Name: Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprende a medir proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones mediante recolección de líquido cefalorraquídeo y sangre. Este protocolo permite diferenciar entre alteraciones de la barrera hematoencefálica y síntesis intratecal en modelos de trastornos neurológicos.

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Los autores agradecen al personal del Centro de Medicina Comparada e Investigación (CCMR) de Dartmouth por su cuidado experto de los ratones utilizados para estos estudios. El Fondo de Investigación Bornstein financió esta investigación.

Todo el trabajo animal utiliza protocolos revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Escuela de Medicina Geisel en Dartmouth.
1. Recolección de líquidos
NOTA: Se requieren tanto suero como LSC. Se necesitan dos protocolos para cada recolección de fluidos para la supervivencia y la necropsia.
<ol><li>Recolección de suero y CSF mediante procedimientos de supervivencia NOTA: Para la recolección de fluidos de supervivencia, la recolección de suero debe preceder a la recolección de Líquido Cefalreino, ya que es un procedimiento menos invasivo. El cSF debe obtenerse dentro de una semana de la extracción de suero.<ol><li>Procedimiento de sangrado retroorbital para la recolección de suero. NOTA: Este procedimiento es para la hemorragia de supervivencia de ratones14. El procedimiento descrito se aplica a cualquier edad, sexo y cepa de ratones. Dado que las normas de la IACUC dictan que un volumen sanguíneo máximo del 1% del peso corporal se puede eliminar como una sola extracción de sangre, se recomienda que el procedimiento se realice solo en ratones que pesen más de 15 g.<ol>
<li>Mueva las jaulas que contienen ratones del bastidor a un área de trabajo adecuada. Prepare la máquina de gas de anestesia encendiendo el medidor de flujo de oxígeno a 1 L/min.</li>
			<li>Coloque el animal en la cámara de inducción y cierre bien la tapa. Encienda el vaporizador de isoflurano al 3,5% y vigile al animal hasta que lo recumben.</li>
			<li>Retire el animal de la cámara y evalúe el nivel de anestesia por reflejo de pedal, es decir, pellizco firme de la almohadilla. Asegurar la profundidad adecuada de la anestesia antes de realizar el procedimiento: la falta de respuesta a un pellizco firme indica anestesia adecuada.</li>
			<li>Sujete el ratón anestesiado agarrando la piel suelta detrás de las orejas con el pulgar y el dedo índice de la mano no dominante. Abultar los ojos mediante el uso del dedo índice para recuperar la piel por encima del ojo y el pulgar para extraer la piel por debajo de los ojos.</li>
			<li>Coloque la punta de una pipeta Pasteur en la cavidad ocular debajo del globo ocular(Figura 1, panel izquierdo), dirigiendo la punta a aproximadamente 45o hacia el centro de la cavidad ocular(Figura 1, panel derecho). Gire la pipeta entre los dedos durante el paso hacia adelante. Aplique una presión suave y luego suelte hasta que la sangre entre en la pipeta. NOTA: La cantidad máxima de sangre que se puede retirar a la vez de esta ubicación es de aproximadamente el 1% del peso corporal, por ejemplo, 0,2 ml de un ratón de 20 g.</li>
			<li>Retire suavemente el capilar para evitar lesiones en el ojo y coloque la sangre recogida en un tubo centrífugo de 1,5 ml. Cierre el párpado y aplique una presión leve con gasa para evitar sangrados adicionales. Una vez completamente alerta y móvil (generalmente de 3 a 5 minutos), devuelva el ratón a su jaula de retención.</li>
			<li>Deje que la sangre coagule durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente (RT), luego centrifugar sangre durante 10 min a 2.000 x g en una centrífuga refrigerada de 4oC. Con una técnica de pipeta limpia, recoja el suero en un vial nuevo con la etiqueta de 0,5 ml. Congele inmediatamente el vial de suero a -80 oC.</li>
		</ol></li>
		<li>Recogida de CSF con procedimiento de supervivencia NOTA: Este procedimiento es para cirugía de supervivencia, y se basa en el protocolo publicado por Liu y Duff en 200815. Los ratones son anestesiados por un cóctel de ketamina (20 mg/ml), xilazina (0,5 mg/ml) y acepromaz (0,5 mg/ml) administrado por vía intraperitoneal.<ol><li>Mueva las jaulas que contienen ratones del estante a un área de trabajo de cirugía designada. Prepare el espacio de la cirugía en un ambiente estéril. Asegúrese de que todos los instrumentos y materiales utilizados estén esterilizados antes de la cirugía.</li>
			<li>Pesar el ratón y calcular el volumen de anestesia necesario (0,1 ml de cóctel de anestesia para un ratón de 20 g). Inyectar anestesia por vía intraperitoneal16. Después de unos minutos, pruebe el ratón pellizcando el reposapiés para asegurar una anestesia adecuada. Si se requiere más anestesia, inyectar más 0,01 x 0,03 ml del cóctel anestésico.</li>
			<li>Utilice tijeras o una afeitadoa para afeitar un área pequeña de la cabeza, en el extremo caudal, medial en el cráneo, para exponer un área de trabajo lo suficientemente grande como para la colección de LSN. Coloque el ratón en la posición propensa en el instrumento estereotaxico y firme la cabeza usando barras de oído(Figura 2A). NOTA: El ratón se coloca de modo que la cabeza forme un ángulo de casi 135o con el cuerpo(Figura 2A). Una vez que el animal está posicionado, se utiliza una cortina quirúrgica para mantener un campo estéril en el sitio quirúrgico. Las cortinas adhesivas claras son preferidas para la recolección de LSF en ratones, ya que permiten una visualización directa y más enfocada del animal.</li>
			<li>Swab el sitio quirúrgico con 30% de diacetato de clorhexidina. Usando un bisturí estéril, haz una incisión sagital de la piel inferior al occiput para exponer los músculos que revuelcan la cisterna magna.</li>
			<li>Por disección contundente con fórceps, separe el tejido subcutáneo y los músculos para exponer la cisterna magna(Figura 2B). Utilice microretractores para mantener los músculos separados(Figura 2B)y exponer la capa meningeal dura mater sobre la cisterna magna.</li>
