Name: Integración de Enfoques Bioinformáticos y Validaciones Experimentales para Entender el Papel de la Señalización de Muesca en el Cáncer de Ovario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprende a integrar bioinformática y validación experimental para investigar la señalización de muesca en cáncer de ovario. Este método computacional permite identificar componentes clave y potenciales dianas terapéuticas mediante análisis de bases de datos y confirmación experimental.

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Este trabajo fue apoyado por Start-Up Funding, College of Science and Mathematics Research Grant, Summer Research Session Award y Research Seed Funding Award de Georgia Southern University.

1. Predicción de los resultados clínicos de los perfiles genómicos (PRECOG)
NOTA: El portal PRECOG (precog.stanford.edu) accede a los datos disponibles públicamente de 165 conjuntos de datos de expresión de cáncer, incluidos los niveles de expresión génica y los resultados clínicos de los pacientes17. Proporciona específicamente el análisis Meta-u2012Z, que incorpora grandes conjuntos de datos para proporcionar puntuaciones de Z-u2012 de diferentes genes en 39 tipos de cáncer para indicar la supervivencia global del paciente. Las tasas de supervivencia deficientes y buenas se indican con valores positivos y negativos de puntuación Z-u2012, respectivamente.
<ol><li>Cree una cuenta con un correo electrónico académico afiliado para acceder a esta base de datos. Introduzca la dirección de correo electrónico y la contraseña asociadas a la cuenta.</li>
	<li>Haga clic en el botón Ver detalles situado debajo del encabezado de análisis Meta-Z.</li>
	<li>Introduzca el gen de interés en la barra de búsqueda.</li>
	<li>Utilice la barra de desplazamiento situada en la parte inferior de la pantalla para obtener la puntuación Z de supervivencia para el tipo de cáncer específico de interés.</li>
</ol>2. CSIOVDB
NOTA: CSIOVDB<a href="http://csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html" target="_blank">(csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html)</a>es una base de datos de microarrays desarrollada por el Instituto de Ciencias del Cáncer de Singapur para estudiar el cáncer de ovario18. Esta base de datos contiene datos de carcinomas de diferentes sitios tumorales, así como datos normales del tejido ováros. Además, CSIOVDB proporciona parcelas de supervivencia Kaplan-u2012Meier para evaluar la supervivencia del paciente con niveles diferenciales de expresión génica. CSIOVDB se puede aplicar para investigar la asociación entre los niveles de expresión génica y las etapas/grados del cáncer de ovario.
<ol><li>Introduzca el gen de interés y, a continuación, haga clic en el botón Buscar.</li>
	<li>Haga clic en la pestaña Estado de la enfermedad. NOTA: Esta pestaña proporciona estadísticas resumidas de la expresión génica del gen objetivo de interés en los estados de la enfermedad del cáncer de ovario.</li>
	<li>Haga clic en la pestaña Histología. NOTA: Esta pestaña proporciona estadísticas resumidas de la expresión génica del gen objetivo de interés en las principales histologías de cáncer de ovario.</li>
	<li>Haga clic en la pestaña Parámetros clinico-patológicos. NOTA: Esta pestaña proporciona una comparación de los niveles de expresión génica entre diferentes etapas del cáncer de ovario, grados y respuestas clínicas con pruebas Mann-Whitney.</li>
	<li>Haga clic en la pestaña Supervivencia. NOTA: Esta pestaña proporciona gráficas Kaplan-Meier asociadas con La supervivencia general y la supervivencia libre de enfermedades. Para esta base de datos, la supervivencia libre de enfermedadse se considera supervivencia libre de progresión y recurrencia18. Los análisis multivariados para la supervivencia general y la supervivencia libre de enfermedades también se encuentran en esta pestaña. Los análisis multivariados comparan características relacionadas con los pronósticos de cáncer de ovario (etapa, grado, desbultamiento quirúrgico, histología, edad) y el gen de interés.</li>
	<li>Haga clic en la pestaña Subtipo. NOTA: Esta pestaña proporciona estadísticas resumidas y pruebas de Mann-Whitney para el nivel de expresión del gen de interés en subtipos moleculares de cáncer de ovario. Esta pestaña también proporciona gráficas Kaplan-Meier asociadas con la supervivencia general y la supervivencia libre de enfermedades del gen de interés en subtipos moleculares de cáncer de ovario.</li>
</ol>3. Expresión génica en el tejido normal y tumoral (GENT)
NOTA: El portal gent (medical-u2012genome.kribb.re.kr/GENT) es desarrollado y mantenido por el Instituto de Investigación de La Biociencia y La Biotecnología de Corea (KRIBB)19. Recopila 16.400 (U133A; 241 conjuntos de datos) y 24.300 (U133plus2; 306 conjuntos de datos) de muestras disponibles públicamente. Después de la estandarización, GENT ofrece datos de expresión génica a través de diversos tejidos, que se dividen en tumores y tejidos normales.
