Name: Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a separar el sobre celular de bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa sin detergentes. Este método permite analizar lípidos, proteínas y azúcares en condiciones seminativas para estudiar resistencia antibiótica.

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Este trabajo fue financiado por P20GM10344 y R01AI139248 otorgado a Z. D. Dalebroux.

1. Reactivos generales y preparación de medios para la extracción de membranas
<ol><li>Medios de crecimiento bacteriano: Preparar y esterilizar 1 L de medios de caldo en un matraz de 2 L completamente limpiado y autoclave.</li>
	<li>Tampón de resuspensión general (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Disolver 6,05 g de base Tris en 30 ml de H2O. Ajuste el pH a 7,5 con 5 M HCl. Ajuste el volumen final a 50 mL con Ultrapure H2O.</li>
	<li>Stock maestro de solución de quelación de cationes divalentes (0,5 M EDTA pH 8; 100 mL): Añadir 18,6 g de tetraacetato de etileno disódico 2H2O a 80 ml de H2O. Agitar vigorosamente y ajustar el pH a 8,0 con NaOH. Ajuste el volumen final a 100 ml con Ultrapure H2O. NOTA: La sal disódica de EDTA no se disolverá hasta que el pH de la solución se ajuste a 8,0 sin embargo mediante la adición de NaOH.</li>
	<li>Tampón osmótico A (sacarosa de 0,5 M, Tris pH de 10 mM 7,5; 1 L): Pesar 171,15 g de sacarosa y transferirlo a un cilindro de 1 L. Añadir 10 mL de 1 M Tris pH 7.5. Ajustar a un volumen final de 1 L con ultrapuro H2O. Almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Lysozyme (10 mg/ml; 5 mL): Pesar 50 mg de (huevo de pollo blanco) lisozima y disolver en 5 ml ultrapuro H2O. Almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Solución de quelación de cationes divalentes diluidas (1,5 mM EDTA; 500 mL): Añadir 1,5 ml de 0,5 M EDTA (paso 1,3) a 497,5 ml ultrapuro H2O. Almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Tampón osmótico B (sacarosa de 0,2 M, Tris pH de 10 mM 7,5; 2 L): Pesar 136,8 g de sacarosa y transferirlo a un cilindro de 2 L. Añadir 20 mL de 1 M Tris pH 7.5. Ajuste el volumen final a 2 L con Ultrapure H2O. Almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Cofactor de nucleasa (1 M MgCl2; 10 mL): Disolver 2,03 g de MgCl2x 6H2O en 8 ml de ultrapuro H2O. Ajuste el volumen a 10 ml. Conservar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cóctel de solución de nucleasa, incluidas las enzimas RNase y DNase: Ver Tabla de Materiales. Conservar a -20oC.</li>
	<li>Cóctel inhibidor de la proteasa: Ver Tabla de Materiales. Conservar a 4oC.</li>
	<li>Solución de gradiente de sacarosa isopycnic de baja densidad (20% p/v sacarosa, EDTA de 1 mM, Solución Tris pH 7,5 de mM; 100 ml): Pesar 20 g de sacarosa y transferirlo a un cilindro de 200 ml. Añadir 100 l de 1 M Tris Buffer pH 7.5 y 200 éL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajuste el volumen final a 100 ml con Ultrapure H2O. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Solución de gradiente de sacarosa isopycnic de densidad media (53% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Solución; 100 mL): Pesar 53 g de sacarosa y transferira a un cilindro graduado de 200 ml. Añadir 100 l de 1 M Tris Buffer pH 7.5 y 200 éL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajuste el volumen final a 100 ml con Ultrapure H2O. Almacenar a temperatura ambiente. NOTA: Prepare esta solución en un cilindro graduado para garantizar la precisión debido al alto porcentaje de sacarosa. Agregue una barra de agitación magnética y revuelva hasta que la sacarosa se disuelva completamente en solución. Este proceso puede tardar varias horas.</li>
	<li>Solución de gradiente de sacarosa isopycnic de alta densidad (73% w/v sacarosa, EDTA de 1 mM, Solución tris pH 7,5 de mM; 100 ml): Pesar 73 g de sacarosa y transferirlo a un cilindro graduado de 200 ml. Añadir 100 l de 1 M Tris Buffer pH 7.5 y 200 éL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajuste el volumen final a 100 ml con Ultrapure H2O. Almacenar a temperatura ambiente. NOTA: Prepare esta solución en un cilindro graduado para garantizar la precisión debido al alto porcentaje de sacarosa. Agregue una barra de agitación magnética y revuelva hasta que la sacarosa se disuelva por completo. Este proceso puede tardar varias horas.</li>