			<li>Lavar suavemente con solución salina estéril con fosfato (PBS) para eliminar cualquier posible contaminación de la sangre. Seque el dura mater con un hisopo de algodón estéril y perfore suavemente la membrana que cubre la cisterna magna con una aguja de 30 G. Inserte rápida y suavemente un pequeño tubo capilar de vidrio para recoger el LCC(Figura 2C). NOTA: La presión intracraneal permite que el lcmo fluya espontáneamente hacia el capilar(Figura 2C). Dependiendo de la edad y el tamaño del ratón, se obtienen aproximadamente 5 a 12 l de L. de L. de CSF de cada ratón.</li>
			<li>Retire cuidadosamente el tubo capilar de la membrana. Conecte el tubo a una jeringa de 3 ml a través de un tubo de polietileno(Tabla de materiales)e inyecte el LSN recogido en un tubo etiquetado de 0,5 ml(Figura 2D). Mantenga los viales en hielo.</li>
			<li>Cierre la incisión utilizando sutura de polidioxanona (PDS) con aguja desechable y utilizando suturas enterradas17. Limpie el área de cualquier sangre o tejido seco.</li>
			<li>Inyectar ratones, por vía subcutánea o intraperitoneal16,con 0,05 x 0,1 mg/kg de clorhidrato de buprenorfina como tratamiento analgésico. Además, inyectar por vía subcutánea 1 ml de solución salina estéril para prevenir la deshidratación.</li>
			<li>Vuelva a colocar el ratón en una jaula limpia y cálida para su recuperación. Una vez que el ratón esté móvil y sea capaz de llegar a la comida y el agua, vuelva a colocar la jaula en el estante.</li>
			<li>Centrífuga CSF durante 10 min a 1.000 x g en una centrífuga refrigerada de 4oC. Compruebe el grado de contaminación de la sangre mediante inspección visual para la identificación de la xanthochromia y la presencia de un pellet rojo en la parte inferior del tubo. Deseche las muestras contaminadas con sangre. NOTA: La fórmula utilizada para la corrección de cantidades de proteína softa en muestras contaminadas con sangre se basa en parámetros de ecuación que incluyen el contenido de proteínas en el LCR y el suero, el hematocrito (HCT) y el recuento de glóbulos rojos (RBC) en el lCR y la sangre18. Sin embargo, esta estrategia de corrección no se puede aplicar fácilmente a las muestras de PSF de ratón debido al pequeño volumen, limitando así la estrategia de corrección a una inspección visual.</li>
			<li>Usando una técnica de pipeta limpia, recoja el LSC en un nuevo tubo de 0,2 ml, dejando atrás el pellet con células. Diluir el CSF 1:3 con PBS para reducir la pérdida de volumen debido al aerosol. Inmediatamente congelar el vial de CSF a -80 oC.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Recolección de suero y CSF mediante procedimientos de no supervivencia NOTA: Para la recolección de fluidos sin supervivencia, la recolección de líquidos cSF precede a la recolección de suero, ya que el ratón necesita tener un pulso.<ol>
<li>Recolección del CSF en la necropsia NOTA: Este procedimiento es para cirugía sin supervivencia, y aproximadamente 10-20 l de L. CSF se obtiene de cada ratón. Se recomienda un campo quirúrgico estéril, pero no es necesario para la cirugía que no es de supervivencia.<ol>
<li>Mueva las jaulas que contienen ratones del bastidor a un espacio de trabajo cómodo. Siga los pasos 1.1.2.2-1.1.2.7 y 1.1.2.11-1.1.2.12 para la colección de CSF. Proceda a la sección 1.2.2 para la recolección de suero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Recolección de sangre mediante punción intracardiaca (enfoque abierto) NOTA: Los volúmenes sanguíneos esperados son aproximadamente el 3% del peso corporal, por ejemplo, 0,6 ml de un ratón de 20 g.<ol>
<li>Después de la colección de CSF asegúrese de que el ratón todavía está suficientemente anestesiado por pellizcar el pie. Si se observa alguna reacción, administre una segunda dosis de anestésico. Si no se observa ninguna reacción, proceda.</li>
			<li>Coloque el animal en la espalda y frote la piel en el abdomen con 70% de alcohol. Con tijeras quirúrgicas, abra la cavidad torácica y exponga el corazón. Inserte una aguja de 25 G (adjunta a una jeringa de 3 ml) en el ventrículo izquierdo y aplique suavemente presión negativa sobre el émbolo de la jeringa. Retirar la aguja después de que se haya recogido sangre.</li>
			<li>Realizar un método secundario de eutanasia como la decapitación o la dislocación cervical para asegurarse de que el animal ha fallecido.</li>
			<li>Empuje el émbolo de la jeringa hacia abajo e inyecte la sangre recogida en un vial de 1,5 ml. Deje que la sangre coagule durante 30-60 minutos a RT y luego centrifugar la durante 10 min a 2.000 x g en una centrífuga refrigerada de 4oC.</li>
			<li>Con la técnica de pipeta limpia, recoja el suero en un vial nuevo con la etiqueta de 0,5 ml. Congele inmediatamente el vial de suero a un congelador de -80 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Análisis de proteínas
<ol><li>Utilice un método preferido, por ejemplo, la tecnología Luminex, para cuantificar las proteínas diana y la albúmina en muestras de suero y LSN coincidentes. NOTA: Aquí se da un ejemplo con la tecnología magnética Luminex, pero prácticamente cualquier técnica que mide las cantidades de proteínas, incluidos los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), se puede aplicar al protocolo actual. Idealmente, las muestras de CSF y suero se ejecutan tanto para la albúmina como para las proteínas diana en la misma plataforma. Las condiciones del ensayo deben optimizarse para pasos cruciales en el protocolo, como la concentración de acoplamiento de antígenos y perlas, diluciones de muestras de suero y LSF, curvas estándar de mejor ajuste para cada analito y composición de búfer para reducir la reactividad no específica. Si se utiliza un kit comercial para la medición de proteínas, por ejemplo, el kit de isotipado de inmunoglobulina (Tabla de materiales) utilizados para obtener los datos presentados enFigura 3, deben seguirse las instrucciones de los fabricantes.