Name: Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo de cultivo 3D de matriz extracelular y adipocitos humanos para estudiar la diferenciación adipogénica y la regulación metabólica en tejido adiposo.

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Agradecemos a Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa y Retha Geiss por su ayuda en la coordinación del estudio. SeM fue realizado por University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Este proyecto fue apoyado por niH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) Administración de Veteranos VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopía electrónica de escaneo realizada por la Universidad de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La Figura 4 de este manuscrito fue publicada originalmente en Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, y ha sido reproducido con permiso de Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Para obtener permiso para reutilizar este material, visite http://global.oup.com/academic/rights.

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Los autores no declaran intereses contradictorios.

El modelo de cultivo de ECM-adipocitos proporciona una herramienta valiosa para disección de las funciones individuales de ECM y células en dictar fenotipo de tejido final. El protocolo de aislamiento ECM es bastante reproducible, pero se puede observar la variabilidad en el proceso de descelularización. El paso de deslipidación del Día 3 es un punto crítico en el protocolo. Al finalizar la extracción durante la noche, la solución de disolvente polar debe evidenciar la deslipidación de la matriz que se vuelve amarilla, m...

La matriz extracelular (ECM) no sólo proporciona un andamio mecánico para los tejidos, sino que también se involucra en una compleja conversación cruzada con las células que residen dentro de ella, regulando diversos procesos necesarios para la homeostasis tisular, incluida la proliferación celular, diferenciación, señalización y metabolismo1. Mientras que el ECM sano desempeña un papel esencial el mantenimiento de la función normal del tejido, ECM disfuncional se ha implicado en múltiples enfermedades2.
El tejido adiposo desempeña un papel importante en la patogénesis de la enfermedad metabólica. La obesidad se asocia con hipertrofia excesiva de adipocitos e hipoxia celular, defectos en el metabolismo celular de los adipocitos, y el retículo endoplasmático del tejido adiposo y el estrés oxidativo y la inflamación. Si bien no se entienden bien, estos procesos complejos conspiran para afectar la capacidad de amortiguación de nutrientes del tejido adiposo, lo que conduce al desbordamiento de nutrientes del tejido adiposo, toxicidad en múltiples tejidos y enfermedad metabólica sistémica3,4 ,5. La secuencia de eventos y mecanismos específicos que subyacen a la insuficiencia del tejido adiposo se entienden mal, pero se han implicado alteraciones en el tejido adiposo ECM. La composición de ECM se altera dentro del tejido adiposo en la obesidad humana y murina, con una mayor deposición de la proteína ECM junto con diferencias bioquímicas y estructurales cualitativas en el tejido adiposo ECM asociado con la enfermedad metabólica humana, incluyendo diabetes tipo 2 e hiperlipidemia6,7,8,9,10,11.
A pesar de estas observaciones, el papel del ECM del tejido adiposo en la mediación de la disfunción del tejido adiposo no está bien definido. Esto se debe en parte a la falta de modelos experimentales tractables que permiten la disección de las funciones específicas de ECM y adipocitos en la regulación de la función final del tejido adiposo. El cultivo de ECM-adipocyte simula mejor el entorno in vivo del tejido adiposo nativo en al menos dos aspectos. En primer lugar, el cultivo ECM proporciona un entorno molecular similar al tejido adiposo nativo, incluyendo colágenos nativos, elastinas y otras proteínas de matriz ausentes en el cultivo 2D estándar. En segundo lugar, se ha demostrado que el cultivo en plástico 2D altera el metabolismo de los adipocitos a través de efectos mecánicos debido a la disminución de la elasticidad del sustrato plástico12,que elimina el cultivo ECM.
Se han estudiado métodos para diseñar andamios biológicos mediante el aislamiento de ECM de la adiposa descelularizada y otros tejidos en el contexto de la medicina regenerativa y reconstructiva y la ingeniería de tejidos13,14, 15,16,17,18. Hemos publicado previamente una metodología en la que adaptamos estos métodos para desarrollar un modelo 3D in vitro del cultivo humano de ECM-adipocitos, utilizando ECM y células madre de adipocitos (preadipocitos) derivadas de tejidos adiposos viscerales humanos11. En el presente artículo, describimos estos métodos en detalle. El procedimiento de descelularización para el tejido adiposo humano es un proceso de cuatro días que implica tratamientos mecánicos y enzimáticos para eliminar células y lípidos, dejando un andamio biológico que mantiene las características del tejido del que se deriva. El ECM descelularizado apoya la diferenciación adipogénica de los preadipocitos humanos, y cuando se reconstituye con adipocitos, mantiene la microarquitectura y las características bioquímicas y específicas de la enfermedad del tejido adiposo intacto y participa en características del tejido adiposo nativo. Esta matriz se puede estudiar sola o resembrada con células, permitiendo el estudio de interacciones y interrelación entre los componentes celulares y extracelulares del tejido adiposo.

