Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras
October 25th, 2019
Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.
Las bacterias intracelulares secretan proteínas efectoras en el huésped que pueden manipular vías biológicas para promover la supervivencia de patógenos. Revelar los objetivos anfitriones de los efectores es esencial para entender patógenos intracelulares como Chlamydia trachomatis. La toxicidad de la levadura y las pantallas supresoras pueden proporcionar información clave sobre el objetivo biológico natural de las proteínas de efector bacteriano y pueden ser particularmente útiles cuando se desconoce un compañero de unión.
Aquí demostramos la toxicidad de la levadura y los ensayos supresores para el cribado de proteínas efectora Chlamydia trachomatis, pero esta técnica también se ha utilizado para caracterizar los efectos efectores de Legionella pneumophila y Coxiella burnetii. Comience por inocular cinco mililitros de caldo de abandono único con la única colonia de levadura transformada con la proteína efectora que contiene plásmido. Utilice la levadura transformada con el vector solo como control negativo e incubar el inóculo durante la noche a 30 grados centígrados mientras agita.
Al día siguiente, agregue 180 microlitros de agua estéril al A2 a través de pozos A6 de una placa de 96 pozos. Vórtice el cultivo nocturno y añadir 180 microlitros de levadura al pozo A1. A continuación, diluir en serie la levadura en los pozos con agua. Utilice una pipeta multicanal para detectar cinco microlitros de cada dilución en una sola glucosa desinstado y placas de agar de gata desinstado única e incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 horas.
Después de la incubación, evaluar visualmente la toxicidad comparando el crecimiento de la levadura expresando la proteína efectora cultivada en los medios que contienen gactosa con el crecimiento de levadura expresando el vector solo. Inocular 100 mililitros del caldo de abandono único con un mililitro del caldo de levadura previamente preparado e incubarlo durante 16 a 24 horas a 30 grados centígrados con temblores a 150 RPM. Al día siguiente, agregue los 100 mililitros enteros del cultivo nocturno a 900 mililitros de caldo de abandono único precalentó e incubar el matraz durante cuatro a cinco horas a 30 grados centígrados mientras agita.
Después de la incubación, pele el cultivo a 6.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 250 mililitros de agua estéril. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante.
Luego resuspender el pellet en 250 mililitros de un acetato de litio mililolar. Pele el cultivo por centrifugación, retire el acetato de litio y resusppend el pellet en 9,6 mililitros de 50%PEG 3350. A continuación, agregue reactivos de transformación como se describe en el manuscrito y ajuste el volumen a 15 mililitros con agua estéril invirtiendo suavemente para mezclar.
Incubar la mezcla a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Luego agregue 750 microlitros de DMSO e incubar en un baño de agua a 42 grados Celsius durante otros 30 minutos. Agregar el DMSO antes del choque térmico es crucial para lograr una alta eficiencia de transformación.
Después de la incubación, peletizar la levadura centrifugando a 3.000 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 10 mililitros de agua estéril y luego repita la centrifugación para peletizar la levadura. Resuspender el pellet en ocho mililitros de agua.
Determine la eficiencia de la transformación diluyendo la muestra de uno a 10 y enchatando 100 microlitros de cada dilución en un agar de doble deserción. A continuación, la placa 200 microlitros de la muestra en placas de agar de gatactosa de doble deserción e incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 a 96 horas o hasta que aparezcan colonias. Una vez que las colonias hayan aparecido, parchearlas en el agar de gatactosa deserción doble e incubarlos durante otras 24 a 48 horas.
Utilice parte del parche para inocular cinco mililitros de caldo de goteo doble e incubar el inóculo durante la noche a 26 grados centígrados con temblores a 150 RPM. Al día siguiente, agregue 180 microlitros de agua estéril a cinco pozos de una placa de 96 pozos comenzando con el pozo A2. Vortex la mezcla de cultivo durante la noche. Añadir 180 microlitros de levadura al pozo A1 y diluir en serie utilizando el agua en los pozos A2 a A6. Detecte cinco microlitros de cada dilución en una sola deserción de glucosa y placas de ga gatactosa desinstado únicas, asegurándose de incluir el efector tóxico solo como control.
Incubar las placas a 30 grados celsius durante 48 horas y luego comparar el crecimiento de la levadura con el efector tóxico solo con el crecimiento de la levadura con el supresor potencial. Para confirmar los supresores que han demostrado una disminución de la toxicidad en comparación con el efector tóxico solo, aísle el plásmido de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y vuelva a transformarlo en la levadura tóxica. Inocular caldo de glucosa de doble deserción con una colonia de la placa de transformación.
Incubarlo durante la noche y detectarlo en el agar de doble deserción glucosa y ga gatasa para confirmar la supresión de la toxicidad. Antes de realizar la pantalla supresora de levadura, las proteínas efectoras de interés se probaron para detectar toxicidad en levaduras. La proteína de interés se expresó en la levadura bajo el control de un promotor inducible de ga gactosa y el crecimiento de la ga gactosa se comparó con el crecimiento de la glucosa.
Cuando CT229 se probó para la toxicidad, se observaron colonias más pequeñas y supresión del crecimiento. Idealmente, se debe observar una disminución de dos a tres registros para proceder con las pantallas supresoras de levadura. La pantalla supresora se llevó a cabo transformando la cepa tóxica con la biblioteca genómica de levadura pYAP 13 y enchapando los transformantes en el agar gactosa.