<ol><li>Al descongelar y antes del análisis, centrifugar el LSC y las muestras de suero (2.000 x g durante 10 min) y utilizar el sobrenadante para evitar la obstrucción de las placas de filtro y/o sonda. Siga el procedimiento de ensayo proporcionado con el kit para las diluciones de muestra adecuadas. De lo contrario, determine la dilución adecuada para cada analito y líquido. Diluir las muestras en PBS en consecuencia. NOTA: Si no hay instrucciones o orientación específicas, las diluciones para cada analito y fluido deben establecerse antes de la prueba de estudio, determinando los rangos de dilución adecuados necesarios para obtener estimaciones de concentración que gama fiable de una curva estándar. Conocer las características de la muestra biológica a analizar, por ejemplo, concentraciones fisiológicas y patológicas en el fluido, permite probar diferentes diluciones con muestras de bajo, medio y alto contenido de analito. Si el rango esperado de concentraciones en las muestras se conoce a priori, las diluciones se pueden seleccionar después de calcular cuántas veces la muestra tiene que diluirse para estar dentro del rango de curva estándar elegido. ADVERTENCIA: Al calcular los factores de dilución, recuerde que el PSM ya se ha diluido 1:3.</li>
		<li>Preparar una curva estándar para cada proteína de interés, por ejemplo, albúmina e IgG como se utiliza para generar datos en la Figura 3,mediante proteínas estándar de referencia de dilución en serie. Durante la preparación de curvas estándar, mezcle a fondo cada concentración más alta antes de realizar la siguiente dilución. NOTA: Independientemente del método de cuantificación elegido, es esencial incluir una curva estándar cada vez que se realiza el ensayo para estimar la concentración de proteínas en las muestras. La mejor opción para un estándar de referencia es una concentración purificada y conocida de la proteína de interés. La decisión sobre las diluciones específicas, así como el número de puntos de datos y réplicas utilizadas para definir la curva estándar, depende del grado de no linealidad en la curva estándar.</li>
		<li>Seleccione los conjuntos de perlas magnéticas acoplados a anticuerpos apropiados(Tabla de materiales). Para viales individuales de perlas, sonicar cada vial durante 30 s y vórtice durante 1 min. Preparar una "mezcla de perlas de trabajo" diluyendo las existencias de cuentas a una concentración final de 50 perlas de cada conjunto / L en el tamón de ensayo/lavado (PBS, albúmina sérica bovina albúmina 1% bovina [BSA]). Añadir 50 l de las cuentas mixtas a cada pocal en una placa de fondo plano de 96 pocillos(Tabla de Materiales). ADVERTENCIA: Las perlas fluorescentes son sensibles a la luz. Por lo tanto, deben protegerse de la exposición prolongada a la luz durante todo el procedimiento.</li>
		<li>Diagrame la ubicación de los fondos, estándares y muestras en una hoja de cálculo de mapa de pozos.</li>
		<li>Añadir 50 l de tamón de ensayo/lavado a cada pozo de fondo, y 50 l de cada estándar a los pozos para la curva estándar. Cargue 50 ml de cada muestra diluida en los pozos apropiados. Envuelva la placa con papel de aluminio e incubar con agitación (800 rpm) en una coctelera durante 30 minutos a RT.</li>
		<li>Coloque la placa en un imán de mano(Tabla de materiales)y descanse la placa en el imán durante 60 s para permitir el ajuste completo de las perlas magnéticas. Retire el contenido del pozo decanando suavemente la placa y toque la placa en las almohadillas absorbentes para eliminar el líquido residual.</li>
		<li>Lave la placa quitándola del imán, añadiendo 200 s l de ensayo/tampón de lavado, agitando durante 30 s y, finalmente, volviéndola a conectar al imán. Repita el lavado 3x.</li>
		<li>Diluir el anticuerpo de detección biotinylated, es decir, anticuerpo etiquetado biotina levantado contra las especies huésped de proteínas, a 4 g/ml en el tamón de ensayo/lavado. Añadir 50 l de anticuerpo de detección diluido a cada poca. Cubra la placa e incubadurante durante 30 minutos a RT en la coctelera de la placa a 800 rpm. Coloque la placa en el imán y repita los pasos 2.1.6 y 2.1.7.</li>
		<li>Diluir la estreptavidina conjugada con ficoeritrina (PE) (SAPE) a 4 g/ml en el búfer de ensayo/lavado. Añadir 50 s de SAPE diluido a cada pocto. Cubra la placa e incubadurante durante 30 minutos a RT en la coctelera de la placa a 800 rpm. Coloque la placa en el imán y repita los pasos 2.1.6 y 2.1.7.</li>
		<li>Retire la placa del imán y vuelva a suspender las perlas en 100 ml de tampón de ensayo/lavado. Leer pozos con un instrumento de detección basado en flujo láser doble que permite la detección de la magnitud de la intensidad de fluorescencia PE (FI). NOTA: La señal, por ejemplo, FI, generada es proporcional a la cantidad de antígeno objetivo conectado a la superficie de las perlas.</li>
		<li>Exporte datos sin procesar y cree curvas estándar graficando la señal de detección FI frente a las concentraciones de proteínas estándar. Utilice las curvas estándar para calcular la concentración de los analitos en las muestras. NOTA: La albúmina se expresa preferentemente en g/dL, mientras que las proteínas de interés se expresan preferentemente en mg/dL.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cálculos del índice intratecal
<ol><li>Organice los valores de concentración de proteínas en una hoja de cálculo y analice los resultados aplicando las siguientes fórmulas.</li>
	<li>CalcularalbúminaQ : <img alt="Ecuación para el cociente de albúmina, fórmula para Q_albumin, relacionando los niveles de LCR y albúmina sérica." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> donde laalbúmina cSF y laalbúmina sérica son concentraciones de albúmina en muestras de suero y CSF coincidentes, respectivamente.</li>
	<li>Calcularla proteínaQ : <img alt="Ecuación de la relación de concentración de proteínas Q_protein=(CSF_protein/Serum_protein), análisis bioquímico." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> donde laproteína LSM y laproteína sérica son concentraciones de proteína(s) diana en muestras de suero y LSN coincidentes, respectivamente.</li>
	<li>Calcular el índice de proteínas: <img alt="Fórmula del índice de proteínas, ecuación, Q_protein/Q_albumin, análisis bioquímico." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
</ol>