<ol><li>Haga clic en la pestaña Buscar en la parte superior de la pantalla.</li>
	<li>En la sección etiquetada 1. Palabra clave, seleccione el símbolo Gene para los Términos en el menú desplegable, introduzca el símbolo genético del gen de interés en el área en blanco de la sección Palabra clave y seleccione Tejido para la opción Tipo.</li>
	<li>Haga clic en el botón Buscar en la parte inferior de la 1. Sección de palabras clave. Muestra los gráficos resumidos de la expresión génica en tejidos normales y tumorales de diferentes tipos de cáncer basados en las plataformas U133A y U122Plus2. NOTA: Es opcional seleccionar la opción Filtrado de datos en la parte superior del gráfico de resumen para seleccionar una base de datos determinada para estudiar.</li>
	<li>Haga clic en el vínculo situado junto a Descarga de datos de resultados para acceder a la información detallada sobre los valores de expresión génica, los tipos de tejido y las fuentes de datos.</li>
</ol>4. Enciclopedia de la línea celular del cáncer del Instituto Amplio (CCLE)
NOTA: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) fue creado por el Broad Institute y proporciona perfiles genómicos y mutaciones de 947 líneas celulares de cáncer humano20.
<ol><li>Introduzca los genes deseados en la barra de búsqueda y, a continuación, haga clic en el botón Buscar.</li>
	<li>En la sección seleccionada conjunto de datos, haga clic en la opción expresión mRNA (RNAseq) del menú desplegable. NOTA: Otras opciones incluyen expresión de ARNm (Affy), derribo de Aquiles shRNAy númerode copia .</li>
	<li>Haga clic en el botón Alternar todas las trazas. Seleccione el tipo de tejido de interés en el cuadro gris de la derecha. Desplácese hacia abajo hasta la parte inferior de la pantalla y haga clic en el botón Descargar expresión mRNA.</li>
	<li>Abra el documento de texto descargado. Copie y pegue todo el texto en la hoja 1. Copie todo el texto de la hoja 1.</li>
	<li>Haga clic en la hoja en la pestaña Hoja 2 del software de hoja de cálculo en la parte inferior de la hoja de cálculo. Haga clic con el botón derecho en la columna A, seleccione Pegado especialy, a continuación, seleccione la opción Transponer en la hoja 2.</li>
	<li>Una vez que el texto se transpone en dos columnas en la Hoja 2,haga clic en la flecha desplegable para el encabezado de la opción Ordenar y filtrar y luego seleccione la opción Filtro. Aparecerá una flecha en el área de encabezado denominada Gene. Haga clic en la flecha y escriba el tipo de tejido de interés. NOTA: Este paso filtrará todos los datos y solo mostrará los niveles de expresión génica para el tipo de tejido de interés.</li>
</ol>5. cBioPortal
NOTA: cBioPortal (www.cioportal.org) fue desarrollado en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), y accede, analiza y visualiza datos genómicos de cáncer a gran escala21,22. Específicamente, este portal permite a los investigadores buscar alteraciones genéticas y redes de señalización.
<ol><li>Mediante la consulta de la página de destino, haga clic en los órganos/tejidos de interés en la sección seleccionada seleccionar estudios. Seleccione el estudio particular de interés y, a continuación, pulse el botón Consultar por genes.</li>
	<li>En la sección seleccionadas perfiles genómicos, seleccione una de las tres opciones: mutaciones, alteraciones de número de copia putativa de GISTICo expresión de ARNm. Seleccione más los datos correspondientes en el menú desplegable Seleccionar paciente/conjunto de casos.</li>
	<li>Introduzca los símbolos de genes de destino en el cuadro de consulta Intro genes. Haga clic en el botón Enviar consulta.</li>
	<li>Haga clic en la pestaña Red en la parte superior de la página para recuperar la red genética deseada. NOTA: La red de señalización está codificada por colores. Los genes introducidos están indicados por nodos de semillas con un borde grueso. Cada gen está representado por un círculo rojo, y la intensidad del color del círculo rojo refleja su frecuencia de mutación. Los genes están conectados por líneas de diferentes colores. Las líneas marrones significan "En el mismo componente", lo que indica la participación en el mismo componente biológico. Las líneas azules significan "Reacciona con", lo que indica las reacciones genéticas. Las líneas verdes significan "cambio de estado", lo que sugiere que un gen podría causar un cambio de estado de otro gen.</li>
	<li>Haga clic en la pestaña Archivo en la parte superior de la imagen para elegir Guardar como imagen (PNG) para la descarga de imágenes de red.</li>
</ol>6. Disección de Drosophila con genotipos deseados y tinción DAPI
NOTA: Recoger la Drosophila femenina con los genotipos deseados, luego diseccionar los ovarios de la mosca para someterse a los procedimientos de tinción dAPI para la toma de imágenes.