	<li>Búfer de almacenamiento de membrana aislada (10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L): Añadir 1 mL de 1 M Tris Buffer pH 7.5 a un matraz de 1 L y ajustar el volumen final a 1 L con Ultrapure H2O.</li>
	<li>-Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) (10 mg/ml solución): Resuspend 10 mg de NADH en Ultrapure H2O. Preparar existencias frescas, semanalmente. Conservar a -20oC.</li>
	<li>Solución fenol equilibrada con 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Ver Tabla de Materiales. Conservar la solución a 4oC.</li>
	<li>Kit de manchas de gel de lipopolisacáridos: Ver Tabla de Materiales.</li>
	<li>Reactivo Bradford: Véase Tabla de materiales. NOTA: Todas las soluciones y medios deben prepararse dentro de la semana de realizar el ensayo para garantizar resultados consistentes.</li>
</ol>2. Preparación de bacterias para la extracción de membranas
<ol><li>Raya las bacterias de las existencias de glicerol congelado en placas de agar frescas. Conservar las placas a 4oC una vez que se desarrollen las colonias. Inocular una sola colonia en un tubo de 5 ml lleno de medios de caldo y cultivar las bacterias como se desea durante la noche.</li>
	<li>Diluir de nuevo el cultivo bacteriano durante la noche en 1 L de medios de caldo preferidos y cultivar las bacterias hasta que se logre la densidad óptica deseada. NOTA: Inocular una sola colonia bacteriana en 1 L de medios de caldo se recomienda para los genotipos mutantes que son propensos a suprimir los fenotipos de crecimiento, pero algunas bacterias Gram-negativas simplemente crecen más lentamente que otras. Si no es posible lograr una densidad de cultivo suficiente por inoculación de una sola colonia, diluir de nuevo un cultivo nocturno en 1 L de medios es una estrategia para sincronizar el crecimiento. La composición bacteriana-membrana varía dependiendo de la fase de crecimiento del cultivo (fase logarítmica vs estacionaria)13. Las curvas de crecimiento que miden el cambio en la densidad óptica para los cultivos bacterianos en función del tiempo deben realizarse con todas las cepas para correlacionar la densidad de cultivo con la fase de crecimiento.</li>
	<li>Ponga los frascos que contienen los cultivos de caldo sobre hielo. Lea la densidad óptica a 600 nm (OD600) y calcule el volumen de cultivo que es equivalente a entre 6,0 y 8,0 x 1011 unidades formadoras de colonias bacterianas (cfu). Para S. Typhimurium, esto corresponde a 1 L de cultivo en una OD600 de entre 0.6-0.8, ya que una OD600 de 1.0 es igual a aproximadamente 1.0x109 cfu/mL. Agregue este volumen a un tubo de centrífuga y asegúrese de que los cultivos restantes permanezcan en hielo hasta que se utilicen.</li>
	<li>Peletizar las bacterias por centrifugación a 4 oC a 7.000-10.000 x g en una centrífuga de alta velocidad de ángulo fijo durante 10 min. NOTA: Preenfriar y mantener las centrífugas a baja temperatura. Mantenga las muestras sobre hielo durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Decantar y desechar el sobrenadante cuidadosamente. NOTA: El pellet puede ser congelado y/o almacenado a -80 oC si las fracciones de membrana no se van a extraer inmediatamente. Sin embargo, se recomienda proceder directamente con la plasmolisis el mismo día en que se cosechan las células, y se recomienda especialmente para especies no enterobacterianas.</li>
</ol>3. Disociación de la Membrana Externa y Plasmolisis
<ol><li>Descongelar los gránulos celulares en hielo si se almacenan previamente a -80 oC y conservar las muestras en hielo durante el resto del procedimiento. Resuspenda cada pellet celular dentro del tubo de centrífuga en 12,5 ml del tampón A. Agregue una barra de agitación magnética a la suspensión de las células.</li>
	<li>Añadir 180 sl de lisozima de 10 mg/ml (concentración final de 144 g/ml) a cada resuspensión celular. Mantenga las muestras sobre hielo mientras revuelve durante 2 min.</li>
	<li>Añadir 12,5 ml de solución EDTA de 1,5 mM a cada resuspensión celular y continuar revolviendo sobre hielo durante 7 min adicionales.</li>