<ol><li>Whedon, J. M., Glassey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+stasis+and+its+clinical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Alternative+Therapies+in+Health+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance.</a> Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).</li>
<li>Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+cerebrospinal+fluid+biomarkers+using+microsphere-based+xMAP+multiplex+technology+for+early+detection+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease.</a> Methods. 56 (4), 484-493 (2012).</li>
<li>Barro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+biomarker+and+electrophysiological+outcome+measures+for+progressive+MS+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials.</a> Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).</li>
<li>Tourtellotte, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+measurement+and+validation+of+central+nervous+system+IgG+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate.</a> Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).</li>
<li>Bonnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+IgG+synthesis%3A+a+resistant+and+valuable+target+for+future+multiple+sclerosis+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+International%22%5BJournal%5D)">Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments.</a> Multiple Sclerosis International. 2015, 296184(2015).</li>
<li>Reiber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid--physiology%2C+analysis+and+interpretation+of+protein+patterns+for+diagnosis+of+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases.</a> Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).</li>
<li>DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+neuro-immune+patterns+in+two+clinically+relevant+murine+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109(2019).</li>
<li>Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells+in+the+central+nervous+system+in+the+Theiler%27s+virus+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis.</a> Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).</li>
<li>Reiber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+rate+of+cerebrospinal+fluid+%28CSF%29--a+concept+common+to+normal+blood-CSF+barrier+function+and+to+dysfunction+in+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases.</a> Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).</li>
<li>Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+relevance+of+free+light+chains+in+cerebrospinal+fluid+-+The+hyperbolic+reference+range+for+reliable+data+interpretation+in+quotient+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams.</a> Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).</li>
<li>Reiber, H., Felgenhauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transfer+at+the+blood+cerebrospinal+fluid+barrier+and+the+quantitation+of+the+humoral+immune+response+within+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system.</a> Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).</li>
<li>Dorta-Contreras, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reibergrams%3A+essential+element+in+cerebrospinal+fluid+immunological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+de+Neurologia%22%5BJournal%5D)">Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis.</a> Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).</li>
<li>Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Connected+Steady+State+Model+and+the+Interdependence+of+the+CSF+Proteome+and+CSF+Flow+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics.</a> Frontiers Neuroscience. 11, 241(2017).</li>
<li>Wolforth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+blood+collection+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Methods of blood collection in the mouse.</a> Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+serial+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (21), e960(2008).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771(2012).</li>
<li>Johnston, S. A., Tobias, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Veterinary+Surgery%3A+Small+Animal+Expert+Consult+-+E-Book%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li>
<li>Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+cerebrospinal+fluid+protein+for+the+presence+of+red+blood+cells+in+children+with+a+traumatic+lumbar+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture.</a> Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).</li>
<li>McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+multiple+sclerosis%3A+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+Theiler%27s+virus-induced+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease.</a> Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).</li>
<li>Link, H., Tibbling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+albumin+and+IgG+analyses+in+neurological+disorders.+II.+Relation+of+the+concentration+of+the+proteins+in+serum+and+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid.</a> Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).</li>
<li>Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+albumin+and+IgG+analyses+in+neurological+disorders.+I.+Establishment+of+reference+values%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values.</a> Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).</li>
<li>Deisenhammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+routine+cerebrospinal+fluid+analysis.+Report+from+an+EFNS+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force.</a> European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).</li>
<li>Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%3A+structure+and+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).</li>
<li>Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+values+for+serum+proteins+of+common+laboratory+rodent+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).</li>
<li>Felgenhauer, K., Renner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+radii+versus+molecular+weights+in+clearance+studies+of+urine+and+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).</li>
<li>Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+a+molecular+signature+in+inflammatory+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%2C+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease.</a> Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520(2019).</li>
<li>Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+biomarkers+in+central+nervous+system+tissue+and+cerebrospinal+fluid+in+the+Theiler%27s+virus+model+mirror+those+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis.</a> Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).</li>
<li>Gerbi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+concentration+in+the+arterial+and+venous+renal+blood+serum+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Reiber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+blood%3A+barriers%2C+CSF+flow+rate+and+source-related+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+Neurology+and+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).</li>
<li>Reiber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knowledge-base+for+interpretation+of+cerebrospinal+fluid+data+patterns.+Essentials+in+neurology+and+psychiatry%5BTitle%5D)+AND+%22Arquivos+de+Neuropsiquiatria%22%5BJournal%5D)">Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry.</a> Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).</li>
<li>Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+neopterin+is+brain-derived+and+not+associated+with+blood-CSF+barrier+dysfunction+in+non-inflammatory+affective+and+schizophrenic+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychiatric+Research%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders.</a> Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).</li>
<li>Bromader, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+serum+and+cerebrospinal+fluif+cytokines+in+response+to+non-neurological+surgery%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 242(2012).</li>
<li>Starhof, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+pro-inflammatory+cytokines+differentiate+parkinsonian+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos cuantitativos para la evaluación del aumento de las concentraciones de proteínas del LSC son herramientas útiles en la caracterización del estado fisiológico y patológico del SNC. Sin embargo, más allá de la cuantificación fiable de los niveles de proteína sofo, la detección de proteínas del LIF requiere una expresión de resultados que discriminen entre las fracciones derivadas de la sangre y del SNC en el LRESULT. Sin embargo, hasta la fecha, los ensayos de cuantificación de proteínas comúnmente utilizados n...