<ol><li>Preparar las acciones de mosca tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w*; UAS-mam.A; y w[1118] para crear moscas con NICD-overexpression (tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+) y NICD y mam-overexpression (tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; Capacidad UAS-NICD-GFP/+).</li>
	<li>Aplique la técnica de orientación a la expresión génica temporal y regional (TARGET) para controlar la expresión génica espaciotemporal23. Levante las moscas a 18 oC hasta la edad adulta, luego cambie a 29 oC durante 48 h con levadura antes de la disección. NOTA: tj-Gal4 sólo puede controlar la expresión UAS bajo temperaturas más altas, cuando la inhibición por Gal80ts se alivia. La adición de levadura antes de la disección agranda los ovarios para la cosecha.</li>
	<li>Colocar 3 ml de solución salina 1x tamponada con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) en una placa de recogida de embriones. Utilice una almohadilla de CO2 para anestesiar a las moscas.</li>
	<li>Elija una mosca hembra, luego agarre cuidadosamente el tórax inferior de la mosca usando un par de fórceps disecantes y sumerja en la solución 1x PBS en un plato de recolección de embriones. Usa un segundo par de fórceps para pellizcar la parte inferior del abdomen y tirar suavemente para liberar los órganos internos.</li>
	<li>Identifique y separe el par de ovarios del cuerpo de la mosca. Romper la vaina muscular situada en el extremo posterior de los ovarios y separar los óvulos. NOTA: Se requiere separar los óvulos y romper la vaina muscular para lograr resultados de tinción de mayor calidad.</li>
	<li>Coloque los ovarios en un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga 500 ml de 1 pbS. El tubo debe permanecer en hielo hasta que se recojan todos los ovarios.</li>
	<li>Retire el 1x PBS y coloque 0,5 ml de solución fija (4% formaldehído) en el tubo. Coloque el tubo en el nutator durante 10 minutos.</li>
	<li>Retire la solución fija del tubo y deséchela en un contenedor de residuos adecuado. Utilice 1 ml de 1pbT (1x PBS complementado con 0,4% de tritón™ X-100) para lavar los ovarios 3 veces durante 15 min.</li>
	<li>Deseche el lavado PBT final y agregue 1 ml de PBTG (0,2% de albúmina sérica bovina, 5% de suero de cabra normal en 1x PBT) para evitar la unión inespecífica. NOTA: Este paso podría omitirse para la tinción DAPI, pero es esencial para la tinción de anticuerpos. La tinción de inmunohistoquímica detallada se puede encontrar en Jia et al.24.</li>
	<li>Colocar 150 sl de DAPI (10 g/ml) en el tubo durante 10 a 15 minutos de nuez. Deseche la DAPI y lave los ovarios 1veces durante 10 min usando 1 ml de 1x PBT. Retire el PBT y lave 2veces durante 10 minutos usando 1PBS.</li>
	<li>Retire el exceso de PBS hasta que queden aproximadamente 300 ml de PBS en el tubo con los ovarios. Pipet a los ovarios hacia arriba y hacia abajo varias veces usando una pipeta de 200 l, con el fin de liberar las cámaras de óvulos.</li>
	<li>Gire suavemente hacia abajo el tubo y retire cuidadosamente la mayor cantidad de 1x solución de PBS como sea posible sin quitar los ovarios. Colocar 120 ml de solución de montaje (1 g de gallato n-propilo, 5 ml de 10X PBS, 40 ml de glicerol y 5 ml de dH2O) en el tubo. NOTA: La solución de montaje es pegajosa, por lo que es difícil transferir exactamente 120 l de solución de montaje en un tubo. Para aliviar este problema, se puede utilizar una punta de pipeta de 1.000 ml para añadir tres gotas de solución de montaje en el tubo.</li>
	<li>Retire aproximadamente 0,33 mm de una punta de pipeta de 200 ml y utilice la punta de pipeta recién cortada para colocar la solución de montaje en un portaobjetos de vidrio del microscopio.</li>
	<li>Coloque suavemente el vidrio de encubrimiento en la solución de montaje y selle los bordes del deslizamiento de la cubierta con esmalte de uñas transparente. NOTA: Es necesario sellar los bordes del cristal de la cubierta para evitar que las cámaras de huevo fluyan dentro de la solución de montaje al tomar imágenes confocales.</li>
	<li>Adquirir imágenes con un microscopio confocal utilizando los siguientes ajustes: lente objetivo de aumento de 10x; apertura numérica : 0,8; Longitud de onda de emisión de DAPI a 410-513 nm.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como hay innumerables enfoques y métodos para la utilización de la bioinformática, hay numerosas bases de datos disponibles en línea para el público en general. Se puede extraer una gran cantidad de información de cada una de estas bases de datos, pero algunas son más adecuadas para propósitos particulares, como evaluar la supervivencia del paciente en función de ciertos insumos. Los análisis sistemáticos de los datos recuperados de diferentes bases de datos individuales pueden producir de manera convincente importantes ...