	<li>Decantar la suspensión en un tubo cónico de 50 ml y centrífuga a 9.000-11.000 x g durante 10 min a 4 oC.</li>
	<li>Deseche los sobrenatolentes en un contenedor de residuos de riesgo biológico y conserve los pellets en hielo.</li>
	<li>Agregue 25 ml de tampón B al pellet de célula.</li>
	<li>Añadir 55 ml de 1 M MgCl2, 1 l de reactivo de nucleasa RNase/DNase (para evitar problemas de viscosidad asociados con bacterias sometidas a plasmolisis antes de la homogeneización), y 1 l de cóctel inhibidor de proteasa al volumen de tampón B que se encuentra encima del pellet celular</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en la mezcla tampón B. Pipeta y vórtice vigorosamente hasta observar una solución homogénea. NOTA: Es muy importante tener una solución homogénea antes de proceder al paso 4 de este protocolo. Las células resuspendidas deben tener una masa de pastel viscosa como la apariencia y la consistencia.</li>
	<li>Vortex cada muestra durante 15 s. Conservar las suspensiones sobre hielo y proceder al paso 4.</li>
</ol>4. Homogeneización presurizada y lisis
NOTA: Se pueden utilizar varios métodos para la lisis. La sonicación no es ideal debido a la generación de calor. La lisis osmótica se puede lograr, pero a menudo es ineficiente. Por lo tanto, recomendamos lisis de alta presión. La lisis de alta presión se puede lograr utilizando una variedad de instrumentos. Sugerimos máquinas de homogeneización, como la Prensa Francesa o la Emusliflex. Trabajamos con muchos tipos de bacterias Gram-negativas cuya respuesta a soluciones de sacarosa alta osmolar varía. El paso de homogeneización de alta presión mejora la eficiencia, la reproducibilidad y el rendimiento.
<ol><li>Preenfriar la celda de prensa francesa a 4 oC o insertar la bobina metálica de la máquina homogeneizadora sobre hielo.</li>
	<li>Vierta la muestra en la celda de presión francesa o en el cilindro homogeneizador-muestra y lleve la célula bajo la presión de homogeneización deseada (10.000 psi deben ser adecuadas cuando se utiliza una prensa francesa o 20.000 psi cuando se utiliza un homogeneizador).</li>
	<li>Ajuste el caudal de salida a aproximadamente una caída por segundo mientras mantiene la presión si utiliza una prensa francesa.</li>
	<li>Recoger el lisado celular en tubos cónicos de 50 ml mientras mantiene las muestras en hielo.</li>
	<li>Repita los pasos 4.2-4.4 de tres a cinco veces para lograr una lisis completa, normalmente indicada por un aumento gradual de la transparencia de la muestra. NOTA: La cámara de muestra debe lavarse y equilibrarse con el tampón B entre muestras.</li>
	<li>Mantenga las células lysed en hielo.</li>
</ol>5. Fraccionamiento total de membrana
<ol><li>Centrifugar las muestras bacterianas lysed a 6.169 x g durante 10 min a 4 oC a pellet sin material celular intacto. (por ejemplo, células bacterianas no lilizadas).</li>
	<li>Distribuir la parte restante del sobrenadante, que ahora contiene las membranas homogeneizadas en una botella de policarbonato para la ultracentrifugación. PRECAUCION: Si es necesario, las muestras de células se pueden equilibrar diluyendo con tampón B.</li>
	<li>Ultracentrifure los lysates celulares a 184.500 x g durante al menos 1 h, a 4 oC. Este paso se puede realizar durante la noche sin afectar la calidad de las membranas.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante restante presente en el tubo de ultracentrífuga y retenga los gránulos de membrana en hielo(Figura 1).</li>
	<li>Resuspenda los pellets de membrana en 1 ml de la solución degradada isopycnic-sucrose de baja densidad utilizando un homogeneizador de dounce de vidrio. Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir el homogeneato de muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y retenersobre sobre hielo. NOTA: Si sólo se desea un análisis de la composición total de la membrana, sustituya 1 ml de solución de gradiente isopycnic-sucrose de baja densidad por 1 ml de tampón de almacenamiento de membrana aislada. El paso 5.5 es el punto final del aislamiento si sólo se desean muestras de membrana totalmente bacteriana. Almacene las muestras a -20 oC hasta que se requiera un análisis posterior.</li>
</ol>6. Ultracentrifugación de gradiente de densidad para separar las membranas dobles
