Name: Cuantificación de células proliferativas y muertas en enteroides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda a cuantificar células proliferativas y muertas en enteroides de ratón mediante citometría de flujo. Este protocolo permite evaluar efectos de fármacos y citocinas en células epiteliales intestinales.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31971062, 31900326 y 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Universidad de Nanjing (KF-GN-202004). La Fundación de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior Jiangsu de China (19KJB320003), el Programa de Vida y Tecnología de la Ciudad de Suzhou (SYS2019030), y el Programa de Innovación en Investigación para Graduados Universitarios de la Provincia de Jiangsu (KYCX19-1981) . Este trabajo también cuenta con el apoyo de Tang Scholar de la Universidad de Soochow.

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Recursos Genómicos de Cambridge-Suda (CAM-SU) de la Universidad de Soochow.
1. Aislamiento y cultivo organoides intestinales
<ol><li>Aislamiento de criptas intestinales y cultura enteroide<ol>
<li>Eutanasia un ratón de tipo salvaje de 8 semanas de edad con inhalación deCO2. Use fórceps tisulares y tijeras de iris finas para diseccionar aproximadamente 8 cm de íleon.</li>
		<li>Enjuague con una jeringa con aguja de alimentación de gavage con aproximadamente 40 ml de salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco en frío, luego corte longitudinalmente con tijeras y abra el íleon.</li>
		<li>Cortar el íleon en trozos pequeños (0,5 x 1,0 cm). Coloque las piezas en 5 ml de DPBS estéril en frío hielo en un tubo cónico de 15 ml, luego roca durante 5 minutos sobre hielo.</li>
		<li>Utilice un controlador de pipeta para aspirar el DPBS y reemplazarlo por 10 ml de búfer frío 1 (2 mM EDTA en DPBS). Roca durante 30 minutos sobre hielo.</li>
		<li>Utilice el controlador de pipeta para aspirar el búfer 1 y reemplazarlo por 10 ml de tampón frío 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM de sacarosa en DPBS). Agitar durante 2 x 3 minutos a mano (80 sacudidas/min).</li>
		<li>Tome una gota de 20 l de contenido de tampón 2 después de agitar e inspeccionar bajo un microscopio.</li>
		<li>Filtrar el contenido del búfer 2 con un colador de celda estéril de 70 m, luego recoger el tampón filtrado con un tubo cónico de 50 ml.</li>
		<li>Pipetear 20 l de filtrado en la diapositiva para contar las criptas. Transfiera un volumen suficiente del buffer 2 del paso 1.1.7 para asegurarse de que hay 500 criptas/pozo.</li>
		<li>Girar hacia abajo a 150 x g durante 10 min a 4 oC. Una vez que el hilado está terminado, aspirar cuidadosamente el sobrenadante.</li>
		<li>Suspenda las criptas en 50 l de matriz de membrana del sótano (por ejemplo, Matrigel) por 500 criptas, pipeta hacia arriba y hacia abajo (teniendo cuidado de evitar burbujas), luego coloque una gota de 50 l de matriz de membrana del sótano / mezcla de cripta en el centro de un pozo en una placa de 24 pozos. Incubar durante 30 min a 37oC para polimerizar la matriz de membrana del sótano.</li>
		<li>Después de 30 min de polimerización, agregue cuidadosamente 600 l de medios minigut (medio eagle modificado avanzado de Dulbecco [DMEM]/F12, 2 mM L-alanina-L-glutamina, pluma/estreptococo [100 unidades/ml], 10 mM hepes, Suplemento N2 [1:100], suplemento B27 [1:50] con factor de crecimiento epidérmico [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], y Y27632 [10 m]) a cada pocil, luego devuelva la placa a la incubadora de 37 oC. Observe bajo un microscopio cada día y cambie el medio cada 2 a 3 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passaging enteroide NOTA: Para cultivos largos, los enteroides deben dividirse aproximadamente cada semana.<ol>
<li>Para pasar los enteroides, coloque la placa de cultivo de tejido según el hielo. Aspirar los medios y añadir 1 mL de DPBS frío a cada poca. Utilice una punta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos sólidos de matriz de membrana de sótano.</li>
		<li>Pasar hacia arriba y hacia abajo una vez a través de una jeringa de insulina de 1 ml (27 G) y en un tubo cónico de 15 ml. Girar hacia abajo durante 5 min a 150 x g a 4 oC.</li>
		<li>Utilice la pipeta para eliminar DPBS. Resuspender en 50 l de matriz de membrana de sótano/pozo.</li>
		<li>Colocar la placa en una incubadora de 37oC durante 30 minutos para permitir que la matriz de membrana del sótano se polimerice. Superponga cada pozo con 600 l de medios ENR (medios minigut, EGF de 50 ng/ml, Noggin de 100 ng/ml, 500 ng/ml de R-espondina), luego devuelva la placa a la incubadora.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análisis de citometría de flujo de células positivas edU en enteroides
NOTA: La Figura 1 muestra el flujo de trabajo para el análisis de citometría de flujo de celdas positivas de EdU en enteroides.
<ol><li>Incubación de enteroides con EdU<ol>
<li>Cultivar enteroides desde el paso 1.2.4 durante 5-7 días. Pasaje enteroides en una nueva placa de 24 pozos en una relación de división de 1:2. Añadir 600 sl de medio ENR a cada poca. Incubar enteroides durante 4 o 5 días en una incubadora de 37oC.</li>
		<li>Establezca el grupo de control (enteroides no tratados) y el grupo experimental (enteroides tratados con interleucina de 5 ng/ml 22 [IL-22]). Prepare al menos tres réplicas para cada grupo.</li>
		<li>Añadir EdU al medio ENR para preparar el medio de EdU con una concentración de 50 m. Añadir 600 ml de medio de EdU a cada poca y incubar durante 2 h en una incubadora de 37oC. Establezca un pozo de enteroides sin tratamiento EdU como un control negativo para la resta de fondo.</li>
	</ol></li>
	<li>Cosecha de enteroides de la matriz de membrana del sótano<ol>
<li>Utilice un controlador de pipeta para aspirar el medio EdU y lavar 1x con DPBS. Añadir 1 mL de DPBS.</li>
		<li>Utilice la punta de la pipeta P1000 y la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos sólidos de matriz de membrana de sótano. Pasar a un tubo de 15 ml y girar hacia abajo a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 500 l de enzimas de disociación celular(Tabla de materiales)e incubar durante 15 min a 37 oC. Utilice la punta de la pipeta P200 y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para descomponer los enteroides en células individuales.</li>
