Name: Control de las velocidades de flujo de fluidos activos 3D basados en microtúbulos mediante la temperatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a controlar velocidades de flujo en fluidos activos 3D basados en microtúbulos mediante temperatura. Este método permite regular in situ sin modificar el fluido ni el microscopio.

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Plásmido K401-BCCP-H6 fue un regalo del Dr. Zvonimir Dogic. Esta investigación fue apoyada por el fondo de puesta en marcha del Dr. Kun-Ta Wu en el Instituto Politécnico de Worcester. Agradecemos al Dr. Zvonimir Dogic los protocolos para purificar y etiquetar la tubulina y sintetizar fluidos activos. Agradecemos al Dr. Marc Ridilla su experiencia en la expresión y purificación de proteínas. Agradecemos al Dr. William Benjamin Roger por ayudarnos con la construcción de la etapa de temperatura controlada. Reconocemos a Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) por el uso de la Instalación de Materiales Biológicos (BMF). Reconocemos a la Royal Society of Chemistry por adaptar las figuras de Bate et al. en Soft Matter33.

Los autores no tienen nada que revelar.

El control in situ de la materia activa abre la puerta a la autoorganización dirigida de la materia activa4,5,24,28,54. En este artículo, presentamos un protocolo para el uso de la temperatura para controlar los fluidos activos basados en MT impulsados por cineína in situ, basado en la característica Arrhenius del sistema29,<...