El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido transparente e incoloro que rodea el cerebro y la médula espinal, tiene una gran importancia clínica y científica básica. El LSN preserva el entorno electrolítico del sistema nervioso central (SNC), equilibra el estado sistémico de la base de ácidos, suministra nutrientes a las células neuronales y gliales, funciona como un sistema linfático para el SNC, y transporta hormonas, neurotransmisores, citoquinas y otros neuropéptidos a lo largo del SNC1. Así, como la composición del LSNC refleja la actividad del SNC, este fluido ofrece un valioso, aunque indirecto, acceso para caracterizar el estado fisiológico y patológico del SNC.
El LSN se ha utilizado para diagnosticar afecciones que afectan al SNC durante más de cien años, y durante la mayor parte de este tiempo, fue estudiado principalmente por los médicos como una herramienta de diagnóstico. Sin embargo, en los últimos años los neurobiólogos han reconocido el potencial del LIF para estudiar la fisiopatología del SNC. En particular, se han introducido varias herramientas de análisis de proteínas de alto rendimiento en el ámbito de la neurociencia, lo que permite un estudio detallado de la composición proteica del LSCA, con la expectativa de que este análisis puede ayudar a proporcionar información sobre los cambios dinámicos que ocurre dentro del SNC.
Los desarrollos tecnológicos en técnicas de inmunoensayo multiplex como Luminex y Simoa technologies2,3, proporcionan a los investigadores hoy en día la capacidad de detectar cientos de proteínas a concentraciones muy bajas. Además, estas mismas tecnologías permiten el uso de pequeños volúmenes de muestra, promoviendo así estudios en animales pequeños, incluidos ratones, en los que volúmenes de muestras limitados de LIF han impedido caracterizaciones detalladas del fluido hasta hace poco.
Sin embargo, una advertencia es que las proteínas medidas en el LCC pueden derivar de la síntesis intratecal y/o la transudación del suero debido a una interfaz hematoencefálica (BBI) dañada. Desafortunadamente, el análisis proteico del LIF por sí solo sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre las proteínas transsufechadas y producidas intratecalmente, las mediciones de proteínas CSF que utilicen cualquier herramienta de análisis de proteínas disponible deben ajustarse para la variabilidad individual en las concentraciones séricas, así como para la integridad de la barrera. Sin embargo, aunque este ajuste se utiliza comúnmente en la práctica clínica, por ejemplo, el índice IgG de La CSF, que tiene alta sensibilidad para detectar la síntesis intratecal de IgG4,5,6, hasta la fecha muy pocos estudios de investigación han corregido las concentraciones de proteína CSF para la concentración sérica y la integridad de la barrera7,8.
Actualmente, el enfoque Reibergram es la mejor manera de determinar la función de barrera y la síntesis intratecal de proteínas. Se trata de una evaluación gráfica en diagramas de cocientes CSF/suero que analiza, de forma integrada, tanto la función de barrera (dys) como la síntesis de proteínas intratecales, refiriéndose a una proteína exclusivamente derivada de la sangre9,10. La albúmina proteica muy abundante suele ser elegida como proteína de referencia porque se produce sólo en el hígado y porque su tamaño, de aproximadamente 70 kDa, es intermedio entre proteínas pequeñas y grandes11. El diagrama de análisis fue definido por primera vez por Reiber y Felgenhauer en 1987 para las principales clases de inmunoglobulinas (Igs)11,siendo empíricamente basado en los resultados obtenidos del análisis de miles de muestras humanas9. El enfoque fue confirmado posteriormente por la aplicación de las dos leyes de difusión de Fick en la teoría de la difusión molecular/velocidad de flujo12. Tal teoría demuestra la difusión de una proteína a través de la barrera tiene una distribución hiperbólica y puede explicar cuantitativamente la dinámica de las proteínas en el SNC9,13. En general, la ventaja de utilizar el Reibergram para demostrar la síntesis de proteínas intratecales es que identifica simultáneamente la fracción proteica que entra en el LRESULT desde el suero, así como la cantidad de proteína que se encuentra en el LIF debido a la producción local.
El presente artículo y el protocolo relacionado describen todo el procedimiento, desde el LC y la recolección de sangre hasta los cálculos finales que corrigen los niveles de proteína CSF, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales en modelos de ratón de Trastornos. Este procedimiento proporciona una línea de base para evaluar (1) el origen fisiopatológico de cualquier proteína del LCP y (2) la estabilidad y la importancia funcional de la integridad de la barrera. Este procedimiento y protocolo no sólo son útiles para evaluar muestras de CSF de ratón, sino que también son útiles en el análisis de la CSF en una multitud de modelos animales de enfermedades neurológicas y pacientes humanos.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de insulina de 1 mL</td><td>BD</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL BD</td><td></td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 25</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 3 mL</td><td>BD</td><td>309582</td><td></td></tr><tr><td>aguja de insulina de calibre 30</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas absorbentes</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td>adecuada</tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lavadora magnética de mano BioPlex</td><td>Imán</td><td>de 171020100</td><td>BioRad</td></tr><tr><td>BioPlex Lector multiplex MAGPIX</td><td>BioRad</td><td>171015001</td><td></td></tr><tr><td>BioPlex Pro Placas de fondo plano</td><td>BioRad</td><td>171025001</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilado Anticuerpo de detección</td><td>Cualquier fuente</td><td></td> adecuada <td>El anticuerpo debe dirigirse contra las especies de la proteína de interés.