<ol><li>Reúna el número adecuado de tubos de polipropileno de 13 ml o ultra-claro sin gas especificados para un rotor de cucharón oscilante y ultracentrífuga.</li>
	<li>
Sostenga el tubo en una posición ligeramente inclinada y prepare el gradiente de sacarosa añadiendo lentamente soluciones de sacarosa de mayor densidad a menor densidad en el siguiente orden: 2 mL de 73% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 4 mL de 53% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
	<ol>
<li>A continuación, añadir la fracción de membrana total (1 ml), que ha sido resuspendida en la solución de sacarosa del 20% p/v (paso 5.5). Evite mezclar la fracción de membrana con la solución de sacarosa que se encuentra debajo de ella. Las divisiones deben ser visibles entre cada una de estas capas.</li>
		<li>Por último, llene el tubo con la solución de gradiente isopycnic-sucrose de baja densidad (aprox. 6 ml). Los tubos de polipropileno y ultra-claro abierto deben llenarse lo más lleno posible (2 o 3 mm de la parte superior del tubo) para el soporte del tubo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste para Acinetobacter baumannii 17978<ol>
<li>Adaptar un gradiente de sacarosa ajustado para su uso con diferentes muestras bacterianas. Para A. baumannii, el siguiente gradiente de sacarosa ofrece una separación más completa de las membranas(Figura 2). 2 mL de 73% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5 4 mL de 45% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5</li>
		<li>A continuación, añadir la fracción de membrana total (1 ml), que ha sido resuspendida en la solución de sacarosa del 20% p/v (paso 5.5). Evite mezclar la fracción de membrana con la solución de sacarosa que se encuentra debajo de ella. Las divisiones deben ser visibles entre cada una de estas capas.</li>
		<li>Por último, llene el tubo con una solución de gradiente isopycnic-sucrose de baja densidad (aprox. 6 ml). Los tubos de polipropileno y ultra-claro abierto deben llenarse lo más lleno posible (2 o 3 mm de la parte superior del tubo) para el soporte del tubo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ultracentrifure las muestras utilizando un rotor de cucharón oscilante a 288.000 x g y 4 oC durante la noche. NOTA: Para los volúmenes utilizados en los pasos anteriores, recomendamos tiempos de centrifugación entre 16 h y 23 h.</li>
	<li>Corte el extremo de una punta de pipeta P1000 a unos 5 mm del punto. Retire la capa de mensajería instantánea de color marrón superior con la pipeta. Transfiera la fracción IM en una botella de policarbonato para ultracentrifugación.</li>
	<li>Deje aproximadamente 2 ml de la solución de sacarosa por encima de la interfaz del 53-73% para asegurarse de que el OM blanco inferior no esté contaminado con la fracción IM. Repita el procedimiento de pipeteo del paso 6.4 para la fracción OM(Figura 1). NOTA: Las membranas también se pueden recoger pinchando los tubos de centrífuga en la parte inferior usando una aguja y recogiendo las membranas como fracciones en forma de gota.</li>
	<li>Llene el vacío restante del tubo de ultracentrífuga con tampón de almacenamiento de membrana aislada y mezcle por inversión o pipeteo. Conserve las muestras en hielo.</li>
	<li>Recoger las membranas ahora lavadas y aisladas por ultracentrifugación a 184.500 x g durante 1 h y 4 oC.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspenda las membranas por onza-homogeneización. Agregue 500-1000 l de búfer de almacenamiento. Recoger muestras en tubos de microcentrífuga de 2 ml.</li>
	<li>Almacene las muestras de membrana bacteriana a -20 oC.</li>
</ol>7. Confirmación de la separación de las bicapas
NOTA: La separación incompleta de las bicapas puede ocurrir debido a un error técnico o la composición única de la envolvente celular de algunas especies. Para confirmar la separación, aconsejamos utilizar dos ensayos independientes para cuantificar el grado de contaminación cruzada entre las bicapas. El primer ensayo detecta la actividad enzimática de NADH deshidrogenasa, que existe exclusivamente en el IM. El segundo ensayo detecta la presencia de LOS o LPS, que existe predominantemente en el OM.