La vía de señalización Notch es una vía altamente conservada que es importante para muchos procesos de desarrollo dentro de los organismos biológicos. Se ha demostrado que la señalización de muesca desempeña un papel importante en la proliferación celular y la autorrenovación, y los defectos en la vía de señalización de la muesca pueden conducir a muchos tipos de cánceres1,2,3,4,5,6. En algunas circunstancias, la vía de señalización Notch se ha relacionado con el crecimiento de los tejidos y el cáncer, así como la muerte celular y la supresión tumoral7. Los receptores de muesca múltiple (NOTCH 1-4) y el mastermind del co-u2012activator (MAML 1-3), todos con diversas funciones, añaden un nivel adicional de complejidad. Mientras que la vía de señalización Notch es sofisticada en términos de funciones, su vía central es simple sobre una base molecular8. Los receptores de muesca actúan como proteínas transmembranas compuestas de regiones extracelulares e intracelulares9. Un ligando a la región extracelular de los receptores Notch facilita la escisión proteolítica, lo que permite que el dominio intracelular de notch (NICD) se libere en el núcleo. NICD se une a la mente maestra del activador de co-u2012 para activar la expresión génica descendente10.
En los últimos años, la señalización de la muesca ha demostrado desempeñar una variedad de papeles en la iniciación y progresión de varios tipos de cánceres en diferentes especies6,11. Por ejemplo, la señalización Notch se ha relacionado con la tumorigenesis que afecta al gen humano NOTCH1 12. Recientemente, los genes NOTCH2, NOTCH3, Delta-like 3 (DLL3), Mastermind-u2012like protein 1 (MAML1)y un dominio de desintegrina y metaloproteinasa-u2012quecontiene proteína 17 (ADAM17) se mostraron fuertemente asociados con el cáncer de ovario, especialmente con la mala supervivencia general de los pacientes13.
A medida que aumenta continuamente la cantidad de datos experimentales y asociados al paciente, también aumenta la demanda de análisis de los datos disponibles. Los datos disponibles están dispersos en las publicaciones, y pueden ofrecer hallazgos incoherentes o incluso contradictorios. Con el desarrollo de nuevas tecnologías en las últimas décadas, como la secuenciación de próxima generación, la cantidad de datos disponibles ha crecido exponencialmente. Aunque esto representa avances rápidos en la ciencia y oportunidades para la investigación biológica continua, evaluar el significado de los datos disponibles públicamente para resolver preguntas de investigación es un gran desafío14. Creemos que la bioinformática es una forma útil de extraer piezas más pequeñas de información de conjuntos de datos a gran escala. Mediante la implementación de diversos enfoques bioinformáticos, los investigadores pueden interpretar de forma rápida, fiable y eficiente estos grandes conjuntos de datos, produciendo descubrimientos perspicaces. Estos descubrimientos pueden ir desde la identificación de posibles nuevos objetivos de terapia farmacológica o biomarcadores de enfermedades, hasta tratamientos personalizados para pacientes15,16.
La bioinformática en sí misma está evolucionando rápidamente, y los enfoques están cambiando constantemente a medida que los avances tecnológicos barren la ciencia médica y biológica. Actualmente, los enfoques bioinformáticos comunes incluyen la utilización de bases de datos y programas de software de acceso público para analizar secuencias de ADN o proteínas, identificar genes de especial relevancia o importancia, y determinar la relevancia de genes y productos genéticos a través de la genómica funcional16. Aunque el campo de la bioinformática ciertamente no se limita a estos enfoques, estos son significativos para ayudar a los médicos e investigadores a gestionar los datos biológicos en beneficio de los pacientes en su conjunto.
Este estudio tiene como objetivo resaltar varias bases de datos importantes y su uso para la investigación sobre la vía de señalización Notch. NOTCH2, NOTCH3y su co-u2012activator MAML1 se utilizaron como ejemplos para el estudio de la base de datos. Estos genes se utilizaron porque se ha validado la importancia de la vía de señalización Notch en el cáncer de ovario. Los análisis sistemáticos de los datos recuperados confirmaron la importancia de la señalización de Notch en el cáncer de ovario. Además, debido a que la señalización de Notch está bien conservada en todas las especies, se confirmó que la sobreexpresión de Drosophila melanogaster NICD y Mastermind juntos puede inducir tumores en los ovarios drosofilia, apoyando los hallazgos de la base de datos y el papel significativo y conservado de la señalización de la muesca en el cáncer de ovario.

