Análisis de moléculas complejas y sus reacciones en superficies por medios de espectrometría de masas de desorción/ionización inducida por racimos
1 de marzo de 2020
Los grupos neutros SO2 de baja energía cinética (< 0,8 eV/constituyente) se utilizan para desorb moléculas superficiales complejas como péptidos o lípidos para su posterior análisis mediante espectrometría de masas utilizando un espectrómetro de masas trampa de iones. No se requiere ninguna preparación especial de la muestra, y es posible la observación en tiempo real de las reacciones.
La ionización de desorción inducida por clústeres SO2 neutros que llamamos en corto DINeC, es un método de ionización de desorción suave y eficiente. Lo utilizamos entre otros para la espectrometría de masas de biomoléculas, como péptidos y proteínas. Como DINeC, moléculas de desorción intactas de las superficies de la muestra, los cambios químicos sutiles en estas moléculas se detectan fácilmente en los espectros de masa.
El proceso se ilustra en la siguiente simulación. Los clústeres entrantes se rompen a través del impacto de la superficie en clúster. El dipéptido isótopo superficial se disuelve en uno de los fragmentos del racimo y se desorta por este proceso.
En el experimento, el haz de racimos SO2 se produce a través de la expansión supersónica a partir de una boquilla pulsada. Las moléculas que se disuelven e ionizan durante el impacto de la superficie del racimo se transfieren a la trampa de iones para la espectrometría de masas. Los espectros de masa típicos solo muestran picos en los valores establecidos MO de la molécula intacta.
Demostrando el procedimiento serán Karolin Bomhardt, y Pascal Schneider, dos estudiantes de doctorado en mi laboratorio. Para muestras estándar, corte los sustratos de obleas de silicio con un espesor de aproximadamente 0,5 a uno milímetros en trozos de uno por un centímetro cuadrado. Limpie los sustratos de silicio en un baño de ultrasonido de etanol y acetona durante 15 minutos cada uno.
Seque los sustratos en una corriente de gas nitrógeno seco. A continuación, deje caer de cinco a 30 microlitros de la solución de muestra en el sustrato. Dependiendo de la presión de vapor del disolvente, deje que la muestra se seque en condiciones ambientales o en un desecador hasta que se haya evaporado todo el disolvente y se haya formado una película seca.
Considere el esquema de preparación más simple. Por ejemplo, para la investigación de la tinta del resaltador, simplemente dibuje un punto en la superficie del sustrato. Monte las muestras en el portacuchillas con cinta adhesiva o abrazaderas apretadas por tornillos.
Además, monte una muestra de referencia, como una película de micrómetros de espesor de angiotensina II, en el soporte de la muestra. A continuación, pulse Bloqueo de carga de ventilación para ventilar el sistema de bloqueo de carga. Espere cinco minutos o hasta que se haya alcanzado la presión atmosférica.
Abra el bloqueo de carga y monte el soporte de muestra. Cierre el bloqueo de carga y bombee la cámara de bloqueo de carga a una presión inferior a dos veces 10 hasta las cinco milibares negativas. Abra la válvula a la cámara DINeC y transfiera el portacuchillas con la varilla de transferencia al manipulador principal.
Fije el soporte de muestra al manipulador. Retirar la varilla de transferencia y cerrar la válvula entre el bloqueo de carga y la cámara DINeC. Abra la válvula entre el cilindro de gas y la boquilla.
Ajuste la presión de la mezcla de dióxido de azufre y gas helio en el contorno del sistema de mezcla de gas a 15 bar. Establezca la posición del manipulador en la posición de la muestra de referencia. Para medir espectros de masa catiónica, ajuste el sesgo de la muestra y la rejilla en más de 40 voltios, y más siete voltios respectivamente.
Para conducir la boquilla pulsada y el espectrómetro de masas de trampa iónica, ajuste el generador de funciones externas a dos Hertz. Con el generador de retardo, ajuste el retardo de tiempo entre la señal de trampa clara de la trampa de iones y la señal de disparo para la boquilla pulsada a cinco milisegundos. En el software de control Bruker, en la página Modo de la ventana de diálogo principal, seleccione Resolución mejorada para el modo de escaneo.
Escriba M sobre Z 50 a 3000 para el rango, escriba 0,1 milisegundos para el tiempo de acumulación, escriba 10 ciclos para el promedio y, para la polaridad, seleccione positivo para la medición de espectros de masa catiónica y negativo para la medición de espectros aniónicos. Una vez que se ha alcanzado una presión inferior tres veces 10 a la negativa de seis milibares en la cámara DINeC, inicie la medición. Establezca el valor M sobre Z en la masa respectiva para seguir la señal de cromatograma dependiente del tiempo.
Pulse Operar en el software de control. Comience a grabar las mediciones pulsando el botón Grabar. Mida el espectro de prueba de una muestra de referencia, como la angiotensina II durante unos 300 segundos.
Optimice la intensidad de la señal ajustando el retardo de tiempo entre la señal de trampa clara y la señal que activa la boquilla pulsada. Con el retardo de tiempo optimizado, mueva el manipulador a la posición de la muestra que se va a medir. Haga clic en el botón Grabar para adquirir espectros de masas durante el intervalo de tiempo de interés.
Una vez finalizada la medición, cargue el conjunto de datos respectivo en el programa análisis de datos como se muestra aquí para la medición de referencia. Seleccione el intervalo de tiempo de interés en el cromatograma con el botón derecho del ratón. El espectro medio se muestra en una ventana separada.