<table><tbody><tr><td>0,25 % de tripsina-EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>Cat#25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tubo criovial de 1,5</td><td>mL Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Cat#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU</td>. <td>Cat#89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m filtro de malla de nylon</td><td>Corning Inc., Corning, NY, EE. UU</td>. <td>Cat#352360</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE.</td><td>UU. Cat#D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironina sal de sodio (T3)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#T6397</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU</td>. <td>Cat#10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#I5879</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU.</td><td>Cat#10861-666</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica-antimicótica (ABAM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>Cat#15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#B4639</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU</td>. <td>Cat#A8806</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RLT</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>Cat#79216</td><td></td></tr><tr><td>Ciglitizona</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#C3974</td><td></td></tr><tr><td>Desoxi-D-glucosa, 2-[1,2-3H (N)]-</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>Cat#NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino, tipo II-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Fisher</td><td>Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Cat#BP231</td><td>Inflamable, cáustico</td></tr><tr><td>EDTA disódico</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Cat#BP118</td><td></td></tr><tr><td>Sal hemicálcica de ácido D-pantoténico</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#21210</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle modificado: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Cat#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc., Rey de Prusia, PA, EE. UU</td>. <td>Cat#DSP-MD.43</td> Portaobjetos de recuento de <td>células EVE inflamables</td></tr><tr><td>, NanoEnTek</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU.</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.</td><td>Cat#10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#G5882</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisalizana</td> cáustica <td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#440191</td> Solución de insulina humana <td>inflamable y cáustica</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#I9278</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU.</td><td>Cat#A415</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td> inflamable <td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU</td>. <td>Cat#I5627</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td> inflamable <td>Sigma-Aldrich, Inc. San Luis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. San Luis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lipasa de páncreas porcino, tipo VI-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H2O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. San Luis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Cat#S233</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Cat#A661</td><td></td></tr><tr><td>Corte óptimo temperatura (OCT) compuesto</td><td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, Reino Unido</td><td>Aceite de AGR1180</td><td></td>Cat</tr><tr><td># Solución Red-O (ORO)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU</td>. Kit de tinción Red-O de aceite <td>Cat#O1391</td><td></td></tr><tr><td></td><td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, EE. UU.</td><td>Cat#KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#201030</td><td>Cáustico</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#93482</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato cáustico (PBS)</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Cat#SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasa A del páncreas bovino, tipo III-A</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEasy Fibroso Tissue MiniKit</td><td>Qiagen, Hilden, Alemania</td><td>Cat#74704</td><td></td></tr><tr><td>Fluido de centelleo</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Cat#SX18</td><td></td></tr><tr><td>Contador de centelleo Tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, pinzas, estéril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato de Sorensen</td><td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td><td>CAS #: 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo T-150</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU.</td><td>Cat#10062-864</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra de expresión génica TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA EE. UU</td>. <td>Cat#4369016</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td></td><td></td><td></td>orbital a temperatura</tr><tr><td>controlada Homogeneizador de tejidos, BeadBug Homogeneizador de microtubos</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Cat#D1030</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, EE. UU.</td><td>Cat#T3309</td><td></td></tr><tr><td>Kit de determinación de triglicéridos</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU</td>. <td>Cat#TR0100</td><td></td></tr><tr><td>Tinción azul de tripano, 0,4 %</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, EE. UU</td>. <td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>Cat#17101015</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman Reeve Angel, Grado 201, 150 mm</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, EE. UU</td>. <td>Cat#WHA5201150</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3d humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica matrix-cell

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

La matriz extracelular (ECM) desempeña un papel central en la regulación de la homeostasis tisular, participando en la conversación cruzada con las células y regulando múltiples aspectos de la función celular. El ECM desempeña un papel particularmente importante en la función del tejido adiposo en la obesidad, y las alteraciones en la deposición y composición del ECM del tejido adiposo se asocian con enfermedades metabólicas en ratones y humanos. Los modelos in vitro tractables que permiten la disección de las funciones del ECM y las células para contribuir al fenotipo tisular global son escasos. Describimos un novedoso modelo 3D in vitro del cultivo humano ECM-adipocyte que permite estudiar las funciones específicas del ECM y los adipocitos en la regulación del fenotipo metabólico del tejido adiposo. El tejido adiposo humano se descelulariza para aislar la ECM, que posteriormente se repobla con preadipocitos que luego se diferencian dentro del ECM en adipocitos maduros. Este método crea construcciones ECM-adipocitos que son metabólicamente activas y retienen características de los tejidos y pacientes de los que se derivan. Hemos utilizado este sistema para demostrar la conversación cruzada ECM-adipocyte específica de la enfermedad en el tejido adiposo humano. Este modelo de cultivo proporciona una herramienta para disección de las funciones de la ECM y los adipocitos en la contribución al fenotipo metabólico del tejido adiposo global y permite el estudio del papel del ECM en la regulación de la homeostasis del tejido adiposo.