La materia activa se diferencia de la materia pasiva convencional debido a su capacidad para convertir la energía química en trabajo mecánico. Un material que posee tal capacidad puede consistir en entidades vivas o no vivientes como bacterias, insectos, coloides, granos y filamentos citoesqueléticos1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Estas entidades materiales interactúan con sus vecinos. A mayor escala, se autoorganizan en vórtices turbulentos (turbulencia activa) o flujos materiales11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. La comprensión de la autoorganización de la materia activa ha dado lugar a diversas aplicaciones en transbordadores moleculares, dispositivos ópticos y cómputo paralelo21,22,23. Para llevar las aplicaciones al siguiente nivel se requiere control más allá de la autoorganización. Por ejemplo, Palacci y otros desarrollaron un coloide encapsulado de hematita que sólo se autopropulsado cuando se expone a la luz azul controlada manualmente, lo que llevó a la aparición de cristales vivos24. Morin y otros establecieron el control de la rodadura de los coloides de Quincke mediante el uso de un campo eléctrico externo ajustable, lo que resulta en bandadas coloidales en un canal25similar a una pista de carreras. Estos trabajos anteriores demuestran el papel del control local en las aplicaciones y avanzan en la base de conocimientos de la materia activa.
En este artículo, nos centramos en la controlabilidad de fluidos activos 3D basados en microtúbulos (MT) basados en kinesina. Los fluidos consisten en tres componentes principales: MTs, motores moleculares de kinesina y deplorantes. Los depilantes inducen una fuerza de agotamiento para agrupar los MT, que luego son puenteados por los racimos de motor. Estos motores caminan a lo largo del MTstoward el extremo más. Cuando un par de MTsis puenteados son antiparalelos, los motores correspondientes caminan en direcciones opuestas. Sin embargo, los motores están unidos en un racimo y son incapaces de separarse, por lo que se deslizan de forma cooperativa pares de M (deslizamiento entre filamentos, Figura 1A). Estas dinámicas deslizantes se acumulan, haciendo que los haces de MTsto se extiendan hasta alcanzar su punto de inestabilidad de pandeo y rotura (agrupaciones extensivas, Figura 1B)26. Los haces rotos son recocidos por la fuerza de agotamiento, que posteriormente se extiende de nuevo, y la dinámica se repite. Durante el proceso de la dinámica de repetición, los movimientos del haz agitan el líquido cercano, induciendo los flujos que se pueden visualizar mediante el dopaje con trazadores a escala de micrones(Figura 1C). Sánchez y Henkin et al. han caracterizado las velocidades medias de los trazadores, encontrando que las velocidades eran ajustables variando las concentraciones de trifosfato de adenosina (ATP), depilantes, racimos de motores y MTs19,27. Sin embargo, tal atún existía sólo antes de la síntesis de fluido activo. Después de la síntesis, la incapacidad se perdió, y los fluidos se autoorganizados a su manera. Para controlar la actividad del fluido activo después de la síntesis, Ross.et al. informó de un método utilizando la dimerización activada por la luz de las proteínas motoras, permitiendo que la actividad del fluido se afina y apague utilizando la luz28. Mientras que el control de la luz es conveniente en términos de activación local de los fluidos, el método requiere rediseñar las estructuras de las proteínas del motor, junto con la modificación de las trayectorias ópticas en un microscopio. Aquí, proporcionamos un método fácil de usar para controlar localmente los flujos de fluidos sin modificación del microscopio mientras mantenemos intacta la estructura del motor.
Nuestro método de ajuste local del flujo de fluido activo se basa en la ley Arrhenius porque se ha informado que la reacción kinesina-MT aumenta con la temperatura29,30,31,32. Nuestros estudios anteriores mostraron que la dependencia de la temperatura de la velocidad media de un flujo de fluido activo siguió la ecuación de Arrhenius: v - A exp(-Ea/RT), donde A es un factor preexponencial, R es la constante de gas, Ea es la energía de activación, y T es la temperatura del sistema33. Por lo tanto, la actividad del fluido es sensible al ambiente de temperatura, y la temperatura del sistema debe ser consistente para estabilizar el rendimiento del motor y, en consecuencia, la velocidad de flujo de fluido34. En este artículo, demostramos el uso de la dependencia de temperatura del motor para ajustar continuamente las velocidades de flujo de los fluidos activos ajustando la temperatura del sistema. También demostramos la preparación de una muestra de fluido activo, seguida de montaje de la muestra en una etapa del microscopio cuya temperatura se controla a través de software informático. El aumento de la temperatura de 16 oC a 36 oC acelera las velocidades medias de flujo de 4 a 8 m/s. Además, la incapacidad es reversible: aumenta y disminuye repetidamente la temperatura acelera y desacelera secuencialmente el flujo. El método demostrado es aplicable a una amplia gama de sistemas donde las reacciones principales obedecen a la ley Arrhenius, como el ensayo de deslizamiento MT29,30,31,32.