</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de buprenorfina</td><td>PAR Farmacéutico</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Instrumento Sutter</td><td>B100-75-10</td><td>OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm Vidrio de borosilicato 10 cm; dibujado sobre Bunsen para hacer el ID más pequeño.</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato de clorhexidina</td><td>Nolvasan</td><td>E004272</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipetas desechables</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td>adecuada</tr><tr><td>Barras para los oídos</td><td>KOPF Instruments</td><td>1921 o 1922</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Kopter</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Congelador</td><td>VWR</td><td>VWR32086A</td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Medline</td><td>NON25212</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Sunbeam</td><td></td><td>XL King Size SoftTouch, 4 ajustes de calor con apagado automático, verde azulado, cámara de inducción de 12 x 24 pulgadas</td></tr><tr><td></td><td>VETEQUIP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (KetaVed)</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microesferas MagPlex (acopladas a anticuerpos)</td><td>BioRad</td><td></td><td>Perlas magnéticas acopladas a anticuerpos</td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>Southwest Scientific</td><td>SBT1500</td><td></td></tr><tr><td>Microrretractores Calidad de</td><td>relleno de coche</td><td>ACD-010</td><td>Blunt - 1 mm</td></tr><tr><td>Microsoft Office (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel</td><td>EMD Millipore</td><td>MGAMMAG-300K</td><td>Kit comercial para la cuantificación mediante Luminex de un panel de isotipos y subclases de inmunoglobulinas en fluidos de ratón.</td></tr><tr><td>Kit ELISA de captura de albúmina</td><td>de ratón Novus Biological</td><td>NBP2-60484</td><td>Kit comercial para la cuantificación mediante ELISA de albúmina en fluidos de ratón.</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>3125000060</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos no estériles</td><td>MediChoice</td><td>WOD1002</td><td>Necesidad de esterilización en autoclave para la esterilidad</td></tr><tr><td>Oxígeno</td><td>AIRGAS</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pippettes</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A</td> 5 <td>& 3/4"</td></tr> <tr><td>Sutura PDS con aguja desechable, 6-0 Prolen</td><td>Patterson Vet</td><td>8695G</td><td>P-3 Corte inverso, 18"</td></tr><tr><td>PE-Estreptavidina</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>Research seriers</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de</td><td></td><td></td><td></td>polietileno</tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Beckman Coulter</td><td>ALLEGRA X-12R</td><td></td></tr><tr><td>Escala</td><td>Uline</td><td>H2716</td><td></td></tr><tr><td>Pluma de</td><td></td> <td>bisturíEF7281</td><td></td></tr><tr><td>Afeitadora</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-5204</td><td></td></tr><tr><td>Proteínas estándar</td><td>Cualquier fuente</td><td></td> adecuada <td>La mejor opción para un estándar de referencia es una concentración purificada y conocida de la proteína de interés.</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico</td><td>KOPF Instruments</td><td>Modelo 900LS</td><td>Accesorios estándar</td></tr><tr><td>Estéril 1 x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina estéril</td><td>Baxter</td><td>0338-0048-02</td><td>Irrigación con cloruro de sodio al 0,9 %</td></tr><tr><td>Pinzas quirúrgicas USP curvadas, 7 (2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td> Dumont <td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Inoxidable 25x</td></tr><tr><td>Vaporizador + Medidor de Flujo</td><td>Moduflex Anhestesia Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de calentamiento</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RT-JR-20</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador de agua</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-08895-01</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido que se encuentra en el cerebro y la médula espinal, es de gran importancia para la ciencia básica y clínica. El análisis de la composición de proteínas del LIF proporciona información crucial en la investigación básica de neurociencia, así como en enfermedades neurológicas. Una advertencia es que las proteínas medidas en el LSC pueden derivar tanto de la síntesis intratecal como de la transudación del suero, y el análisis proteico del LSC sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre la transudación de proteínas de la sangre y las proteínas producidas intratecalmente en modelos animales, así como en humanos, las mediciones de perfilado de proteínas CSF utilizando herramientas convencionales de análisis de proteínas deben incluir el cálculo del cociente cSF/suero de albúmina (Qalbúmina),un marcador de la integridad de la interfaz hematoencefálico (BBI) y el índice de proteínas(proteínaQ /Qalbumin),una estimación de la síntesis de proteínas intralacales. Este protocolo ilustra todo el procedimiento, desde el LCM y la recolección de sangre hasta los cálculos de cocientes e índices, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales y el deterioro de la BBI en modelos de ratón de trastornos neurológicos.