		<li>Añadir 3 ml de medio DMEM que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) y pipetear repetidamente con una punta de pipeta P1000.</li>
		<li>Gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min y aspire el medio sobrenadante. Resuspenda las celdas con 1 ml de DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Fijación y permeabilización de células<ol>
<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml, gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda las células con 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA), fije durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) y gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min.</li>
		<li>Resuspender células con 1 ml de tensioactivo no iónico al 0,5%. Incubar durante 10 min a RT.</li>
		<li>Gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Lavar 1x con DPBS y girar hacia abajo para eliminar el sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Detección de EdU<ol>
<li>Prepare las soluciones de stock para cada componente de antemano: 1) solución de trabajo de la solución de trabajo Alexa Fluor azide, 2) de 1 búfer de reacción EdU y 3) solución de stock 10x de aditivo de búfer EdU.</li>
		<li>Prepare 1 aditivo tampón EdU diluyendo la solución 10x 1:10 en agua desionizada. Prepare esta solución fresca.</li>
		<li>Preparar el cóctel de reacción de acuerdo con la Tabla 1. NOTA: Agregue los ingredientes en el orden indicado en la tabla. Utilice el cóctel de reacción dentro de los 15 minutos de la preparación.</li>
		<li>Añadir 100 l de cócteles de reacción a cada tubo de 1,5 ml. Resuspender las células, proteger de la luz, incubar durante 30 minutos a RT.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min y aspirar suavemente la solución de reacción con la punta de la pipeta.</li>
		<li>Añadir un tensioactivo no iónico penetrante a cada tubo para lavar 1x en RT. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, aspirar el sobrenadante con punta de pipeta suavemente, y resuspender las células en 1 ml de DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de células por citometría de flujo<ol>
<li>Filtre las celdas resuspendidas con un colador de 40 m y, a continuación, recoja las celdas filtradas con un tubo cónico de 15 ml. Realice la detección en la máquina FACS tan pronto como sea posible. NOTA: Si las condiciones son limitadas, las muestras manchadas de celda deben almacenarse en la oscuridad a 4 oC y probarse en un plazo de 3 días.</li>
		<li>Seleccione el canal apropiado (según el tipo de azida de Alexa Fluor en el kit EdU; aquí, canal rojo) y voltaje (aquí, 150–350 V) para el análisis de citometría de flujo.</li>
		<li>Estrategia de Gating<ol>
<li>Dibuje una gráfica de pseudocolor FSC-A (eje x) frente a SSC-A (eje y) y distribuya la mayoría de las celdas al rango visible del mapa de puntos ajustando el voltaje. Seleccione la población celular (R1) y excluya los residuos celulares en la esquina inferior izquierda.</li>
			<li>A partir de la población celular R1, establezca un FSC-A (eje x) vs. Gráfica de pseudocolor FSC-H (eje y) y establezca la puerta para seleccionar celdas individuales (R2) para excluir los grumos de celda.</li>
			<li>A partir de la población celular R2, establecer la intensidad de fluorescencia (eje x) vs. número de celda (eje Y) y utilice el control negativo para establecer la puerta. La región de la señal fluorescente es una región celular positiva (R3). Compare la relación de células positivas de EdU (R3) entre los grupos experimentales y de control.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis de citometría de flujo de células PI-positivas en enteroides
NOTA: La Figura 2 muestra el flujo de trabajo para el análisis de citometría de flujo de celdas PI positivas en enteroides.
<ol><li>Incubación de células enteroides con PI<ol>
<li>Cultivar enteroides desde el paso 1.2.4 durante 5-7 días. Pasaje enteroides en una nueva placa de 24 pozos en una relación de división de 1:2. Añadir 600 sl de medio ENR a cada poca. Incubar enteroides durante 4 o 5 días en una incubadora de 37oC.</li>
		<li>Establezca el grupo de control (sin tratar) y el grupo experimental (tratado con IL-22), utilizando al menos tres réplicas para cada grupo.</li>
		<li>Añadir PI al medio ENR para preparar el medio PI con una concentración de 3 m.</li>
		<li>Añadir 600 éL de pi médium a cada poca y incubar durante 30 min en una incubadora de 37oC. Establezca un pozo de enteroides sin tratamiento PI como un control negativo para la resta de fondo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cosecha enteroides de la matriz de membranadel sótano siguiendo los pasos 2.2.1-2.2.5.</li>
	<li>Análisis de células por citometría de flujo<ol>
<li>Filtrar las células resuspendidas con un colador de 40 m y recoger las células filtradas con un tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Realice la detección en la máquina FACS tan pronto como sea posible. NOTA: Si las condiciones son limitadas, las muestras manchadas de celda deben almacenarse en la oscuridad a 4 oC y probarse en un plazo de 3 días.</li>
		<li>Seleccione el canal apropiado (aquí, canal rojo) y el voltaje (aquí, 150–350 V) para el análisis de citometría de flujo.</li>
		<li>Utilice la misma estrategia de gating que se describe en la sección 2.5.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo detalla los pasos necesarios para el cultivo de enteroides in vitro y la cuantificación de células EdU y PI-positivas en los enteroides por citometría de flujo. Hay varias ventajas de esta estrategia. En primer lugar, el etiquetado EdU se utiliza para detectar células que proliferan en enteroides. En comparación con el ensayo tradicional de BrdU, el método de etiquetado EdU es más rápido, más sensible y más preciso. EdU es muy similar a la timina (T), que reemplaza la timina en la síntesis de ADN durante l...