La preparación de ECM de tejido adiposo, la sembración con preadipocitos y la diferenciación in vitro en adipocitos maduros dan lugar a claros cambios morfológicos secuenciales en el tejido que permiten la evaluación visual del progreso a lo largo del protocolo(Figura 1) . Los preadipocitos utilizados para la semilla del ECM se aíslan mediante la digestión de la colagenasa de muestras de IVA separadas(Figura 2). La microscopía el...

Describimos un sistema de cultivo in vitro de matriz-adipocitos extracelulares humanos 3D que permite la disección de las funciones de la matriz y los adipocitos en contribuir al fenotipo metabólico del tejido adiposo.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Nuestro protocolo demuestra que el ECM puede promover la diferenciación adipogénica en ausencia de mediadores adipogénicos clásicos y es el primero en demostrar la regulación específica de la enfermedad del metabolismo celular por el ECM. Nuestra técnica proporciona una herramienta para diseccionar las funciones del ECM y los adipocitos en el metabolismo del tejido adiposo y permitir el estudio del papel del ECM en la regulación de la homeostasis del tejido adiposo. En comparación con el cultivo celular 2D estándar, nuestro modelo 3D permite un examen más robusto y la disección de las conversaciones cruzadas entre los adipocitos y el ECM del tejido adiposo en el contexto de la diabetes tipo 2.Recomendamos comenzar con muestras más pequeñas para medir qué tan bien está celularizado. Tenga en cuenta que hay variabilidad interpatricial en cómo crecen las células y qué tan bien se descelulariza el tejido. Es importante observar el tejido antes y después de cada paso para asegurarse de que el tejido se está descelularizando y para entender las posibles diferencias entre las muestras.Después de obtener tejido adiposo visceral o IVA de la cirugía, prepararlo para el almacenamiento mediante la adición de 5-10 gramos del tejido a 15-25 mililitros de solución tampón de congelación en un tubo cónico de 50 mililitros. Sumerja completamente la muestra y guárdela a menos 80 grados Centígrados hasta la descelularización. Para el aislamiento de preadipocitos, coloque dos gramos de una muestra fresca de IVA intacto en 20 mililitros de solución de colagenasa tipo II, luego inserte tijeras estériles en el tubo y picar a fondo el tejido.Una vez picado a una lechada fina, incubarlo en la solución de colagenasa a 37 grados Centígrados en un agitador orbital durante 60 minutos. Después de la incubación, filtre el resultante digerido a través de una malla de nylon de 100 micrómetros en un tubo cónico fresco de 50 mililitros. El digerido debe ser un líquido amarillo-naranja con viscosidad moderada y una pequeña cantidad de hebras residuales de tejido no digerido.Centrifugar la muestra a 270 veces g durante 10 minutos, retire el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en dos mililitros de solución de lisiones RBC 1X con una pipeta. Incubar la solución durante un minuto a 25 grados centígrados, luego añadir 10 mililitros de 15%FBS DMEM F12 y centrifugarlo a 270 veces g durante 10 minutos. Para preparar el ECM, congele/descongele la muestra de IVA previamente congelada a 37 grados centígrados incubando en un baño de agua precalentado durante 20 minutos con agitación manual suave y periódica.Una vez descongelado, transfiera el tejido de nuevo a menos 80 grados Celsius durante 20 minutos y repita el proceso de congelación/descongelación tres veces terminando con el descongelación. Utilice fórceps estériles para transferir la muestra de IVA a un tubo cónico fresco de 50 mililitros que contenga 15-25 mililitros de solución enzimática 1 asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida. Luego incubar durante la noche a 37 grados celsius mientras se agita a 130 RPM.Al día siguiente, lave la muestra tres veces con 15-25 mililitros de solución tampón de enjuague, vertiendo la solución después de cada lavado. Transfiera la muestra a un tubo fresco de 50 mililitros con 15-25 mililitros de solución enzimática 2 y incubarlo durante la noche. Repita los lavados con la solución tampón de enjuague y transfiera la muestra a un tubo fresco que contenga 15-25 mililitros de solución de extracción de disolvente polar.Incubar la muestra durante la noche mientras se agita. Después de la incubación con la solución de disolvente polar, es importante examinar la muestra para la eliminación de lípidos. Si no se elimina la mayor parte del lípido, puede ser necesario repetir