Este experimento representativo tenía como objetivo comparar la síntesis intratecal de IgG en dos modelos de esclerosis múltiple (EM) clínicamente relevantes: la enfermedad desmielinizante inducida por el virus de la encefalomielitis de la encefalomielitis murinitis PLP139-151-inducida por la relaperante experimental (R-EAE) y la enfermedad desmielinizante inducida por el virus de la encefalomielitis murine de Theiler(PT-IDD). R-EAE es un modelo útil para entender la EM recurrente-remitente, mientras que el mo...

Los niveles elevados de proteína de líquido cefalorraquídeo pueden ser el resultado de la difusión de proteína plasmática a través de una barrera hematoencefálica alterada o de la síntesis intratecal. En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado que ayuda a discriminar ambos casos y proporciona mediciones cuantitativas de proteínas sintetizadas intratecalmente.

Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Este protocolo permite que el FSB y la recolección de sangre en la corrección cuantitativa de los niveles de proteína del FCA mida en una síntesis de proteínas del ratón en modelos de ratón de trastornos neurológicos. Este procedimiento proporciona una línea de base, contra la cual se puede evaluar el origen fisiopatológico de las proteínas de interés del CSF, y la estabilidad y la importancia funcional del cáncer de contraprocidad en sangre. El análisis de la síntesis de proteínas interteales y la integridad de la barrera se puede aplicar a otros modelos animales y estudios en humanos.Por ejemplo, para comprobar si hay enfermedades del sistema nervioso central. La recolección de volúmenes significativos de FPC limpio puede ser técnicamente difícil en ratones, por lo que se recomienda practicar la técnica hasta obtener grandes volúmenes de muestras no contaminadas. Demostrando los procedimientos estará Micheal Linzey, un estudiante de posgrado del programa de medicina experimental y molecular de Dartmouth, en nuestro nuevo grupo de investigación en inmunología.Para la recolección de suero a través de sangrado orbital retro. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del