Una función fundamental de las células epiteliales intestinales es proteger la entrada de contenidos luminales como bacterias patógenas y toxinas1,2. Para realizar tal función, las células madre intestinales proliferan y diferencian continuamente en una variedad de células epiteliales, incluyendo enterocitos y células secretoras, que forman una barrera mediante la formación de conexiones estrechas3. La rápida renovación de las células epiteliales intestinales requiere una estricta coordinación de la proliferación celular, la diferenciación celular y la muerte celular4,5. La reducción de la proliferación celular o la muerte celular excesiva conduce a daño epitelial y función de barrera comprometida1,6. La disfunción de la barrera intestinal se ha asociado con enfermedades inflamatorias intestinales7,8.
Un método para cultivar criptas intestinales ha sido desarrollado previamente. Usando esta técnica, las criptas de ratón aisladas crecen en organoides intestinales (enteroides), que tienen estructuras similares a criptas y contienen todo el linaje celular epitelial intestinal9,10. 5-Etil-2'-desoxiuridina (EdU) es un análogo de timidina que es capaz de reemplazar la timina (T) en el ADN que se está replicando durante la proliferación celular. Las células proliferativas pueden ser etiquetadas rápida y precisamente por la tinción edU. El yoduro de propiduro (PI) es un análogo del bromuro de etidio que libera fluorescencia roja al insertarse en ADN de doble cadena. PI detecta específicamente las células muertas, ya que sólo pasa a través de la membrana celular dañada.
En este protocolo, primero describimos cómo aislar las criptas del intestino delgado murino y luego cultivarlas como enteroides in vitro. A continuación, describimos cómo analizar las células proliferativas y muertas en los enteroides por la incorporación de EdU y PI y la citometría de flujo.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>aguja de sonda nasogástrica de 22 g</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 mm filtro de células estériles</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70 mm filtro de células estériles</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de enfoque acústico avanzado DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td><td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Tampón 1</td><td></td><td></td><td>2 mM EDTA en DPBS</td></tr><tr><td>Tampón 2</td><td></td><td></td><td>54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sacarosa en</td></tr><tr><td>ratones</td> <td>DPBS C57/B6Instituto de Investigación Biomédica de Nanjing de la Universidad</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>Enzimas de disociación celular (TrypLE)</td><td>Life technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Kit de imágenes</td><td>Life tecnologías</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr> 14190144 <tr><td>D-sorbitol</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>ENR medios</td><td></td><td></td><td>Medios miniintestino, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-espondina</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris finas</td><td>Tansoole</td><td>2037454</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Life technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Matrigel Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut media</td><td></td><td></td><td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 unidades/ml), 10 mM Hepes, suplemento de N2 (1:100), suplemento de B27 (1:50)</td></tr><tr><td>Suplemento de N2</td><td>R& D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>Surfactante no iónico (Triton X)</td><td></td><td>BBI TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tijera de operación (12,5 cm)</td><td>Tansoole</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>sigma</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>EGF Recombinante</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Recombinante Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Recombinante R-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murine IL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>BBI</td><td>SB0498</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de tejido</td><td>Tansoole</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de células proliferativas y muertas en enteroides