Los clones supresores obtenidos fueron vistos en el agar de gactosa de abandono doble para confirmar la supresión de la toxicidad. Los supresores pSup1 y pSup2 suprimieron la toxicidad de la proteína efectora, mientras que pSup3 no. Estos procedimientos requieren una cuidadosa atención al detalle, además de los trabajos preparatorios críticos, incluyendo tener grandes cantidades de medios y placas listos antes de realizar el experimento.
Una vez identificados los supresores, se pueden realizar experimentos para verificar las interacciones con el efector de interés, incluyendo derribos, colocación de inmunofluorescencia, eliminación del efector o derribo de los factores del host identificados en las pantallas. El desarrollo de esta técnica para los efectores de la clamidia ha permitido la caracterización preliminar acelerada de las proteínas efectora y ha ayudado a centrar nuestros esfuerzos en el esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes que median las interacciones de los patógenos del huésped.
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Visión general
Este artículo describe un método para identificar vías del huésped objetivo de proteínas efectoras bacterianas tóxicas utilizando pantallas de toxicidad y supresores de levadura. Comprender estas interacciones es crucial para abordar la patogénesis molecular en bacterias intracelulares como Chlamydia trachomatis.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Interacciones patógeno-huésped
- Biología celular
Antecedentes
- Los patógenos bacterianos secretan proteínas efectoras que manipulan las vías biológicas del huésped.
- Identificar estas vías es esencial para comprender las enfermedades causadas por bacterias intracelulares.
- Los modelos de levadura pueden usarse para detectar los efectos de estas proteínas efectoras.
- Este método se ha aplicado a varios patógenos, incluida Chlamydia trachomatis.
Propósito del estudio
- Elucidar las vías del huésped objetivo de las proteínas efectoras bacterianas tóxicas.
- Proporcionar información sobre los mecanismos moleculares de la patogénesis.
- Demostrar la utilidad de las pantallas de toxicidad y supresores de levadura en esta área de investigación.
Métodos utilizados
- Inoculación de levadura transformada con plásmidos de proteínas efectoras.
- Uso de controles negativos con levadura transformada solo con vector.
- Incubación de cultivos a 30 grados Celsius mientras se agita.
- Análisis del crecimiento de la levadura y la toxicidad para identificar interacciones de proteínas efectoras.
Resultados principales
- Identificación exitosa de las vías del huésped afectadas por las proteínas efectoras de Chlamydia trachomatis.
- Demostración de la efectividad de las pantallas de levadura en el estudio de efectores bacterianos.
- Información sobre los objetivos biológicos de varios patógenos bacterianos.
- Posibles aplicaciones de este método para otras bacterias intracelulares.
Conclusiones
- Las pantallas de toxicidad y supresores de levadura son herramientas valiosas para estudiar las proteínas efectoras bacterianas.
- Este enfoque mejora la comprensión de las interacciones patógeno-huésped.
- La investigación adicional utilizando este método podría conducir a nuevas estrategias terapéuticas contra infecciones bacterianas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Identifying host pathways manipulated by bacterial effector proteins is critical for de-risking target validation in anti-infective discovery. Yeast toxicity and suppressor screens provide a functional, phenotype-driven approach to pinpoint dysregulated host biology when traditional binding assays fail. This enables mechanistic insight into pathogen virulence factors, supporting early-stage target confidence and portfolio prioritization for intracellular pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking effector toxicity to specific host pathways through suppressor identification.
- Operational Value: Enables functional target validation when effector proteins lack detectable binding partners or interact with multifunctional host proteins.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing pathway-level perturbations rather than isolated protein interactions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated yeast strains expressing effector proteins for reproducible toxicity screening.
- Quantitative Output: Measures growth defect magnitude (e.g., two- to three-log reduction) as a threshold for proceeding to suppressor screens.
- Scalability: Uses 96-well formats and serial dilution spotting for high-throughput suppressor clone evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to intracellular pathogens like Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila, and Coxiella burnetii, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Identifies host factors that, when suppressed, rescue effector toxicity, enabling follow-up validation via pull-downs, colocalization, or knockout studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses efforts on effectors with confirmed pathway modulation, reducing late-stage biological attrition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to inform lead identification by connecting effector expression to host pathway disruption, enabling data-driven target selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking effector expression to growth defects in yeast, indicating pathway interference.
- Screening: Delivers assay-ready toxic strains and suppressor libraries for identifying host factors that rescue phenotype.
- Analytics: Provides quantitative growth readouts on selective media to compare effector toxicity and suppressor efficacy.
- Translational Research: Connects yeast-identified suppressors to mammalian homologs for preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening effector libraries across multiple intracellular pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through functional pathway interrogation.
- Operational Value: Standardized toxicity and suppressor screening workflows with defined growth thresholds.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by filtering effectors lacking measurable host pathway impact.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of effector targets based on validated pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular cloning, galactose-inducible expression, and plasmid library transformation.
- Dependent on instrumentation for sterile culture handling, centrifugation, and incubation at 30°C with shaking.
- Necessitates cross-team standardization of media preparation, plate spotting, and toxicity scoring criteria.
- Adaptation considerations include promoter compatibility, effector toxicity thresholds, and suppressor validation in mammalian systems.
- Practical limitations include the need for large volumes of media and plates, and potential false negatives if effector expression is toxic to yeast library strains.