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetoxisilil)metacrilato de propilo, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC216550050</td><td></td></tr><tr><td>3,2 mm I.D. Tygon Tubing R-3603</td><td>HACH</td><td>2074038</td><td>Tubos de agua de</td></tr><tr><td>31,75 mm de diámetro sin recubrimiento, ventana de zafiro</td><td>Edmund Optics</td><td>43-637 Disco de</td><td>zafiro</td></tr><tr><td>3M 1181 Cinta de cobre - 1/2 pulgada de ancho x 18 yardas de largo - 2.6 MIL Espesor total - 27551</td><td>R.S. HUGHES</td><td>054007-27551</td><td>Cinta de cobre</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Solución de acrilamida (40%/electroforesis), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1402-1</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato dipotásico hidrato de sal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20006</td><td>Colorante fluorescente rojo lejano. Alexa 647 puede presuspenderse en dimetilsulfóxido (DMSO) antes de mezclarse con microtúbulos (1.3.3.2.)</td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801024</td><td>Tubo de filtro centrífugo. Peso molecular de corte: 10 kDa</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio, 100 g, MP Biomedicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN802829</td><td>Sal</td></tr><tr><td>sódica de ampicilina APS (polvo cristalino), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td>Mesa</td></tr><tr><td>antivibratoria</td> de ampicilina <td>Nikon</td><td>63-7590S</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-E</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>Agente soldador Bacto Agar, BD Diagnostics</td><td>VWR</td><td>90000-760</td><td>Agar</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14207</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de plástico blanco - 2 galones</td><td>Bon</td><td>84-715</td><td>Cubo</td></tr><tr><td>de agua Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Catalasa de hígado bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td><td>Nikon</td><td>MRD00045</td><td>4x objetivo aéreo</td></tr><tr><td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td><td>Nikon</td><td>96372</td><td>GFP</td></tr><tr><td>cubo de filtro CH-109-1.4-1.5</td><td>TE Technology</td><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>Enfriador termoeléctrico (TEC)</td></tr><tr><td>Cloranfenicol, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de enfriamiento</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Aluminio fresado a medida</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td>Colorante de trifenilmetano</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (certificado ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DL-1,4-Ditiotreitol, 99%, para bioquímica, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165680050</td><td>TDT</td></tr><tr><td>DOWSIL 340 Compuesto de disipador de calor</td><td>Dow</td><td>1446622</td><td>Pasta térmica</td></tr><tr><td>ALCOHOL ETÍLICO, 200 PRUEBA ACS / USP / NF GRADO 5 GALONES POLY CUBE</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>111000200CB05</td><td>Etanol</td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N'-ácido tetraacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Fisher BioReactivos Microbiología Aditivos de Medios: Triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421</td><td>Triptona</td></tr><tr><td>Fisher BioReactivos Microbiología Aditivos de Medios: Extracto de Levadura</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td>Extracto de Levadura</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Microesferas, Grado de Calibración 3.00 y micro; m</td><td>Polysciences</td><td>18861</td><td>Partículas trazadoras</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa de Aspergillus niger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>Guanosina-5'[ (&alpha;,&beta;)-metileno]trifosfato (GMPCPP)</td></tr><tr><td>GS Power calibre 18 (True American Wire Ga), 100 pies, 99.9% trenzado de cobre libre de oxígeno OFC, rojo/negro 2 conductores unidos cable de cremallera cable eléctrico de alimentación/altavoz para automóvil, audio, cine en casa</td><td>Amazon</td><td>B07428NBCW</td><td>Alambre de cobre</td></tr><tr><td>Guanosina 5'-trifosfato sodio sal hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z805939</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>HEPES Sal de sodio (polvo blanco), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410</td><td>NaHEPES</td></tr><tr><td>Máquina mezcladora de alto rendimiento</td><td>AIMORES</td><td>AS-UP1250</td><td>Mezclador</td></tr><tr><td>His GraviTrap</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>11003399 Columna de