Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras
25 de octubre de 2019
Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.
Las bacterias intracelulares secretan proteínas efectoras en el huésped que pueden manipular vías biológicas para promover la supervivencia de patógenos. Revelar los objetivos anfitriones de los efectores es esencial para entender patógenos intracelulares como Chlamydia trachomatis. La toxicidad de la levadura y las pantallas supresoras pueden proporcionar información clave sobre el objetivo biológico natural de las proteínas de efector bacteriano y pueden ser particularmente útiles cuando se desconoce un compañero de unión.
Aquí demostramos la toxicidad de la levadura y los ensayos supresores para el cribado de proteínas efectora Chlamydia trachomatis, pero esta técnica también se ha utilizado para caracterizar los efectos efectores de Legionella pneumophila y Coxiella burnetii. Comience por inocular cinco mililitros de caldo de abandono único con la única colonia de levadura transformada con la proteína efectora que contiene plásmido. Utilice la levadura transformada con el vector solo como control negativo e incubar el inóculo durante la noche a 30 grados centígrados mientras agita.
Al día siguiente, agregue 180 microlitros de agua estéril al A2 a través de pozos A6 de una placa de 96 pozos. Vórtice el cultivo nocturno y añadir 180 microlitros de levadura al pozo A1. A continuación, diluir en serie la levadura en los pozos con agua. Utilice una pipeta multicanal para detectar cinco microlitros de cada dilución en una sola glucosa desinstado y placas de agar de gata desinstado única e incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 horas.
Después de la incubación, evaluar visualmente la toxicidad comparando el crecimiento de la levadura expresando la proteína efectora cultivada en los medios que contienen gactosa con el crecimiento de levadura expresando el vector solo. Inocular 100 mililitros del caldo de abandono único con un mililitro del caldo de levadura previamente preparado e incubarlo durante 16 a 24 horas a 30 grados centígrados con temblores a 150 RPM. Al día siguiente, agregue los 100 mililitros enteros del cultivo nocturno a 900 mililitros de caldo de abandono único precalentó e incubar el matraz durante cuatro a cinco horas a 30 grados centígrados mientras agita.
Después de la incubación, pele el cultivo a 6.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 250 mililitros de agua estéril. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante.
Luego resuspender el pellet en 250 mililitros de un acetato de litio mililolar. Pele el cultivo por centrifugación, retire el acetato de litio y resusppend el pellet en 9,6 mililitros de 50%PEG 3350. A continuación, agregue reactivos de transformación como se describe en el manuscrito y ajuste el volumen a 15 mililitros con agua estéril invirtiendo suavemente para mezclar.
Incubar la mezcla a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Luego agregue 750 microlitros de DMSO e incubar en un baño de agua a 42 grados Celsius durante otros 30 minutos. Agregar el DMSO antes del choque térmico es crucial para lograr una alta eficiencia de transformación.
Después de la incubación, peletizar la levadura centrifugando a 3.000 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 10 mililitros de agua estéril y luego repita la centrifugación para peletizar la levadura. Resuspender el pellet en ocho mililitros de agua.
Determine la eficiencia de la transformación diluyendo la muestra de uno a 10 y enchatando 100 microlitros de cada dilución en un agar de doble deserción. A continuación, la placa 200 microlitros de la muestra en placas de agar de gatactosa de doble deserción e incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 a 96 horas o hasta que aparezcan colonias. Una vez que las colonias hayan aparecido, parchearlas en el agar de gatactosa deserción doble e incubarlos durante otras 24 a 48 horas.
Utilice parte del parche para inocular cinco mililitros de caldo de goteo doble e incubar el inóculo durante la noche a 26 grados centígrados con temblores a 150 RPM. Al día siguiente, agregue 180 microlitros de agua estéril a cinco pozos de una placa de 96 pozos comenzando con el pozo A2. Vortex la mezcla de cultivo durante la noche. Añadir 180 microlitros de levadura al pozo A1 y diluir en serie utilizando el agua en los pozos A2 a A6. Detecte cinco microlitros de cada dilución en una sola deserción de glucosa y placas de ga gatactosa desinstado únicas, asegurándose de incluir el efector tóxico solo como control.