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

El epitelio intestinal actúa como una barrera que impide que el contenido luminal, como la microbiota patógena y las toxinas, entre en el resto del cuerpo. La función de barrera epitelial requiere la integridad de las células epiteliales intestinales. Mientras que la proliferación de células epiteliales mantiene una capa continua de células que forma una barrera, daño epitelial conduce a la disfunción de barrera. Como resultado, el contenido luminal puede atravesar la barrera intestinal a través de una vía sin restricciones. La disfunción de la barrera intestinal se ha asociado con muchas enfermedades intestinales, como la enfermedad inflamatoria intestinal. Las criptas intestinales aisladas del ratón se pueden cultivar y mantener como estructuras similares a la cripta, que se denominan organoides intestinales o "enteroides". Los enteroides son ideales para estudiar la proliferación y muerte celular de las células epiteliales intestinales in vitro. En este protocolo, describimos un método simple para cuantificar el número de células proliferativas y muertas en enteroides cultivados. 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU) y yoduro de propidium se utilizan para etiquetar células proliferantes y muertas en enteroides, y la proporción de células muertas y proliferantes se analizan por citometría de flujo. Esta es una herramienta útil para probar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación de células epiteliales intestinales y la supervivencia celular.

Pequeñas criptas intestinales fueron aisladas y cultivadas como enteroides en la matriz de membrana del sótano. Enteroids comenzó a formar brotes 2 días después del aislamiento. En el día 6, los enteroides tenían muchos cogollos con muchos desechos (células muertas) en el lumen. Los enteroides estaban listos para ser repasados en esta etapa(Figura 3).
Numerosos estudios han demostrado que las citoquinas inflamatorias son esenciales para el mantenimiento de la home...

El protocolo presentado utiliza citometría de flujo para cuantificar el número de células muertas y proliferantes en enteroides de ratón cultivados. Este método es útil para evaluar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación y supervivencia de los organoides.