<ol><li>
Confirmando que los OM están aislados de los MN
	<ol>
<li>Mida la concentración de proteínas en cada fracción de membrana aislada utilizando un ensayo de proteína Bradford.</li>
		<li>Añadir el volumen de la muestra correspondiente a entre 50 y 500 g de proteína a un tubo de microcentrífuga vacío de 2 ml. La concentración variará dependiendo de la especie, pero 50 g es típicamente suficiente para Enterobacteriaceae. Añadir el volumen adecuado de 10 mM Tris-buffer para lograr un volumen total de 990 l. Transfiera el contenido a una cubeta para espectrofotometría.</li>
		<li>Añadir 10 l de una solución de 10 mg/ml de NADH a la muestra y medir la absorbancia inicial a 340 nm.</li>
		<li>Continúe midiendo la absorbancia cada 30 s durante 5 min.</li>
		<li>Compile los datos y grafique el cambio en la absorbancia (eje y) frente al cambio de tiempo (eje x) para cada fracción de membrana(Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confirmando que los mandis están aislados de los om
	<ol>
<li>Añadir el volumen de la muestra correspondiente a entre 50 y 500 g de proteína a un tubo de microcentrífuga vacío de 2 ml. La concentración variará dependiendo de la especie bacteriana, pero 50 g es típicamente suficiente para Enterobacteriaceae. Llene a un volumen final de 100 l con solución salina tamponada de fosfato, que en adelante se conoce como la fase acuosa.</li>
		<li>Añadir 5 l de Proteinase K (stock 800 U/ml) a la fase acuosa e incubar durante la noche a 59oC.</li>
		<li>Calienta una alícuota de 10 ml de Fenol saturado de Tris durante 10 min a 68oC.</li>
		<li>Espíe las muestras de fase acuosa que fueron tratadas con la Proteinase K y agregue el Fenol "caliente" Tris-saturado en una proporción de 1:1 con la fase acuosa, vórtice vigorosamente e incubar a 68 oC durante 10 minutos.</li>
		<li>Transfiera las muestras ahora de color blanco lechoso de 68 oC a un baño de agua helada e incubar durante 10 minutos.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 2.100 x g durante 10 min a 4oC.</li>
		<li>Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo y almacene el tubo a -20 oC si la muestra no debe utilizarse inmediatamente.</li>
		<li>Diluir las muestras en el búfer de carga SDS y cargar los pozos de un 4-20% Tris-glycine gel degradado.</li>
		<li>Electroforresa durante 45 minutos o hasta que el tinte frontal esté en la parte inferior del gel.</li>
		<li>Mancha el gel con el kit de tinción LPS siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li>
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</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Este método continuará ayudando a los investigadores en la comprensión del papel de la envolvente celular en la fisiología bacteriana y la patogénesis. Siguiendo los pasos secuenciales de ultracentrifugación se puede obtener una fracción total, interna y OM purificada. Estas membranas se pueden analizar de forma aislada para probar hipótesis relacionadas con la localización y función de las proteínas de membrana, el transporte y el tráfico a través de la periferia, y la composición de las bicapas individuales bajo divers...