gravedad</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td>Isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranósido</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico 99%</td><td>Pharmco de Greenfield Global</td><td>231000099</td><td>Rotor Isopropanol</td></tr><tr><td>JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico sal de potasio monohidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>K-glutamato</td></tr><tr><td>lisozima de clara de huevo de gallina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>MgCl2&bull; 6H2O</td></tr><tr><td>MES sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>Ácido 2-(N-Morpholino)etanosulfónico sal sódica</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>Ácido 3-(N-Morfolino)propanosulfónico</td></tr><tr><td>MP-3022</td><td>Tecnología TE</td><td>MP-3022</td><td>Termopar</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametilemilendiamina 99%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC138450500</td><td>TEMED</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-VIS Nanodrop 2000c</td><td>Espectrómetro</td>de <td>E112352</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>Norland Adhesivo óptico 81</td><td>Productos Norland</td><td>NOA81</td><td>Pegamento UV</td></tr><tr><td>Novex Sharp Pre-teñido Estándar de proteínas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5800</td><td>Escalera estándar de proteínas</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,5 mm, 10 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>NP0335BOX SDS Gel</td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrífuga Beckman</td><td>Coulter</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm PM996 Wrap, 4" de ancho; 125 pies/rollo</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06720-40 Película de</td><td>cera</td></tr><tr><td>Pe 300 ultra Sistema de iluminación Banda única, 3 mm Control de guía de luz Fuente de alimentación de vaina</td><td>Nikon</td><td>PE-300-UT-L-SB-40</td><td>Iluminador LED frío</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetanosulfonilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Sal monopotásica de ácido fosfoenolpirúvico, 99%</td><td>BeanTown Chemical</td><td>129745</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Kit de ensayo de proteínas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Inhibidor de la proteasa Mini tabletas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32953</td><td></td></tr><tr><td>TUBERÍAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>1,4-piperazinaácido dietanosulfónico</td></tr><tr><td>Plurónico F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300</td><td>PEG. Peso molecular medio 20.000 Da</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (pellets/ACS certificado), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>KOH</td></tr><tr><td>PowerEase 300W Fuente de alimentación (115 VAC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PS0300</td><td>Fuente de alimentación de CC de la caja de gel</td></tr><tr><td>PS-12-8.4A</td><td>TE Technology</td><td>PS-12-8.4A</td><td>Fuente de alimentación de CC del controlador</td></tr> <tr><td>de temperaturaPiruvato quinasa/enzimas lácticas deshidrogenasas del músculo de conejo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>Bomba de fuente Lifegard Quiet One, 296 galones por hora Bomba</td> de <td>pecera</td><td>Amazon</td><td>B005JWA612</td></tr><tr><td>Rosetta 2(DE3)pLysS Células competentes - Novagen</td><td>Millipore Sigma</td><td>71403</td><td>Celdas competentes</td></tr><tr><td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Horno de microondas de encimera, 0,9 pies cúbicos, acero inoxidable</td><td>Amazon</td><td>B01MT6JZMR</td><td>Microondas para hervir el agua</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (cristalino/ACS certificado), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>Proteína de estreptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21122</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TC-720</td><td>Tecnología</td><td>TE TC-720</td><td>Controlador de temperatura</td></tr><tr><td>Tris Base, Grado de Biología Molecular - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648310</td><td>Tris-HCL</td></tr><tr><td>Tipo 45 Rotor Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Tipo 70 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor 337922 Tipo 70.1 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>VWR Cinta de etiquetado de laboratorio de uso general</td><td>VWR</td><td>89097-916</td><td>Cintas de papel</td></tr><tr><td>VWR Micro Cubreobjetos, cuadrados, n.º 1 1/2</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>Cubreobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>VWR Liso y esmerilado Micro portaobjetos, Premium</td><td>VWR</td><td>75799-268</td><td>Portaobjetos</td></tr><tr><td>de vidrio XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Caja de gel</td></tr><tr><td>ZYLA 5.5 USB3.0 Cámara</td><td>CCD monocromática</td> <td>Nikon</td><td>ZYLA5.5-USB3</td></tr></tbody></table>