Cuantificación de células proliferativas y muertas en enteroides

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Este protocolo es útil para el aislamiento enteroide en un cultivo, además de investigar la proliferación celular y la supervivencia en enteroides. Los científicos pueden aplicar esta técnica a los enteroides de cultivo y para estudiar el efecto de los medicamentos y las citoquinas inflamatorias en las células epiteliales intestinales in vitro. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de agua de la enfermedad inflamatoria intestinal.Aplicamos este método para encontrar algunas citoquinas terapéuticas. Este método proporciona información sobre la proliferación epitelial intestinal y la supervivencia;además también se puede utilizar en organoides, cultivados alrededor de tejidos distintos del intestino. Para aislar criptas intestinales y realizar cultivos enteroides, utilice fórceps tisulares y encuentre tijeras de iris para diseccionar aproximadamente ocho centímetros de íleon de un ratón de tipo salvaje eutanizado de ocho semanas de edad.Utilice una jeringa con una aguja de alimentación de gavage para lavar el íleon con unos 40 mililitros de hielo frío Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, luego corte longitudinalmente con tijeras y abra el íleon. Corte el íleon en trozos pequeños y colóquelos en cinco mililitros de DPBS estériles helados en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego mece la muestra durante cinco minutos sobre hielo.Utilice un controlador de pipeta para aspirar el DPBS y reemplazarlo con 10 mililitros de tampón frío uno. Después de balancear durante 30 minutos sobre hielo, utilice el controlador de pipeta para aspirar el buffer uno y reemplazarlo con 10 mililitros de tampón frío dos. A continuación, agitar durante dos o tres minutos a mano a aproximadamente 80 batidos por minuto.Después de agitar, inspeccione una gota de veinte micro litros de buffer dos contenidos bajo un microscopio para asegurarse de que hay criptas con células Paneth granulares. Filtre el búfer dos contenidos con un colador celular estéril de 70 micras y recoja el búfer filtrado en un tubo cónico de 50 mililitros. Pipetear 20 microlitros de filtrado en la diapositiva para contar las criptas.Transfiera un volumen suficiente del búfer filtrado dos contenidos para asegurarse de que hay aproximadamente 500 criptas por pozo. Gire a 150 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y luego aspire cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las criptas en 50 microlitros de matriz de membrana sótano por 500 criptas.Pipetear hacia arriba y hacia abajo teniendo cuidado de evitar burbujas. Coloque una gota de 50 microlitros de matriz de membrana de sótano y mezcla de cripta en el centro de un pozo de una placa de 24 pozos. Incubar durante 30 minutos a 37 grados Celsius para polimerizar la matriz de membrana del sótano.Después de 30 minutos de polimerización, agregue cuidadosamente 600 microlitros de medios minigut a cada pozo. Devuelva la placa a la incubadora de 37 grados Celsius, y observe bajo un microscopio cada día, cambiando los medios cada dos o tres días. Para pasar los enteroides, coloque la placa de cultivo de tejido sobre hielo, aspire los medios y agregue un mililitro de DPBS frío a cada pozo.Utilice una punta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos de matriz. Pase la muestra a través de una jeringa de insulina de un mililitro y hacia abajo en un tubo cónico de 15 mililitros. Después de girar hacia abajo durante cinco minutos a 150 veces G y cuatro grados Celsius, utilice una pipeta para quitar el DPBS.Vuelva a suspender los enteroides en 50 microlitros de matriz de membrana sótano por pozo. Coloque la placa en la incubadora de 37 grados Celsius durante 30 minutos para permitir que la matriz de membrana del sótano se polimerice. A continuación, superponga cada pozo con 600 microlitros de medios ENR y devuelva la placa a la incubadora.Cultivar enteroides durante cinco a siete días antes de pasarlos en una nueva placa de 24 pozos usando una relación de división de uno a dos. Añadir 600 microlitros de medio ENR a cada pozo, y luego incubar los enteroides durante cuatro a cinco días en la incubadora de 37 grados Celsius. Configurar el grupo de control de enteroides no tratados y el grupo experimental de enteroides tratados con cinco nanogramos por mililitro de interleucina-22.Prepare al menos tres réplicas para cada grupo. Añadir 600 microlitros de medio EdU a cada pozo de enteroides, excepto uno bien para usar como control negativo para la resta de fondo. Incubar la placa durante dos horas en una incubadora de 37 grados centígrados.Para cosechar enteroides de la matriz de membrana del sótano, utilice un controlador de pipeta para aspirar el medio EdU y lavar una vez con DPBS. A continuación, agregue un mililitro de DPBS. Utilice una punta de pipeta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos sólidos de matriz de membrana de sótano.Transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros y gire hacia abajo a 300 veces G durante cinco minutos antes de desechar el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de enzimas de disociación celular e incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, utilice una punta de pipeta P200 para pipetear hacia arriba y hacia abajo y descomponer enteroides en células individuales.A continuación, añada tres mililitros del medio de águila modificada de Dulbecco que contenga un suero bovino 10% fetal, y pipetear repetidamente con una punta de pipeta P1000. Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, y aspirar el sobrenadante, suspendemos las células en un mililitro de DPBS. Para realizar la fijación y permeabilización de las células, primero transfiera la suspensión celular a un tubo de un punto y cinco mililitros, gire hacia abajo a 300 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.Suspendemos las células en un mililitro de 4%paraformaldehído y arreglamos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante con una punta de pipeta. Lave las células una vez con el DPBS, y gire hacia abajo de nuevo para quitar el sobrenadante.Resuspender las células con un mililitro de 0.5%surfactante no iónico, e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de lavar las células con DPBS como antes. Para detectar el EdU, añada 100 microlitros de cóctel de reacción a cada tubo de 1,5 mililitros. Resuspender las células, y protegerlas de la luz, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, aspirar suavemente la solución de reacción con una punta de pipeta Añadir 0.5% tensioactivo no iónico penetrante a cada tubo para lavar una vez a temperatura ambiente. Después de la centrifugación como antes, suspendemos las células en un mililitro de DPBS. Filtrar las células resuspendidas con un colador de 40 micras y recoger las células filtradas en un tubo cónico de 15 mililitros.Realice los hechos sobre la detección de la máquina tan pronto como sea posible. Seleccione el canal y la tensión adecuados para el análisis de citometría de flujo. Para la estrategia de medición, dibuje una gráfica pseudocolor FSC-A frente a SSC-A y distribuya la mayoría de las celdas al rango visible del mapa de puntos ajustando el voltaje.Seleccione la población de celdas como R1 y excluya los restos de celda en la esquina inferior izquierda. A partir de la población celular R1, establezca una gráfica pseudocolor FSC-A versus FSC-H. Establezca la puerta para seleccionar celdas individuales designadas como R2 y excluir grumos de celda.Desde la población de células R2, establezca la intensidad de fluorescencia frente a la gráfica de número de celda y utilice el control negativo para establecer la puerta. La región de la señal fluorescente es una región celular positiva designada R3.Compare la relación de estas células positivas EdU entre los grupos experimentales y de control. Pequeñas criptas intestinales fueron aisladas y cultivadas como enteroides en la matriz de membrana del sótano.Los enteroides comenzaron a formar brotes dos días después del aislamiento. En el sexto día, los enteroides tenían muchos cogollos con muchos escombros en el lumen. Los enteroides estaban listos para ser pasados en esta etapa.Los enteroides fueron tratados con IL-22 durante 3 días, después de lo cual el ADN sintético fue etiquetado con EdU en rojo para indicar la proliferación celular. Los enteroides tratados IL-22 mostraron un mayor número de células positivas de EdU. IL-22 aumentó las células proliferantes del 40,1% al 83,5% según lo analizado por la citometría de flujo.El tratamiento con IL-22 también aumentó la muerte celular en enteroides indicados por la tinción de yoduro propidium en rojo. IL-22 aumentó las células muertas del 4,9% al 16,2% según lo analizado por la citometría de flujo. Durante el progreso de aislamiento de la cripta se necesita un temblor justo después de agregar búfer para asegurarse de que se sacuden suficientes criptas.Aconsejamos inspeccionar el contenido bajo microscopio. Después de este procedimiento, también podemos cuantificar los tipos de epiteliales y enteroides diferenciados mediante el uso específico Este método ayudará a los investigadores a investigar la diferenciación epitelial intestinal en enteroides. Después de su desarrollo, esta pregunta allana un camino para que los investigadores en el campo de la gastroenterología exploren las cuestiones de desarrollo o patológicas en el corte.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Describimos un método para establecer enteroides humanos a partir de criptas del intestino delgado y colonoides a partir de criptas de colon recogidas tanto de tejido quirúrgico como de biopsias. En este artículo metodológico, presentamos las modalidades de cultivo que son esenciales para el crecimiento y mantenimiento exitoso de enteroides y colonoides humanos.

Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

Enteroids se perfila como un modelo novedoso en el estudio de las enfermedades humanas. El protocolo describe cómo simular un modelo enteroide de enterocolitis necrosante humana tratamiento de lipopolisacárido (LPS) de enteroids generados a partir de tejido neonatal. Enteroids recogidos demuestran cambios inflamatorios similares a los observados en humana enterocolitis necrotizante.

Un modelo de enteroide epitelial humano novedoso de Enterocolitis necrosante

Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la...

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides, un modelo intestinal tridimensional, a partir del tejido intestinal fetal. Se utilizaron imágenes inmunofluorescentes de biomarcadores epiteliales para la caracterización del modelo. La exposición apical de lipopolisacáridos, una endotoxina bacteriana, mediante la técnica de microinyección indujo la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la dosis medida por la fuga de dextrano fluorescente.

Prueba de permeabilidad epitelial en enteroides derivados de tejido fetal

Este protocolo describe un modelo in vitro de enterocolitis necrotizante (ECN), que puede utilizarse para estudios mecanicistas de patogénesis de la enfermedad. Cuenta con un chip microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados del intestino neonatal humano, células endoteliales y el microbioma intestinal de un neonato con ECN grave.

Modelo microfluídico de enterocolitis necrotizante que incorpora enteroides, enteroides, intestinos neonatales humanos y un microbioma disbiótico

Los enteroides están emergiendo como un modelo novedoso para estudiar la fisiología y la fisiopatología de los tejidos, el desarrollo de fármacos y la medicina regenerativa. Aquí, describimos un sistema de cultivo derivado de enteroides 2D de células primarias bovinas que permite el cocultivo con tipos de células de tejido relevantes. Este modelo ofrece una ventaja traslacional para el modelado de la investigación gastrointestinal.

Generación de un sistema de cultivo monocapa bidimensional derivado de enteroide primario bovino para aplicaciones en investigación biomédica traslacional

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Cuantificación de la muerte celular inducida por citocinas en organoides colónicos humanos mediante microscopía de fluorescencia en vivo

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Aprenda a cuantificar células proliferativas y muertas en enteroides de ratón mediante citometría de flujo. Este protocolo permite evaluar efectos de fármacos y citocinas en células epiteliales intestinales.

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