<table><tbody><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>PBS de dilución 1:1000</td></tr>, <tr><td>solución salina tamponada con fosfato, polvo 10X, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>FLBP6651</td><td>disuelto con ddH2O para hacer 1X</td></tr><tr><td>PBS Suero de cabra</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>placa</td></tr> de <tr><td>embrión Electrónica</td><td>Microscopía Ciencias 70543-45</td> Placa <td>de</td><td>disección</td></tr><tr><td>Mezcladores nutantes</td><td>Fisherbrand</td><td>88861041</td><td>Nutator</td></tr><tr><td>tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B</td><td>Dr. Wu-Min Deng en la Universidad Estatal de Florida</td><td>N/A</td><td>Stock de moscas</td></tr><tr><td>w*; UAS-mam.A</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#27743</td><td>Stock de moscas</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5905</td><td>Stock de moscas</td></tr><tr><td>El portal PRECOG</td> Universidad de <td>Stanford</td><td>precog.stanford.edu</td><td>Base de datos de acceso público de conjuntos de datos de expresión de cáncer</td></tr><tr><td>CSIOVDB</td><td>Instituto de Ciencias del Cáncer de Singapur</td><td>csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html</td><td>Base de datos de microarrays utilizada para estudiar el cáncer de ovario</td></tr><tr><td>La expresión génica en tejido normal y tumoral (GENT) Portal</td><td>Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea (KRIBB)</td><td>médico&ndash; genome.kribb.re.kr/GENT</td><td>Base de datos de acceso público de datos de expresión génica en diversos tejidos, divididos en tejidos tumorales y normales.</td></tr><tr><td>Enciclopedia de líneas celulares de cáncer del Instituto Broad (CCLE)</td><td>El Instituto Broad y los Institutos Novartis para la Investigación Biomédica</td><td>portals.broadinstitute.org/ccle</td><td>Proporciona perfiles genómicos y mutaciones de líneas celulares de cáncer humano</td></tr><tr><td>cBioPortal</td><td>Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK)</td><td>cioportal.org</td><td>Portal que permite a los investigadores buscar alteraciones genéticas y redes</td></tr> <tr><td>de señalizaciónMicroscopio confocal invertido Zeiss 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID #M 210491</td><td>Examen y recogida de imágenes de muestras marcadas con fluorescencia</td></tr></tbody></table>