control de las velocidades de flujo de fluidos activos 3d basados en microtúbulos mediante la temperatura

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Presentamos un método para usar la temperatura para ajustar las velocidades de flujo de fluidos activos tridimensionales tridimensionales (3D) impulsados por la quinesina y basados en microtúbulos. Este método permite ajustar las velocidades in situ sin necesidad de fabricar nuevas muestras para alcanzar las diferentes velocidades deseadas. Además, este método permite el control dinámico de la velocidad. Ciclismo la temperatura lleva a los fluidos a fluir rápido y lento, periódicamente. Esta controlabilidad se basa en la característica de Arrhenius de la reacción de kinesina-microtúbulo, lo que demuestra un rango de velocidad de flujo medio controlado de 4-8 m/s. El método presentado abrirá la puerta al diseño de dispositivos microfluídicos donde los caudales en el canal son ajustables localmente sin necesidad de una válvula.

Preparar los fluidos activos basados en MT impulsados por la quinesina requiere kinesina y MT. Los TM fueron polimerizados a partir de tubulinas etiquetadas (pasos 1.3 y 1.4) que fueron purificadas a partir de cerebros bovinos (paso 1.1, Figura 2A),seguido de reciclaje para mejorar la pureza (paso 1.2, Figura 2B). Las proteínas motoras de kinesina se expresaron y se purificaron a partir de E. coli (pasos 2.1 y 2.2, <str...

El objetivo de este protocolo es utilizar la temperatura para controlar las velocidades de flujo de los fluidos activos tridimensionales. La ventaja de este método no sólo permite regular las velocidades de flujo in situ, sino que también permite un control dinámico, como ajustar periódicamente las velocidades de flujo hacia arriba y hacia abajo.

Control de las velocidades de flujo de fluidos activos 3D basados en microtúbulos mediante la temperatura