Incubar las placas a 30 grados celsius durante 48 horas y luego comparar el crecimiento de la levadura con el efector tóxico solo con el crecimiento de la levadura con el supresor potencial. Para confirmar los supresores que han demostrado una disminución de la toxicidad en comparación con el efector tóxico solo, aísle el plásmido de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y vuelva a transformarlo en la levadura tóxica. Inocular caldo de glucosa de doble deserción con una colonia de la placa de transformación.
Incubarlo durante la noche y detectarlo en el agar de doble deserción glucosa y ga gatasa para confirmar la supresión de la toxicidad. Antes de realizar la pantalla supresora de levadura, las proteínas efectoras de interés se probaron para detectar toxicidad en levaduras. La proteína de interés se expresó en la levadura bajo el control de un promotor inducible de ga gactosa y el crecimiento de la ga gactosa se comparó con el crecimiento de la glucosa.
Cuando CT229 se probó para la toxicidad, se observaron colonias más pequeñas y supresión del crecimiento. Idealmente, se debe observar una disminución de dos a tres registros para proceder con las pantallas supresoras de levadura. La pantalla supresora se llevó a cabo transformando la cepa tóxica con la biblioteca genómica de levadura pYAP 13 y enchapando los transformantes en el agar gactosa.
Los clones supresores obtenidos fueron vistos en el agar de gactosa de abandono doble para confirmar la supresión de la toxicidad. Los supresores pSup1 y pSup2 suprimieron la toxicidad de la proteína efectora, mientras que pSup3 no. Estos procedimientos requieren una cuidadosa atención al detalle, además de los trabajos preparatorios críticos, incluyendo tener grandes cantidades de medios y placas listos antes de realizar el experimento.
Una vez identificados los supresores, se pueden realizar experimentos para verificar las interacciones con el efector de interés, incluyendo derribos, colocación de inmunofluorescencia, eliminación del efector o derribo de los factores del host identificados en las pantallas. El desarrollo de esta técnica para los efectores de la clamidia ha permitido la caracterización preliminar acelerada de las proteínas efectora y ha ayudado a centrar nuestros esfuerzos en el esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes que median las interacciones de los patógenos del huésped.
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Descripción general
Este artículo describe un método para identificar las vías del huésped que son diana de proteínas efectoras bacterianas tóxicas, mediante ensayos de toxicidad y supresores en levadura. Comprender estas interacciones es fundamental para abordar la patogénesis molecular en bacterias intracelulares como Chlamydia trachomatis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Interacciones entre patógeno y huésped
- Biología celular
Antecedentes
- Los patógenos bacterianos secretan proteínas efectoras que manipulan las vías biológicas del huésped.
- La identificación de estas vías es esencial para comprender las enfermedades causadas por bacterias intracelulares.
- Los modelos de levadura pueden utilizarse para analizar los efectos de estas proteínas efectoras.
- Este método se ha aplicado a diversos patógenos, incluyendo Chlamydia trachomatis.
Objetivo del estudio
- Elucidar las vías del huésped que son diana de proteínas efectoras bacterianas tóxicas.
- Proporcionar información sobre los mecanismos moleculares de la patogénesis.
- Mostrar la utilidad de las pruebas de toxicidad y supresión en levaduras en este campo de investigación.
Métodos Utilizados
- Inoculación de levaduras transformadas con plásmidos de proteínas efectoras.
- Uso de controles negativos con levaduras transformadas únicamente con el vector.
- Incubación de los cultivos a 30 grados Celsius con agitación.
- Análisis del crecimiento de levaduras y toxicidad para identificar interacciones de proteínas efectoras.
Resultados principales
- Identificación exitosa de las vías del hospedador afectadas por las proteínas efectoras de Chlamydia trachomatis.
- Demuestra la eficacia de los ensayos con levaduras para estudiar efectores bacterianos.
- Información sobre los blancos biológicos de diversos patógenos bacterianos.