integración de enfoques bioinformáticos y validaciones experimentales para entender el papel de la señalización de muesca en el cáncer de ovario

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

La señalización de muesca es una vía reguladora altamente conservada implicada en muchos procesos celulares. La desregulación de esta vía de señalización a menudo conduce a la interferencia con el desarrollo adecuado e incluso puede resultar en la iniciación o progresión de los cánceres en ciertos casos. Debido a que esta vía sirve funciones complejas y versátiles, se puede estudiar extensamente a través de muchos enfoques diferentes. De ellos, la bioinformática proporciona un método de estudio innegablemente rentable, accesible y fácil de usar. La bioinformática es una forma útil de extraer piezas más pequeñas de información de conjuntos de datos a gran escala. Mediante la implementación de diversos enfoques bioinformáticos, los investigadores pueden interpretar de forma rápida, fiable y eficiente estos grandes conjuntos de datos, produciendo aplicaciones perspicaces y descubrimientos científicos. Aquí, se presenta un protocolo para la integración de enfoques bioinformáticos para investigar el papel de la señalización de Notch en el cáncer de ovario. Además, los hallazgos de bioinformática se validan mediante la experimentación.

Utilizando el procedimiento mencionado en el paso 1 utilizando el portal PRECOG, se obtuvieron las puntuaciones Z de NOTCH2, NOTCH3y MAML1 en cáncer de ovario (1.3, 2.32, 1.62, respectivamente). Los valores negativos de la puntuación Z-u2012 indican la mala supervivencia global de los pacientes con altos niveles de expresión de los tres genes. Mediante el formato condicional del software de hoja de cálculo, los valores de puntuación Z-u2012 se muestran en un gráfico de barras d...

La bioinformática es una forma útil de procesar conjuntos de datos a gran escala. Mediante la implementación de enfoques bioinformáticos, los investigadores pueden obtener de forma rápida, fiable y eficiente aplicaciones perspicaces y descubrimientos científicos. Este artículo demuestra la utilización de la bioinformática en la investigación del cáncer de ovario. También valida con éxito los hallazgos bioinformáticos a través de la experimentación.

Integración de Enfoques Bioinformáticos y Validaciones Experimentales para Entender el Papel de la Señalización de Muesca en el Cáncer de Ovario