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas que están separadas por un espacio periférico y una pared celular de peptidoglycan1. La membrana interna (IM) encierra el citosol y es una bicapa simétrica de fosfolípidos. Peptidoglycan protege contra la presión del turgencia y proporciona a la bacteria una forma celular, y está unido a la membrana externa (OM) por lipoproteínas2,,3. El OM rodea la periferia y es predominantemente asimétrico. El prospecto interno se compone de fosfolípidos y el prospecto externo consiste en glucólidos conocidos como lipooligosacáridos (LOS) o lipopolisacáridos (LPS)4,5. La asimetría lipídica y la bioquímica de las moléculas LOS/LPS en el prospecto exterior confieren propiedades de barrera a la superficie celular que protegen la bacteria contra los peligros en su entorno6,7.
Las moléculas de LPS se componen de tres componentes: el disacárido lipídico A, el oligosacárido central y el o-polisacárido u antígeno O. El lípido A es un disacárido acilado multiplicado. Los oligosacáridos de núcleo consisten en 10-15 azúcares conocidos como LPS áspero sordos o R-LPS. El núcleo se subdivide en la región interna, compuesto por ácido 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic (kdo) y uno o más residuos de heptosa, y una región externa que consiste generalmente de hexosis (glucosa o galactosa) y heptoses, o azúcares acetamido5. La región del núcleo exterior es más variable en sus componentes y estructura que el núcleo interno. En Salmonella spp., sólo se ha descrito una estructura central; sin embargo, en Escherichia coli hay cinco estructuras centrales diferentes (designadas K-12, R1, R2, R3 y R4)8. E. coli K-12 DH5, que utilizamos en este procedimiento lleva una mutación que resulta en la producción R-LPS9. Las moléculas R-LPS carecen de la mitad del antígeno O y tienen un peso molecular similar a las moléculas LOS.
La adición de antígeno O a R-LPS convierte esta molécula en LPS liso, o S-LPS. Los antígenos O se construyen a partir de subunidades cortas de carbohidratos de 3-4 y consisten en múltiples modalidades con diferentes longitudes de cadena10. Algunas bacterias productoras de LPS, como Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), muestran una distribución trimodal de moléculas LPS en su superficie10,11. Los antígenos O de cadena muy larga pueden contener más de cien subunidades y pesar más de cien kilodaltones. Los antígenos O proporcionan propiedades superficiales a la bacteria que son necesarias para resistir los antibióticos, evadir la depredación por bacteriófagos y causar enfermedades.
Las especies de Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria y otras generan moléculas LOS en lugar de moléculas LPS en su superficie12. Las moléculas LOS consisten en lípidos A y oligosacáridos centrales, pero carecen del antígeno O. Estos tipos de bacterias Gram-negativas modifican sus oligosacáridos principales con azúcares adicionales y combinaciones de azúcares para alterar las propiedades superficiales12. Tanto los microbios productores de LOS como los LPS derivan los fosfatos en el lípido A y las moléculas centrales con mitades catiónicas7. Estas adiciones incluyen sustituciones de fosfoetanolamina, galactosamina y aminoarabinosa, que funcionan neutralizando la carga superficial aniónica y protegiendo así contra los péptidos antimicrobianos catiónicos. Las bacterias gramnegativas también modifican la estructura del oligosacárido central con sustituciones variables no estequiométricas de azúcares, o moléculas de kdo adicionales, y alteran el número de cadenas de acil en los disanolípidos lípidos-A7.
La capacidad de aislar el IM del OM de las bacterias Gram-negativas ha sido fundamental para entender el papel de la envoltura celular en la resistencia a los antimicrobianos y la patogénesis de la enfermedad11,12. Las derivaciones de este enfoque se han utilizado para deducir mecanismos de montaje, mantenimiento y remodelación de la proteína, fosfolípidos y componentes glucólidos para el OM.
