elución de fármacos se han utilizado en modelos animales de enfermedad en múltiples sistemas de órganos, incluidas las víasrespiratorias 4. Para el manejo de la estenosis o colapso de las vías respiratorias, investigaciones anteriores han utilizado silicona recubierta de drogas y stents a base de níquel5. Una construcción PLLA-PCL fue elegida para este método particular debido a su perfil de elución de fármacos y fuerza mecánica en condiciones fisiológicas durante un período de 3 semanas, que se ha demostrado en estudios publicados anteriores6. PLLA-PCL es también un material biocompatible y biodegradable ya aprobado por la FDA4. Se han estudiado stents biocompatibles que eluyen cisplatino y MMC en modelos animales grandes como conejos y perros. Sin embargo, en estos modelos animales, los stents no se colocaban en un modelo animal de enfermedad y se implantaban de forma transcervical. Este estudio proporciona un método único para evaluar un stent de elución de fármacos biocompatible colocado transoralmente en un modelo de ratón de lesión en las vías respiratorias y estenosis laringotraqueal. Un stent biocompatible que eluye un fármaco inmunomodulador localmente y puede ser miniaturizado para su estudio en un modelo murino es valioso para la investigación preclínica traslacional. Los intentos anteriores de utilización de stent con otras construcciones de material generaron respuestas robustas de cuerpos extraños que empeoran la inflamación subyacente que distingue LTS7. Esta metodología, hasta nuestro conocimiento, es la primera de su tipo en estudiar los efectos inmunomoduladores y antifibrométicos de un sistema de administración de fármacos basado en stent en un modelo murino de LTS. El modelo murino en sí ofrece varias ventajas para el estudio de los efectos de un fármaco inmunomodulador en la tráquea. Se pueden estudiar ratones modificados genéticamente y cohortes experimentales de ratones sanos y enfermos, lo que puede conducir a la reproducibilidad experimental y mejorar la rentabilidad. Además, la entrega del stent transoralmente en la tráquea del ratón imita la entrega clínica de tal stent en humanos, lo que pone de relieve aún más la ventaja traslacional de este método. Por último, la relativa facilidad con la que se puede producir el stent PLLA-PCL con el fármaco permite modificaciones para ofrecer terapias alternativas dirigidas a reducir la formación de cicatrices en la tráquea.

<table><tbody><tr><td><fuerte>1. Para stent</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>angiocatéter de calibre 22</td><td>Jelco</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Disponible también en otros proveedores.</td></tr><tr><td>PDLGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>739955-5G</td><td></td></tr><tr><td>PLLA-PCL (70 : 30)</td><td>Evonik Industries AG</td><td>65053</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>LC Laboratories</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>2. Cirugía animal</td>Cepillo de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>alambre</td><td>Mill-Rose Company</td><td>320101</td><td></td></tr><tr><td>3. Para tinción inmunohistoquímica</tampón retrival de antígeno fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab93678</td><td>También disponible en otros proveedores; se necesita pH ácido</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td><td>También disponible en otros proveedores.</td></tr><tr><td>FBS (Suero fetal bovino)</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-conejo-488</td><td>de cabra Tecnología Lif</td><td>a11008</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-rata-633</td><td>de cabra Tecnología Lif</td><td>a21094</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofílico más diapositiva</td><td>BSB7028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>100-10023</td><td>También disponible en otros proveedores.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD3 para conejos</td><td>Abcam</td><td>ab5690</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo antiF4/80 para ratas</td><td>Biolengend</td><td>123101</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Microscopio Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4. Para PCR</perlas de vidrio fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de 0,5 mm</td><td>OMNI International</td><td>19-645</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homoginizer</td><td>OMNI International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Specific Forward/Reverse Primers</td><td>Genomic Resources Core Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Verde Mastermix</td><td>Life Technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>80404</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diseño de un stent traqueal de la droga-eluting biocompatible en ratones con estenosis laringotraqueal

Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

La estenosis laringotraqueal (LTS) es un estrechamiento patológico de la subglotis y la tráquea que conduce a la obstrucción extratorácica y a una dificultad respiratoria significativa. LTS es el resultado de una lesión mucosa de un cuerpo extraño en la tráquea, que conduce a daño tisular y una respuesta inflamatoria local que va mal, lo que conduce a la deposición de tejido cicatricial patológico. El tratamiento para LTS es quirúrgico debido a la falta de terapias médicas eficaces. El propósito de este método es construir un stent biocompatible que se puede miniaturizar para colocar en ratones con LTS. Demostramos que una construcción PLLA-PCL (70% poli-L-lactide y 30% policaprolactona) tenía una resistencia biomecánica óptima, era biocompatible, factible para un stent de colocación in vivo y capaz de eludir el fármaco. Este método proporciona un sistema de administración de fármacos para probar varios agentes inmunomoduladores para inhibir localmente la inflamación y reducir la fibrosis de las vías respiratorias. La fabricación de los stents toma de 28 a 30 h y se puede reproducir fácilmente, lo que permite experimentos con grandes cohortes. Aquí incorporamos el fármaco rapamicina dentro del stent para probar su eficacia en la reducción de la fibrosis y la deposición de colágeno. Los resultados revelaron que las tiendas PLLA-PCL mostraron una liberación confiable de rapamicina, eran mecánicamente estables en condiciones fisiológicas y eran biocompatibles, induciendo poca respuesta inflamatoria en la tráquea. Además, los stents PLLA-PCL que eluyen la rapamicina redujeron la formación de cicatrices en la tráquea in vivo.

La construcción biodegradable de stent PLLA-PCL cargada de rapamicina utilizada en este estudio fue capaz de eludir la rapamicina de una manera consistente y predecible en condiciones fisiológicas(Figura 1). La Figura 2 muestra el stent PLLA-PCL fundido alrededor de un angiocatéter de 22 G para su uso en un modelo murino de LTS. Para determinar si los efectos de la elución de rapamicina en la tráquea son eficaces en la atenuación de la fibrosis, los cambios medi...

La estenosis laringotraqueal es el resultado de la deposición patológica de cicatrices que estrecha críticamente las vías respiratorias traqueales y carece de terapias médicas eficaces. Utilizando un stent PLLA-PCL (70% poli-L-lactide y 30% policaprolactone) como un sistema local de administración de fármacos, se pueden estudiar posibles terapias destinadas a disminuir la proliferación de cicatrices en la tráquea.

Diseño de un Stent Traqueal De la Droga-Eluting Biocompatible en Ratones con Estenosis Laringotraqueal

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of ...

Este protocolo nos permite investigar los stents que eluyen drogas en un pequeño modelo animal de estenosis laringotraqueal que nos permite aprovechar a los animales modificados genéticamente de una manera rentable. La colocación transoral del stent de las vías respiratorias que eluyen a los fármacos evita a los animales una incisión abierta en la tráquea que representa un modelo más clínicamente relevante de estenosis laringotraqueal. Esta técnica facilita la investigación preclínica de las estrategias locales de administración de fármacos para tratar la estenosis laringotraqueal.Esta técnica proporciona una plataforma factible y eficaz para la investigación traslacional de los stents de las vías respiratorias que eluyen fármacos en un modelo animal pequeño que se puede aplicar para la investigación futura en modelos animales más grandes, así como la aplicación clínica. técnica particularmente la intubación transoral, la inducción de la lesión de la tráquea, y el paso de colocación del stent de las vías respiratorias. La demostración visual de esta cirugía técnicamente desafiante es crítica, ya que muchos de los detalles finos no se pueden describir completamente con palabras.Para

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Este video muestra y se comparan dos modelos experimentales para estudiar el desarrollo de la enfermedad de las vías respiratorias obliterante (OAD) en ratones, el modelo de trasplante heterotópico traqueal y ortotópico.