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

La bioinformática es una forma útil de extraer información de conjuntos de datos. La experimentación es igualmente importante para la validación. Combinamos ambos enfoques para investigar el papel de la señalización de muesca en el cáncer de ovario.La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden utilizar la información de las bases de datos bioinformáticas para planificar su dirección de investigación antes de realizar un experimento. Con los datos bioinformáticos acumulados de enfermedades humanas, los científicos ya no tienen los ojos vendados. La experimentación se puede realizar para validar hallazgos específicos, lo que puede conducir a terapias mejoradas o diagnóstico de enfermedades.Para el análisis meta-A de la asociación de un gen de interés con un tipo específico de cáncer, cree una cuenta con una dirección de correo electrónico afiliada académica para acceder a la base de datos PRECOG e introduzca la dirección de correo electrónico y la contraseña asociadas con la cuenta en el terminal de inicio de sesión. Haga clic en Ver detalles e introduzca el gen de interés en la barra de búsqueda. A continuación, utilice la barra de desplazamiento para obtener la puntuación Z de supervivencia para el tipo específico de cáncer de interés.Para investigar la asociación entre los niveles de expresión génica y las etapas del cáncer de ovario, vaya a la página web de CSIOVDB e introduzca el nombre del gen de interés en la barra de búsqueda. A continuación, haga clic en la pestaña Supervivencia. Para evaluar los datos de expresión génica en diversos tejidos normales y tumorales, vaya al portal de GENT y haga clic en la pestaña Buscar.En la sección de palabras clave, seleccione el símbolo genético para los términos en el menú desplegable, introduzca el símbolo del gen del gen de interés y seleccione Tejido para la opción de tipo. Haga clic en el botón Buscar. Se mostrarán gráficos resumidos de la expresión génica en tejidos normales y tumorales de diferentes tipos de cáncer, basados en las plataformas U133A y U122 Plus 2.A continuación, haga clic en el vínculo Descarga de datos de resultados para acceder a la información detallada sobre los valores de expresión génica, los tipos de tejido y las fuentes de datos. Para buscar alteraciones genéticas y redes de señalización, abra la página web del portal CBIO y, utilizando la consulta en la página de destino, haga clic en los órganos o tejidos de interés en la sección Estudios selectos, seleccione el estudio de interés en particular y haga clic en Consultar por genea. En la sección Seleccionar perfiles genómicos, seleccione las mutaciones, las alteraciones del número de copia putativa de GISTIC o la opción de expresión de ARNm.Seleccione los datos correspondientes en el menú Seleccionar conjunto de pacientes/casos e introduzca los símbolos genéticos de destino en el cuadro de consulta Introducir genes. Haga clic en el botón Enviar consulta y abra la pestaña Red para recuperar la red génica deseada. A continuación, haga clic en la pestaña Archivo y seleccione Guardar como imagen PNG para descargar imágenes de red.Para crear moscas con NICD o NICD y mam overexpression, prepare las existencias de mosca apropiadas y aplique la técnica de segmentación de expresión génica temporal y regional para controlar la expresión génica espaciotemporal, de acuerdo con los protocolos estándar. Levante las moscas a 18 grados centígrados hasta la edad adulta, antes de cambiar a 29 grados celsius con levadura durante 48 horas. Al final de la incubación de 29 grados Celsius, añadir tres mililitros de PBS a un plato de recolección de embriones, y anestesiar el cultivo de la mosca con una almohadilla de dióxido de carbono.Usa un microscopio diseccionado para identificar una mosca hembra anestesiada, y usa un par de fórceps diseccionados para agarrar cuidadosamente el tórax inferior de la mosca. Sumergir la mosca en el PBS dentro de la placa de recolección de embriones, y utilizar un segundo par de fórceps para pellizcar la parte inferior del abdomen, tirando suavemente para liberar los órganos internos. Localice y desasocie el par de ovarios del cuerpo de la mosca, y rompa la vaina muscular, situada en el extremo posterior de los ovarios, para separar los ovarios.A continuación, coloque los ovarios aislados en un tubo centrífuga de 1,5 mililitros, que contiene 500 microlitros de PBS sobre hielo. Cuando se hayan recogido todos los ovarios, sustituya el PBS por 500 microlitros de 4%formaldehído y coloque el tubo en un encientedor durante 10 minutos. Al final de la incubación, deseche el fijador y lave los ovarios con tres enjuagues de 15 minutos en un mililitro de PBT por lavado.Después del último lavado, etiquete los ovarios con 150 microlitros de 10 microgramos por mililitro DAPI durante 10-15 minutos en el encientedor. Al final de la incubación, lave los ovarios una vez durante 10 minutos con un mililitro de PBT, seguido de dos lavados de 10 minutos en PBS. Después del segundo lavado, retire todos los microlitros de PBS excepto los últimos, y utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para trillarar los ovarios varias veces para liberar las cámaras de óvulos.A continuación, sedimentar suavemente el tejido ovárico a través de un giro rápido en una microcentrífuga, y eliminar tanto PBS como sea posible sin alterar el pellet de ovario. Con una punta de pipeta de 1.000 microlitros, transfiera unas tres gotas de solución de montaje al tubo y utilice una punta de pipeta de 200 microlitros con aproximadamente 0,33 milímetros recortados desde el extremo para transferir las 120 microlitros completas de solución de montaje que contiene ovario en una diapositiva de microscopio de vidrio. Coloque suavemente un vidrio de tapa sobre la solución de montaje y selle los bordes con esmalte de uñas transparente.A continuación, utilice un microscopio confocal con un aumento de 10x con una apertura de 0,8 para adquirir imágenes de los ovarios manchados y montados. Utilizando el portal PRECOG como se ha demostrado, se pueden obtener las puntuaciones Z de NOTCH2, NOTCH3 y MAML1 en cáncer de ovario. Los valores negativos de puntuación Z indican la supervivencia global deficiente de los pacientes con altos niveles de expresión de los tres genes.El uso de la base de datos CSIOVD para confirmar estos hallazgos indica además que una alta expresión de NOTCH2, NOTCH3 y MAML1 se correlaciona con una supervivencia general y libre de enfermedades deficiente. Otras pruebas de permutación sugieren que NOTCH2, NOTCH3 y MAML1 están altamente expresados en los tejidos tumorales. Sobre la base de estos tres genes principales, se puede crear una red de señalización para proporcionar los 50 genes vecinos alterados con más frecuencia que también están en la misma vía con las tasas de mutación más altas.De interés, la sobreexpresión del gen NOTCH Drosophila-equivalente, NICD, por sí solo, no induce tumores en Drosophila. Mientras que la sobreexpresión de NICD y mam juntos induce tumores en moscas de la fruta, como lo demuestra la presencia de múltiples capas epiteliales y células acumuladas. Una mayor validación de la experimentación puede allanar el camino para la identificación de posibles nuevos objetivos de terapia farmacológica, biomarcadores de enfermedades y tratamientos personalizados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Se describen las metodologías para el establecimiento...