Nuestro laboratorio realiza rutinariamente análisis lipidomicos bacterianos para estudiar la regulación de lípidos mediada por proteínas y la función de lípidos en una variedad de especies Gram-negativas. Los volúmenes utilizados en el protocolo reflejan el uso rutinario de este procedimiento para analizar fosfolípidos no radiomarcados mediante cromatografía de capa delgada y cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem13,14.
El protocolo comienza exponiendo una suspensión refrigerada de bacterias Gram-negativas a una solución osmolar alta de sacarosa y añadiendo lisozyme para disociar el OM de la capa subyacente de peptidoglycan(Figura 1)12. EDTA se añade entonces para facilitar la penetración de la lisozyme, ya que el secuestro de cationes divalentes interrumpe las interacciones de puente electrostático lateral entre las moléculas adyacentes los PÉRDIDA/LPS15. El protocolo original del que se ha adaptado el nuestro requería la formación de esferoplastias, una forma celular bacteriana Gram-negativa que consiste en una membrana plasmática y citosol, pero carece de la capa de peptidoglicano y un OM. Es posible que las esferoplastias se produzcan por el método adaptado; sin embargo, la técnica no se basa ni pretende su formación para el éxito. En su lugar, las bacterias tratadas con lisozyme-EDTA se cosechan rápidamente por centrifugación y se vuelven a suspender en una solución de sacarosa de menor concentración antes de la lisis presurizada. Los oMs que podrían haber sido liberados mediante la formación de esferoplastias deberían, en teoría, ser cosechables de los sobrenadores de las células tratadas, pero este enfoque no se detalla en este documento. En última instancia, las células tratadas se someten a homogeneización y lisis convencionales, lo que mejora la eficiencia y reproducibilidad del procedimiento de separación demembranas 16.
Después de la lisis, las membranas totales se recogen por ultracentrifugación y se aplican a un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa para fraccionar los MN y oMs. El enfoque clásico utiliza un gradiente más continuo que consiste en al menos cinco soluciones de sacarosa diferentes11,12. El gradiente discontinuo de nuestro protocolo consta de tres soluciones de sacarosa y divide las bicapas en dos fracciones diferenciadas17. Las moléculas LOS y LPS dentro de los OMs de las bacterias Gram-negativas impulsan la envolvente a dividirse en una fracción IM de baja densidad marrón superior y una fracción OM de alta densidad blanca inferior(Figura 1 y Figura 2).
Acinetobacter baumannii son importantes patógenos humanos multirresistentes que producen moléculas LOS en su OM y erigen una envoltura celular que es difícil de separar18,,19. Los trabajos recientes sugieren que una derivación del protocolo que presentamos aquí se puede utilizar para dividir las bicapas de estos organismos20. Por lo tanto, probamos nuestro protocolo en A. baumannii 17978. Inicialmente, el procedimiento era inadecuado. Sin embargo, modificamos la concentración de sacarosa de la solución de densidad media y mejoramos en gran medida la separación(Figura 2). Se utilizó un ensayo de deshidrogenasa NADH y un procedimiento de extracción y detección de LOS/LPS para confirmar la separación de A. baumannii,tipo salvaje S. Typhimurium y dos genotipos enterobacterianos con deficiencia de o-antígeno; a saber, galE-mutant S. Typhimurium y una cepa de laboratorio, E. coli DH5 (Figura 3 y Figura 4).
La intención de este trabajo es proporcionar un enfoque simplificado para aislar reproduciblemente las membranas de las bacterias Gram-negativas. El protocolo se puede utilizar para estudiar muchos tipos de moléculas asociadas a la membrana para estos microbios.

