Integración de Enfoques Bioinformáticos y Validaciones Experimentales para Entender el Papel de la Señalización de Muesca en el Cáncer de Ovario

La bioinformática es una forma útil de extraer información de conjuntos de datos. La experimentación es igualmente importante para la validación. Combinamos ambos enfoques para investigar el papel de la señalización de muesca en el cáncer de ovario.

La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden utilizar la información de las bases de datos bioinformáticas para planificar su dirección de investigación antes de realizar un experimento. Con los datos bioinformáticos acumulados de enfermedades humanas, los científicos ya no tienen los ojos vendados. La experimentación se puede realizar para validar hallazgos específicos, lo que puede conducir a terapias mejoradas o diagnóstico de enfermedades.

Para el análisis meta-A de la asociación de un gen de interés con un tipo específico de cáncer, cree una cuenta con una dirección de correo electrónico afiliada académica para acceder a la base de datos PRECOG e introduzca la dirección de correo electrónico y la contraseña asociadas con la cuenta en el terminal de inicio de sesión. Haga clic en Ver detalles e introduzca el gen de interés en la barra de búsqueda. A continuación, utilice la barra de desplazamiento para obtener la puntuación Z de supervivencia para el tipo específico de cáncer de interés.

Para investigar la asociación entre los niveles de expresión génica y las etapas del cáncer de ovario, vaya a la página web de CSIOVDB e introduzca el nombre del gen de interés en la barra de búsqueda. A continuación, haga clic en la pestaña Supervivencia. Para evaluar los datos de expresión génica en diversos tejidos normales y tumorales, vaya al portal de GENT y haga clic en la pestaña Buscar.

En la sección de palabras clave, seleccione el símbolo genético para los términos en el menú desplegable, introduzca el símbolo del gen del gen de interés y seleccione Tejido para la opción de tipo. Haga clic en el botón Buscar. Se mostrarán gráficos resumidos de la expresión génica en tejidos normales y tumorales de diferentes tipos de cáncer, basados en las plataformas U133A y U122 Plus 2.

A continuación, haga clic en el vínculo Descarga de datos de resultados para acceder a la información detallada sobre los valores de expresión génica, los tipos de tejido y las fuentes de datos. Para buscar alteraciones genéticas y redes de señalización, abra la página web del portal CBIO y, utilizando la consulta en la página de destino, haga clic en los órganos o tejidos de interés en la sección Estudios selectos, seleccione el estudio de interés en particular y haga clic en Consultar por genea. En la sección Seleccionar perfiles genómicos, seleccione las mutaciones, las alteraciones del número de copia putativa de GISTIC o la opción de expresión de ARNm.

Seleccione los datos correspondientes en el menú Seleccionar conjunto de pacientes/casos e introduzca los símbolos genéticos de destino en el cuadro de consulta Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar consulta y abra la pestaña Red para recuperar la red génica deseada. A continuación, haga clic en la pestaña Archivo y seleccione Guardar como imagen PNG para descargar imágenes de red.

Para crear moscas con NICD o NICD y mam overexpression, prepare las existencias de mosca apropiadas y aplique la técnica de segmentación de expresión génica temporal y regional para controlar la expresión génica espaciotemporal, de acuerdo con los protocolos estándar. Levante las moscas a 18 grados centígrados hasta la edad adulta, antes de cambiar a 29 grados celsius con levadura durante 48 horas. Al final de la incubación de 29 grados Celsius, añadir tres mililitros de PBS a un plato de recolección de embriones, y anestesiar el cultivo de la mosca con una almohadilla de dióxido de carbono.

Usa un microscopio diseccionado para identificar una mosca hembra anestesiada, y usa un par de fórceps diseccionados para agarrar cuidadosamente el tórax inferior de la mosca. Sumergir la mosca en el PBS dentro de la placa de recolección de embriones, y utilizar un segundo par de fórceps para pellizcar la parte inferior del abdomen, tirando suavemente para liberar los órganos internos. Localice y desasocie el par de ovarios del cuerpo de la mosca, y rompa la vaina muscular, situada en el extremo posterior de los ovarios, para separar los ovarios.

A continuación, coloque los ovarios aislados en un tubo centrífuga de 1,5 mililitros, que contiene 500 microlitros de PBS sobre hielo. Cuando se hayan recogido todos los ovarios, sustituya el PBS por 500 microlitros de 4%formaldehído y coloque el tubo en un encientedor durante 10 minutos. Al final de la incubación, deseche el fijador y lave los ovarios con tres enjuagues de 15 minutos en un mililitro de PBT por lavado.

Después del último lavado, etiquete los ovarios con 150 microlitros de 10 microgramos por mililitro DAPI durante 10-15 minutos en el encientedor. Al final de la incubación, lave los ovarios una vez durante 10 minutos con un mililitro de PBT, seguido de dos lavados de 10 minutos en PBS. Después del segundo lavado, retire todos los microlitros de PBS excepto los últimos, y utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para trillarar los ovarios varias veces para liberar las cámaras de óvulos.

A continuación, sedimentar suavemente el tejido ovárico a través de un giro rápido en una microcentrífuga, y eliminar tanto PBS como sea posible sin alterar el pellet de ovario. Con una punta de pipeta de 1.000 microlitros, transfiera unas tres gotas de solución de montaje al tubo y utilice una punta de pipeta de 200 microlitros con aproximadamente 0,33 milímetros recortados desde el extremo para transferir las 120 microlitros completas de solución de montaje que contiene ovario en una diapositiva de microscopio de vidrio. Coloque suavemente un vidrio de tapa sobre la solución de montaje y selle los bordes con esmalte de uñas transparente.

A continuación, utilice un microscopio confocal con un aumento de 10x con una apertura de 0,8 para adquirir imágenes de los ovarios manchados y montados. Utilizando el portal PRECOG como se ha demostrado, se pueden obtener las puntuaciones Z de NOTCH2, NOTCH3 y MAML1 en cáncer de ovario. Los valores negativos de puntuación Z indican la supervivencia global deficiente de los pacientes con altos niveles de expresión de los tres genes.

El uso de la base de datos CSIOVD para confirmar estos hallazgos indica además que una alta expresión de NOTCH2, NOTCH3 y MAML1 se correlaciona con una supervivencia general y libre de enfermedades deficiente. Otras pruebas de permutación sugieren que NOTCH2, NOTCH3 y MAML1 están altamente expresados en los tejidos tumorales. Sobre la base de estos tres genes principales, se puede crear una red de señalización para proporcionar los 50 genes vecinos alterados con más frecuencia que también están en la misma vía con las tasas de mutación más altas.

De interés, la sobreexpresión del gen NOTCH Drosophila-equivalente, NICD, por sí solo, no induce tumores en Drosophila. Mientras que la sobreexpresión de NICD y mam juntos induce tumores en moscas de la fruta, como lo demuestra la presencia de múltiples capas epiteliales y células acumuladas. Una mayor validación de la experimentación puede allanar el camino para la identificación de posibles nuevos objetivos de terapia farmacológica, biomarcadores de enfermedades y tratamientos personalizados.