Heterotípicos tridimensional<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelado de estromal-epitelial interacciones durante la iniciación y progresión del cáncer de ovario

Este protocolo describe una técnica para la preparación de muestras mediante el cocultivo de explantes de ovario con las células cancerosas de las trompas de Falopio. Estas muestras se visualizan mediante espectroscopia de masas por imágenes, o IMS, para detectar el intercambio de moléculas pequeñas entre las células y los tejidos que conduce al desarrollo de tumores.

Modelado de la comunicación del cáncer de ovario para el análisis de espectrometría de masas por imágenes: un método para identificar comunicadores químicos de moléculas pequeñas en el desarrollo de tumores de ovario metastásicos

Describimos una plataforma de imágenes animales no invasiva que permite la detección, cuantificación y seguimiento del crecimiento y la recurrencia del cáncer de ovario. Este modelo de xenoinjerto intraperitoneal imita el perfil clínico de las pacientes con cáncer de ovario.

Modelo murino de imagen no invasivas para detectar y vigilar cáncer ovárico de Recurrencia

Se describe un ensayo de trasplante de la almohadilla de moda de ovario adecuado para estudios de epitelios normales y transformadas del tracto reproductivo femenino. La almohadilla de grasa del ratón permite el trasplante de fragmentos grandes de tejido, es de fácil acceso para la cirugía y la imagen, y proporciona el entorno nativo más favorable para los tejidos de origen de Müller.

Trasplante en la almohadilla del ratón de ovario grasa

Notch de 'jove_content es una forma de comunicación celular que se basa en el contacto directo entre células. Para inducir correctamente la señalización de Notch in vitro, los ligandos de Notch deben presentarse a las células en un estado inmovilizado. Este protocolo describe los métodos para la estimulación in vitro de la señalización de Notch en precursores de osteoclastos de ratón.

La estimulación de la señalización de Notch en el ratón osteoclastos precursores

Las células madre del cáncer de ovario (OCSC) son responsables de la iniciación, recurrencia, resistencia terapéutica y metástasis del cáncer. Se considera que el nicho vascular OCSC promueve la autorrenovación de las OCSC, lo que lleva a la quimiorresistencia. Este protocolo proporciona la base para establecer un modelo de nicho vascular OCSC reproducible in vitro.

Evaluación de las propiedades angiogenéticas de las células madre similares al cáncer de ovario utilizando el sistema de cocultivo tridimensional, NICO-1

La tropomodulina 3 (TMOD3) se ha estudiado cada vez más en tumores en los últimos años. Este estudio es el primero en informar que TMOD3 está altamente expresado en el cáncer de ovario y está estrechamente asociado con la resistencia al platino y la infiltración inmune. Estos resultados podrían ayudar a mejorar los resultados terapéuticos para el cáncer de ovario.

Sobreexpresión de tropomodulina 3 como marcador de resistencia al platino e infiltración inmunitaria en el cáncer de ovario

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo ex vivo tridimensional (3D) de la interacción entre la célula cancerosa y el epiplón. El modelo proporciona una plataforma para dilucidar los mecanismos protumorales dentro del nicho adiposo y para probar nuevas terapias.

Un modelo ex vivo de metástasis peritoneal de cáncer de ovario con epiplón humano

Para aclarar el proceso de múltiples etapas de diseminación peritoneal de carcinoma de ovario, el estudio actual presenta un modelo experimental murino de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal a través de la inoculación ortotópico con estas células tumorales.

Murino modelo experimental de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal<em&gt; vía</em&gt; Ortotópico La inoculación con células de carcinoma de ovario

Este manuscrito describe el uso de reporteros fluorógenos genéticamente codificados en una aplicación de imágenes de células vivas para el examen de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Este enfoque experimental ofrece inigualable resolución espaciotemporal, la sensibilidad y especificidad evitando muchas de las deficiencias de los métodos convencionales usados para la detección de estrés oxidativo toxicológica.

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

Aprende a integrar bioinformática y validación experimental para investigar la señalización de muesca en cáncer de ovario. Este método computacional permite identificar componentes clave y potenciales dianas terapéuticas mediante análisis de bases de datos y confirmación experimental.

Integración de Enfoques Bioinformáticos y Validaciones Experimentales para Entender el Papel de la Señalización de Muesca en el Cáncer de Ovario (Video) | JoVE Journal

Integración de Enfoques Bioinformáticos y Validaciones Experimentales para Entender el Papel de la Señalización de Muesca en el Cáncer de Ovario

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