Haga clic en Exportar como archivo ASCII para exportar el espectro como un archivo de datos para su posterior procesamiento en un programa de elección. El espectro de masa DINeC de una muestra de angiotensina II cambió con el tiempo a medida que la muestra se calentaba a unos 140 grados centígrados. Una vez que la temperatura alcanzó el valor final, el pico de la molécula protinada atacada en M sobre Z igualando 1047 cayó y se observaron nuevos picos.
El proceso se resume en estos tres gráficos. Los picos adicionales en M sobre Z iguales a 932, 1012 y 1029 fueron bien observados. El análisis de la cinética de reacción demuestra que la entidad con M sobre Z igual a 1029 es un intermedio que se descompuso aún más en fragmentos más pequeños a medida que la intensidad aumentó primero y luego disminuyó.
Las características más importantes de DINeC son la naturaleza suave del proceso de desorción, la eficiencia y la alta sensibilidad de la superficie. Todos ellos se unen con los bajos requisitos con respecto a la preparación de la muestra. Por lo tanto, DINeC se puede aplicar a una amplia variedad de muestras diferentes que van desde materiales de corteza orgánica hasta adsorbatos de superficie complejas en la región de la sub monocapa.
En todos los casos, se puede obtener información química completa en tiempo real.
Visión general
Este estudio presenta un nuevo método de ionización por desorción usando cúmulos neutros de SO2, denominado DINeC, para el análisis por espectrometría de masas de biomoléculas. La técnica permite la observación en tiempo real de cambios químicos en péptidos y proteínas sin una preparación extensa de muestras.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Espectrometría de masas
- Análisis biomolecular
- Química de superficies
Antecedentes
- DINeC es un método de ionización por desorción suave.
- Permite el análisis de moléculas complejas de superficie.
- El monitoreo de reacciones en tiempo real es posible.
- Se requiere una preparación mínima de muestras.
Propósito del estudio
- Demostrar la efectividad de DINeC para la espectrometría de masas.
- Analizar cambios químicos sutiles en biomoléculas.
- Proporcionar un protocolo detallado para la preparación de muestras y la medición.
Métodos utilizados
- Producción de cúmulos de SO2 mediante expansión supersónica.
- Desorción de moléculas a través del impacto de la superficie del cúmulo.
- Transferencia de moléculas ionizadas a un espectrómetro de masas con trampa de iones.
- Adquisición y análisis de datos en tiempo real de espectros de masas.
Principales resultados
- Los espectros de masas muestran picos moleculares intactos.
- Surgen nuevos picos a medida que aumenta la temperatura durante el análisis.
- La cinética de reacción revela la formación de especies intermedias.
- DINeC demuestra alta sensibilidad y eficiencia en la superficie.
Conclusiones
- DINeC es un método versátil aplicable a varias muestras.
- Proporciona información química integral en tiempo real.
- Los bajos requisitos de preparación de muestras del método aumentan su utilidad.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
DINeC enables soft, matrix-free desorption/ionization of complex biomolecules from surfaces, supporting real-time monitoring of chemical modifications without extensive sample preparation. This capability enhances target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, fragmentation-free mass spectra of peptides and proteins at sub-monolayer sensitivity. The method’s compatibility with ion trap MSn allows for detailed structural elucidation, improving predictive confidence in lead identification and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting intact molecular ions and subtle chemical changes in peptides and proteins.
- Operational Value: Supports biological de-risking through soft desorption that preserves labile modifications, reducing false negatives in target engagement studies.
- Predictive Value: Provides quantitative surface coverage data down to 0.1% of a monolayer, aiding in portfolio triage based on target abundance and modification status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers matrix-free, quantitative mass spectra that enable reliable detection of surface-bound analytes without ionization suppression.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via consistent cluster beam generation and ion trap transfer, minimizing run-to-run variability.
- Scalability: Facilitates platform reuse across diverse sample types, from organic extracts to engineered surfaces, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time observation of surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition, allowing kinetic analysis of biomolecular stability.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing continuous chemical information from surface adsorbates to bulk molecules under identical analytical conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by identifying degradation intermediates and reaction pathways that may impact drug candidate stability or efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
DINeC integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for studies requiring surface-sensitive, real-time monitoring of biomolecular interactions or modifications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting post-translational modifications and ligand-induced conformational changes on surfaces.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible desorption of intact molecules, providing quantitative outputs for hit confirmation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Delivers high-resolution mass spectra and MSn capabilities that allow teams to compare molecular states, modification sites, and fragmentation patterns across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by monitoring time-dependent chemical changes in peptides and proteins under controlled thermal or chemical stress.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical capability across departments, reducing redundant method development and enabling cross-project data consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by preserving molecular integrity and enabling detection of labile species that may be lost in harsher ionization methods.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized cluster beam parameters and minimal sample handling, reducing technical variance.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating matrix requirements and enabling direct analysis of native samples, lowering consumable costs and preparation time.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through real-time kinetic data on surface reactions, supporting early identification of liabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cluster beam generation, ion trap operation, and surface science principles for optimal setup and data interpretation.
- Needs access to a pulsed nozzle system, sulfur dioxide and helium gas handling infrastructure, and a compatible ion trap mass spectrometer with MSn capabilities.
- Demands cross-team standardization of sample mounting, substrate cleaning, and drying protocols to ensure surface homogeneity and reproducible desorption efficiency.
- Involves adaptation considerations when transitioning from model peptides to complex native samples or heterogeneous surfaces, necessitating surface coverage optimization.
- Includes practical limitations such as the need for ultra-high vacuum conditions and potential cluster fragmentation effects at higher impact energies, which must be controlled to maintain soft desorption.