quantitative-measurement-of-intrathecally-synthesized-proteins-in-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Transgénicos (Tg) los modelos de ratón de Alzheimer proporcionan una excelente oportunidad para investigar cómo y por qué los niveles de Aß y tau en el cambio CSF ​​conforme progresa la enfermedad en pacientes humanos. Este sentido, demuestran una refinada técnica de punción cisterna magna para el muestreo de LCR de serie del ratón.

Una técnica para la recolección de serie del líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna en el ratón

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Este video muestra la tinción de inmunofluorescencia de un corte de cerebro de ratón para cuantificar la distribución de una proteína presináptica específica. El proceso consiste en el bloqueo de sitios inespecíficos, la aplicación de anticuerpos primarios para la proteína diana y un marcador de referencia, seguido de un marcaje de anticuerpos secundarios y una contratinción nuclear. El marcador de referencia garantiza una cuantificación precisa al proporcionar una línea de base consistente, y...

Cuantificación de la distribución de una proteína presináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

La identificación de moléculas y vías que controlan la plasticidad sináptica y la memoria sigue siendo un desafío importante en la neurociencia. Aquí, se describe un flujo de trabajo que aborda la cuantificación relativa de las proteínas sinápticas supuestamente involucradas en la reorganización molecular de las sinapsis durante el aprendizaje y la consolidación de la memoria en un paradigma de aprendizaje auditivo.

Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

Se describe un procedimiento de medición de referencia para la cuantificación absoluta de Aβ1-42 en LCR humano basado en la extracción en fase sólida y la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida.

La cuantificación absoluta de Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; En el LCR utilizando un procedimiento de medición de referencia de espectrometría de masas

Hemos generado con éxito dos ensayos de sustrato específico γ-secretasa. Ambos ensayos celulares presentados aquí están diseñados para cuantificar las actividades enzimáticas de la γ-secretasa a través de la salida de los reporteros de luciferasa de luciérnaga.

Para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células

La síntesis de proteínas es un proceso biológico crítico para las células. En el cerebro, es necesario para los cambios adaptativos. La medición de las tasas de síntesis de proteínas en el cerebro intacto requiere consideraciones metodológicas cuidadosas. Aquí presentamos el método autoradiográfico cuantitativo L-[1-14C]-leucina para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales in vivo.

Método autoradiográfico cuantitativo para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales in Vivo

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Este método describe un enfoque robusto y reproducible para la comparación de los niveles de proteína en distintos tejidos y en diferentes puntos de tiempo del desarrollo usando un enfoque Blot western cuantitativo estandarizado.

Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Este protocolo está diseñado para cuantificar eficientemente la actividad del sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) en diferentes compartimentos celulares del cerebro de roedores. Los usuarios pueden examinar el funcionamiento de UPS en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en el mismo animal, reduciendo la cantidad de tiempo y número de animales necesarios para realizar estos análisis complejos.

Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

En este trabajo se describe un protocolo para la cuantificación de modificaciones globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral aislada. El trabajo también contiene el protocolo de aislamiento de microglía que se utilizó para la recolección de datos.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Aprende a medir proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones mediante recolección de líquido cefalorraquídeo y sangre. Este protocolo permite diferenciar entre alteraciones de la barrera hematoencefálica y síntesis intratecal en modelos de trastornos neurológicos.

Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones

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