este paso.Se puede utilizar un tiempo de incubación más corto. Después de la incubación, transfiera la muestra a un tubo fresco que contenga 15-25 mililitros de solución tampón de enjuague y lave la muestra tres veces en la coctelera. A continuación, lave la muestra tres veces con una solución de etanol al 70%, vertiendo el etanol después de cada lavado.Lave la muestra una vez con la solución de almacenamiento y, a continuación, utilice fórceps estériles para transferirla a un tubo nuevo que contenga 15-25 mililitros de solución de almacenamiento asegurándose de sumergirla completamente. La muestra se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante un mes. El isopropanol y el etanol son inflamables y deben estar a temperatura ambiente y desecharse en residuos inflamables.Los residuos humanos deben eliminarse por separado de los residuos biopeligos habituales. Transfiera los fragmentos de ECM almacenados a pozos individuales de una placa de 24 pocillos con fórceps estériles añadiendo tantos fragmentos como sea necesario para los ensayos posteriores planificados. Lávelos tres veces con 500 microlitros de 70% de etanol en un agitador orbital, luego rehidratarlos lavándolos tres veces con PBS.Utilice tijeras estériles para cortar el ECM en fragmentos de 100 miligramos. Coloque cada fragmento en un pozo de una placa de 24 pozos e incubar la placa a 25 grados Celsius durante 15 minutos para permitir que el exceso de PBS extruya de los fragmentos. A continuación, retire cuidadosamente cualquier PBS sobrante de los pozos con una pipeta.Siembra cada fragmento con 20 microlitros de suspensión celular de preadipocitos pipeteando las células directamente en el ECM. Coloque la punta de la pipeta en el ECM y expela suavemente en el centro de la matriz asegurándose de que la suspensión de la célula no se desborde y termine en la parte inferior del pozo. Si la suspensión de la celda se desborda desde el ECM, retire la punta de la pipeta de esa ubicación e insértela en otra parte del ECM.Después de la siembra celular, incubar el ECM durante 40 minutos a 37 grados centígrados. Llene cada pozo con 500 microlitros de medios de crecimiento para cubrir los fragmentos de ECM sin semillas. Cultivo de las células a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 72 horas.Después de 72 horas, aspira cuidadosamente los medios de crecimiento sin alterar el fragmento de ECM. Añadir 500 microlitros de medios de diferenciación y cultivar las células durante 14 días cambiando los medios cada dos a tres días. Compruebe la diferenciación mediante microscopía de luz.Las células acumularán lípidos, se volverán de color marrón-amarillo y se volverán más esféricas a medida que se diferencian. La preparación del ECM del tejido adiposo, la siembra con preadipocitos y la diferenciación in vitro en adipocitos maduros se monitorizaron con microscopía electrónica de barrido que reveló la decelularización del ECM y la posterior recapitulación de lípidos que contienen adipocitos tras la resembración y diferenciación. El colágeno 1 inmunohistoquímica específica de ECM decelularizado mostró mantenimiento de la microarquitectura de colágeno, mientras que la tinción de aceite rojo-O de construcciones de ECM-adipocitos 3D vivos y fijos mostró lípidos que contienen adipocitos.Los adipocitos diferenciados en ECM se examinaron para detectar genes adipogénicos utilizando PCR cuantitativa en tiempo real, lo que demostró que estos genes están regulados al alza en las células diferenciadas en relación con los preadipocitos indiferenciados cultivados en ECM. Se muestra la diferencia completa en los niveles de transcripción. Cuatro combinaciones de ECM y adipocitos de sujetos diabéticos y nondiabéticos fueron sometidos a fenotipado metabólico.La absorción de glucosa deteriorada en la función lipolítica se descubrió en construcciones de tejidos diabéticos. Es importante destacar que se encontró que el ECM no ndiabético rescata la absorción de glucosa estimulada por insulina y la capacidad lipolítica en adipocitos diabéticos. La contaminación de los preadipocitos aislados, el tejido decelularizado y el ECM reseedado no es infrecuente.La esterilidad debe mantenerse diligentemente a lo largo del protocolo.

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Aprende a desarrollar un modelo de cultivo 3D de matriz extracelular y adipocitos humanos para estudiar la diferenciación adipogénica y la regulación metabólica en tejido adiposo.

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