- Aplicaciones potenciales de este método para otras bacterias intracelulares.
Conclusiones
- Las pruebas de toxicidad en levaduras y de supresores son herramientas valiosas para estudiar proteínas efectoras bacterianas.
- Este enfoque mejora la comprensión de las interacciones entre patógenos y huéspedes.
- Investigaciones futuras que utilicen este método podrían conducir a nuevas estrategias terapéuticas contra infecciones bacterianas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación de vías del huésped manipuladas por proteínas efectoras bacterianas es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas durante el descubrimiento de agentes antiinfecciosos. Las pruebas de toxicidad y supresión en levaduras ofrecen un enfoque funcional, impulsado por fenotipos, para localizar alteraciones en la biología del huésped cuando los ensayos tradicionales de unión fallan. Esto permite obtener información mecanicista sobre los factores de virulencia de los patógenos, apoyando la confianza temprana en las dianas y la priorización de carteras para patógenos intracelulares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la toxicidad del efector a vías huésped específicas a través de la identificación de supresores.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas cuando las proteínas efectoras carecen de asociados de unión detectables o interactúan con proteínas huésped multifuncionales.
- Valor predictivo: Facilita la reducción mecanicista de riesgos al revelar perturbaciones a nivel de vías, en lugar de interacciones proteicas aisladas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para el ensayo: Genera cepas de levadura validadas que expresan proteínas efectoras para la detección reproducible de toxicidad.
- Resultado cuantitativo: Mide la magnitud del defecto de crecimiento (por ejemplo, una reducción de dos a tres órdenes de magnitud) como umbral para avanzar a los ensayos de supresores.
- Escalabilidad: Utiliza formatos de 96 pocillos y la técnica de microdilución en serie para la evaluación de alto rendimiento de clones supresores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Se aplica a patógenos intracelulares como Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila y Coxiella burnetii, lo que favorece la alineación translacional de biomarcadores.
- Continuidad preclínica: Identifica factores del huésped que, cuando se suprimen, revierten la toxicidad de los efectores, permitiendo validaciones posteriores mediante ensayos de precipitación, colocalización o estudios con knockout.
- Avance ajustado al riesgo: Concentra los esfuerzos en efectores con modulación de vías confirmada, reduciendo la pérdida biológica en etapas avanzadas.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento para orientar la identificación de fármacos líderes mediante la conexión de la expresión del efector con la alteración de la vía del huésped, lo que permite la selección de dianas basada en datos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la vinculación de la expresión del efector con defectos de crecimiento en levaduras, lo que indica interferencia en la vía.
- Tamizaje: Proporciona cepas tóxicas listas para ensayos y bibliotecas de supresores para identificar factores del huésped que revierten el fenotipo.
- Análisis: Ofrece lecturas cuantitativas del crecimiento en medios selectivos para comparar la toxicidad del efector y la eficacia de los supresores.
- Investigación Traducional: Conecta los supresores identificados en levaduras con sus homólogos en mamíferos para su validación preclínica en sistemas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el tamizaje de bibliotecas de efectores en múltiples patógenos intracelulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la interrogación de vías funcionales.
- Valor operativo: Protocolos estandarizados de cribado de toxicidad y supresores con umbrales de crecimiento definidos.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de continuar o descartar mediante el filtrado de efectores que carecen de impacto medible sobre las vías del huésped.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de objetivos efectores basada en la modulación de vías validada.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en clonación molecular en levaduras, expresión inducible por galactosa y transformación de bibliotecas de plásmidos.
- Depende de instrumentación para el manejo estéril de cultivos, centrifugación e incubación a 30 °C con agitación.
- Necesita la estandarización conjunta entre equipos en la preparación de medios, la siembra en placas y los criterios de puntuación de toxicidad.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la compatibilidad de promotores, los umbrales de toxicidad del efector y la validación de supresores en sistemas de mamíferos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de grandes volúmenes de medio y placas, así como la posibilidad de falsos negativos si la expresión del efector es tóxica para las cepas de levadura de la biblioteca.