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

La materia activa se ha utilizado en diversas aplicaciones como las sombras moleculares. Para llevar la aplicación al siguiente nivel, necesitamos desarrollar la capacidad de controlar la materia activa localmente. Proporcionamos un método fácil de usar que no requiere la modificación del fluido activo.Tampoco la necesidad de modificar la trayectoria óptica del microscopio para lograr el control local del fluido activo. Nuestro método se puede aplicar a una amplia gama de sistemas donde las principales reacciones obedecen a la ley errónea, como el ensayo de deslizamiento de microtúbulos o los sistemas basados en enzimas. La configuración implica un sistema de circulación de agua.Si se producen fugas, el agua puede dañar el microscopio. Por lo tanto, antes de adoptar nuestro protocolo, es importante asegurarse de que el sistema está libre de fugas. Nuestro protocolo requiere el montaje de la muestra de vidrio en una etapa de temperatura.Mientras que el manuscrito describe el procedimiento de montaje, carece de sutilezas mecánicas como asegurar la muestra al escenario. Demostrando el procedimiento, serán Teagan Bate, Edward Jarvis y Megan Varney. Teagan y Edward son estudiantes de posgrado, y Megan es una estudiante de pregrado de un laboratorio.Para preparar fluidos activos en un tubo Eppendorf, mezcle 16 microlitros de siete puntos de ocho miligramos por micróbulos mililitros con seis microlitros de seis puntos siete de un punto ocho cúmulos de motores de kinesina micromolar, y un punto uno microlitros de 500 milivolares TDT en M2B de alta sal. Agrupe los microtúbulos añadiendo 11 puntos cuatro microlitros de siete por ciento de peso en peso de polietilenglicol. A continuación, active los motores de kinesina añadiendo dos microlitros de ocho puntos de 50 ATP mililolares.Mantener las concentraciones de ATP añadiendo dos microlitros de punto ocho de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa, y 13 puntos tres microlitros de 200 piruvato de fosfeno milimolar. Reduzca el efecto de blanqueo fotográfico añadiendo 10 microlitros de 20 trolox milimotores, un punto un microlitros de tres puntos cinco miligramos por mililitro catalasa, un punto un microlitros de 20 miligramos por mililitro de glucosa oxidasa, y un punto uno microlitros de 300 miligramos por mililitro de glucosa. Realice un seguimiento del movimiento del fluido añadiendo un punto seis microlitros de punto cero cero dos cinco por ciento de volumen por partículas trazadoras de volumen.Añadir M2B de alta sal para lograr un volumen total de 100 microlitros. A continuación, enjuague un portaobjetos de vidrio recubierto de poliacrilamida y cubra el deslizamiento con agua DI. Seque los vasos con aire presurizado.Coloque los vasos sobre una superficie limpia y plana. Corta un canal de tres milímetros de ancho en la película de cera. La anchura total es la misma anchura que el resbalón de la cubierta de vidrio a 20 milímetros.Inserte la cera entre la diapositiva y el resbalón de la cubierta para formar un canal de celda de flujo para el fluido. Adherir el vidrio a la película de cera colocando el complejo de cera de vidrio en una placa caliente de 80 grados Celsius para derretir la cera. Durante el derretimiento, presione el resbalón de la cubierta suavemente con una punta de pipeta para adherir uniformemente la película de cera a las superficies de vidrio.Después de la adhesión, enfríe el complejo de vidrio a temperatura ambiente. Cargue rápidamente los fluidos activos preparados en el canal de flujo con la punta de la pipeta en un ángulo alejado de la abertura del canal y en contacto con la superficie de la diapositiva de vidrio. Selle el canal con pegamento UV.Después de construir una configuración de control de temperatura, coloque la muestra de fluido activa en la superficie del zafiro con el lado de la corredera en contacto con la superficie. Asegure la corredera de vidrio con cinta adhesiva. Con cinta de cobre, conecte el ThermoSensor a la superficie deslizante de la cubierta.Para montar la configuración en una etapa del microscopio, con la corredera deslizante de la cubierta orientada hacia los objetivos, asegure la configuración con abrazaderas de aguja de la etapa del microscopio. Encienda el controlador de temperatura y la bomba de la pecera. Siga la guía del fabricante para establecer la temperatura objetivo.Habilite el control de temperatura. Y registre los datos de temperatura de ThermoSensor. I imagen de la muestra con un intervalo de tiempo constante en una microscopía fluorescente equipada con un cubo de filtro GFP para monitorear las partículas trazadora etiquetadas Alexa 488 en la mezcla activa.Ajuste el intervalo de tiempo para permitir que el desplazamiento del trazador entre fotogramas esté dentro de nueve píxeles. Para los trazadores de imágenes que se mueven a 10 micrómetros por segundo, utilizando un objetivo de cuatro veces, se recomienda que el intervalo de tiempo sea de uno a cinco segundos. Guarde las imágenes como archivos TIF, asigne un nombre a los archivos en función del número de fotograma y guárdelos en una carpeta independiente.Para este líquido activo a base de microtúbulo accionado por kinesina, la temperatura se controló a 10, 20, 30 y 40 grados Centígrados. La fluctuación de la temperatura fue dentro del punto cero uno a cero punto tres grados Celsius durante cuatro horas demostrando la estabilidad y fiabilidad de esta configuración de control de temperatura. Los trazadores se visualizaban cada dos segundos, lo que las imágenes secuenciales permitían rastrear trayectorias de trazador.Las velocidades medias medidas a 20 a 36 grados celsius, parecían ser casi independientes del tiempo en cero a dos horas. Donde a 10 y 40 grados Celsius, las velocidades medias se desintegraron rápidamente causadas por la despolimerización de microtúbulos por debajo de 16 grados Celsius y los racimos de kinesina fallan por encima de 36 grados Centígrados respectivamente. Cuando las temperaturas del sistema se alternaron entre 20 y 30 grados celsius cada 30 minutos, las velocidades medias de los fluidos activos no sólo aceleraron y desaceleraron en consecuencia, sino que también respondieron al cambio de temperatura en 10 segundos.Los fluidos activos comienzan a funcionar mal, cuando se enfrían por debajo de 16 o se calientan por encima de 36 grados. Así que al manipular el controlador de temperatura, asegúrese de que la temperatura está entre 16 y 36 grados. La capacidad de ajustar el fluido activo localmente, permite dirigir la potencia del fluido, como entregar cargas desde el punto A al punto B o desarrollar un dispositivo de microfluididad que no requiere una válvula física.La acrilamida utilizada para recubrir la cristalería es una neurotoxina que puede absorberse a través de la piel. Use el equipo de protección adecuado, como guantes, abrigos de laboratorio y gafas de seguridad, para minimizar el riesgo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Engineering

Ingeniería

En este video, describimos la técnica de microscopía de reflexión de interferencia (IRM) para visualizar microtúbulos que crecen en una superficie de cubreobjetos en presencia de un tampón adecuado. Al iluminarse con luz incidente, la interfaz cubreobjetos-tampón y la interfaz tampón-microtúbulos reflejan la luz, lo que se combina para crear un patrón de interferencia, lo que permite la visualización de los microtúbulos como imágenes de alto contraste sobre un fondo brillante.