El trasplante heterotópico traqueal y ortotópico en ratones utilizados como modelos para estudiar el desarrollo de la enfermedad de las vías respiratorias obliterante

Se describe un modelo de implantación de un stent en la arteria carótida del ratón. En comparación con otros métodos similares, este procedimiento es muy rápido, simple y accesible, que ofrece la posibilidad de estudiar de una manera conveniente la reacción de la pared vascular a diferentes stents liberadores de fármacos y los mecanismos moleculares de la restenosis.

Un modelo murino de la implantación de un stent en la arteria carótida para el Estudio de la reestenosis

Nuestros objetivos eran para diseñar, fabricar y probar los stents ferromagnéticos para la captura de las células endoteliales. Diez stents fueron probados para la fractura y 10 más stents se ensayaron para determinar el magnetismo retenido. Finalmente, 10 stents se probaron in vitro y 8 más stents fueron implantados en 4 cerdos para mostrar la captura de células y la retención.

Ferromagnético Bare Metal stent para la captura de la célula endotelial y Retención

Estenosis del injerto constituye un obstáculo fundamental en ingeniería tisular de la vía aérea recambio. Para investigar los mecanismos celulares subyacentes estenosis, utilizamos un modelo murino de reemplazo traqueal ingeniería tisular con células mononucleares de médula ósea (BM-MNC). Aquí detallamos nuestro protocolo, incluyendo fabricación de andamio, BM-MNC aislamiento, siembra del injerto y la implantación.

Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

Este protocolo tiene como objetivo trasplantar un parche bioimpreso 3D en el epicardio de ratones infartos modelando insuficiencia cardíaca. Incluye detalles sobre la anestesia, la abertura quirúrgica del pecho, la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y la aplicación de un parche bioimpreso en la zona infarta del corazón.

Trasplante de un parche bioimpreso 3D en un modelo murino de infarto de miocardio

El protocolo describe un biorreactor habilitado para imágenes que permite la eliminación selectiva del epitelio endógeno de la tráquea de la rata y la distribución homogénea de las células exógenas en la superficie de la luz, seguido de un cultivo in vitro a largo plazo de la construcción célula-tejido.

Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias

El objetivo de este manuscrito es describir los pasos microquirúrgicos necesarios para realizar un trasplante de laringe heterotópico en ratones. Las ventajas de este modelo de ratón en comparación con otros modelos animales de trasplante de laringe son su costo-efectividad y la disponibilidad de ensayos y datos inmunológicos.

Un modelo heterotópico de ratón para estudiar el trasplante de laringe

La esterilización es esencial para el trasplante de tejido traqueal. En este documento, presentamos un protocolo de esterilización utilizando irradiación gamma de baja dosis que es totalmente tolerada por los órganos.

Esterilización por radiación gamma de baja dosis para injertos traqueales descelularizados

Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.

Instilación intratraqueal no invasiva de lipopolisacáridos en ratones

El modelo de trasplante traqueal intrapulmonar murino (IPTT, por sus siglas en inglés) es valioso para estudiar la enfermedad obliterante de las vías respiratorias (OAD, por sus siglas en inglés) después del trasplante de pulmón. Ofrece información sobre el comportamiento inmunológico y angiogénico específico del pulmón en la obliteración de las vías respiratorias después del alotrasplante con alta reproducibilidad. A continuación, describimos el procedimiento IPTT y sus resultados esperados.

Trasplante de tráquea intrapulmonar murina: un modelo para investigar la enfermedad obliterante de las vías respiratorias después de un trasplante de pulmón

Aprende a colocar stents liberadores de fármacos por vía transoral en ratones con estenosis laringotraqueal. Este método minimamente invasivo permite investigar terapias locales para reducir la formación de cicatrices en vías respiratorias.

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