Microscopía de reflexión de interferencias para la visualización sin etiquetas de la dinámica de los microtúbulos

El ensamblaje y posicionamiento del huso mitótico dependen de las fuerzas combinadas generadas por la dinámica de los microtúbulos, las proteínas motoras y los reticulantes. Aquí presentamos nuestros métodos recientemente desarrollados en los que el confinamiento geométrico de gotas de emulsión esférica se utiliza para la reconstitución ascendente de husos mitóticos básicos.

La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

Aquí presentamos un protocolo para construir una bomba de jeringa de presión controlada para ser utilizado en aplicaciones de microfluídica. Esta bomba de la jeringuilla se hace de un cuerpo aditiva fabricado estándar hardware y electrónica de código abierto. El sistema resultante es bajo costo, fácil de construir y suministra fluido bien regulado para permitir investigación de microfluidos rápido.

Tridimensional de la impresión de materiales termoplásticos para crear automatizado de bombas de la jeringuilla con retroalimentación de Control para aplicaciones de microfluídica

Este protocolo es una guía para implementar microscopía de reflexión de interferencia en un microscopio de fluorescencia estándar para imágenes de alta velocidad, sin etiquetas y de alto contraste de microtúbulos mediante ensayos de superficies in vitro.

Implementación de microscopía de reflexión de interferencias para imágenes de microtúbulos sin etiquetas y de alta velocidad

Presentamos un protocolo para implementar la microscopía de interferencia-reflexión y la microscopía de reflexión-fluorescencia interna-total para la obtención simultánea de imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas a microtúbulos marcadas fluorescentemente.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Este estudio detalla la purificación de KIF1A (1-393LZ), un miembro de la familia de la quinesina-3, utilizando el sistema de expresión de baculovirus Sf9. El análisis de deslizamiento in vitro de una sola molécula y multimotor de estos motores purificados mostró propiedades de motilidad robustas comparables a los motores de lisado de células de mamíferos. Por lo tanto, el sistema Sf9-baculovirus es susceptible de expresar y purificar la proteína motora de interés.

Análisis de una sola molécula de motores de la familia Kinesin-3 superprocesiva purificada Sf9

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Este artículo presenta un protocolo para la formación de conjuntos de microtúbulos en forma de tactoides utilizando MAP65, un reticulante de microtúbulos a base de plantas, y PEG como agente de apiñamiento.

Autoensamblaje de tactoides de microtúbulos

El presente protocolo describe la cristalización de cristales de hielo microscópicos e hidratos de clatrato en dispositivos microfluídicos, lo que permite el intercambio de líquidos alrededor de los cristales formados. Esto proporciona posibilidades sin precedentes para examinar el proceso de cristalización y los mecanismos de unión de los inhibidores.

Un enfoque microfluídico para el estudio de la cristalización de hidratos de hielo y clatrato

Aquí se presentan métodos para preparar nemática activa a partir de microtúbulos y motores de quinesina, incluida la preparación y construcción de proteínas y el uso de pozos para el confinamiento nemático activo.

Formación, confinamiento y observación de nemática activa basada en microtúbulos

Este protocolo detalla el diseño y la fabricación de un dispositivo microfluídico adecuado para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos. La síntesis de técnicas de microfabricación, control de flujo automatizado y modelado computacional permite un sistema flexible ideal para sondear el citoesqueleto celular in vitro.

Desarrollo de un enfoque basado en la microfluídica para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos

Aprende a controlar velocidades de flujo en fluidos activos 3D basados en microtúbulos mediante temperatura. Este método permite regular in situ sin modificar el fluido ni el microscopio.

Control de las velocidades de flujo de fluidos activos 3D basados en microtúbulos mediante la temperatura

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