<table><tbody><tr><td>Botellas centrífugas de 1 L, PC/PPCO, supervelocidad, con tapón de sellado, Nalgene</td><td>VWR</td><td>525-0466</td><td></td></tr><tr><td>Botella de almacenamiento de medios Pyrex de 1 L con tapón de alta temperatura</td><td>VWR</td><td>10416-312</td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer de 2.000 ml, boca estrecha</td><td>VWR</td><td>10545-844</td><td></td></tr><tr><td>4-20% mini geles de proteínas prefabricados PROTEAN, 12 pocillos</td><td>BIORAD</td><td>4561095</td><td></td></tr><tr><td>4x Muestra de Laemmli Tampón 10 mL</td><td>BIORAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estériles</td><td>VWR</td><td>89049-174</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tejidos de 7 mL Dounce con dos morteros de vidrio</td><td>VWR</td><td>71000-518</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de botella de policarbonato de 70 mL</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>Polvo</td><td>VWR</td><td>A10752</td><td></td></tr><tr><td>B10P de sobremesa Medidor de pH con sonda de pH</td><td>VWR</td><td>89231-664</td><td></td></tr><tr><td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (versión de banco)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50136146</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Nucleasa</td><td>MilliporeSigma</td><td>70746-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sal disódica dihidratada 99,0-101,0%, cristales, ultrapuro Biorreactivo Grado de biología molecular, J.T. Baker</td><td>VWR</td><td>4040-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo Fiberlite F13-14 x 50cy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75006526</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico 6.0 N</td><td>VWR</td><td>BDH7204</td><td></td></tr><tr><td>IBI Scientific Agitador de plataforma orbital</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-453-211</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo Miller 214906</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR lisozima, clara de huevo, grado ultrapuro</td><td>VWR</td><td>VWRV0063</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 - IVD</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Products&nbsp; ALCOHOL PURO 200 PROOF GL 4/CS&nbsp;</td><td>Fischer Scientific NC1624582</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solución de fenol, equilibrada con 10 mM de Tris HCl, pH 8,0, 1 mM de EDTA, bioreactivo, para biología molecular</td><td>Sigma - Millipore</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Kit de ensayo</td><td>Thermofisher</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>Pro-Q emerald 300 Kit de tinción en gel de lipopolisacáridos</td><td>Thermofisher</td><td>P20495</td><td></td></tr><tr><td>Proteacease-50, sin EDTA</td><td>G Biosciences</td><td>786-334</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K, Grado de Biología Molecular New</td><td>England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio &ge; 99,99%</td><td>Centrífuga VWR</td><td>AA45780-22</td><td></td></tr><tr><td>Sorval RC 6 Plus</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sacarosa MilliporeSigma</td><td>SX1075-3</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor de cubeta oscilante</td><td>Beckman Coulter Ciencias de la vida</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano (TRIS, Trometamol) &ge; 99,9 % (base seca), biorreactivo ultrapuro Grado de biología molecular, J.T. Baker</td><td>VWR</td><td>JT4109-6</td><td></td></tr><tr><td>Tipo 45 Ti Rotor de titanio de ángulo fijo</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Tubo ultra claro, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td></td></tr></tbody></table>

separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para acinetobacter baumannii

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Este método funciona dividiendo la envoltura de bacterias Gram-negativas en fracciones totales, internas y externas de membrana (OM) y concluye con ensayos para evaluar la pureza de las bicapas. El OM tiene una mayor densidad global en comparación con la membrana interna, en gran parte debido a la presencia de lipooligosacáridos (LOS) y lipopolisacáridos (LPS) dentro del prospecto exterior. Las moléculas LOS y LPS son glucólidos anfipááticos que tienen una estructura similar, que consiste en un disanolípido lípido-A y un sustituito de oligosacárido central. Sin embargo, sólo las moléculas lpS están decoradas con una tercera subunidad conocida como O-polisacárido, o oantígeno. El tipo y la cantidad de glucólidos presentes afectarán la densidad OM de un organismo. Por lo tanto, probamos si las membranas de bacterias con contenido variado de glucólidos podrían aislarse de manera similar utilizando nuestra técnica. Para los organismos productores de LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium y Escherichia coli, las membranas fueron fácilmente aisladas y la mitad del antígeno O-antígeno LPS no impactó la partición bicapa. Acinetobacter baumannii produce moléculas LOS, que tienen una masa similar a las moléculas LPS deficientes de O-antígeno; sin embargo, las membranas de estos microbios no podían separarse inicialmente. Razonamos que el OM de A. baumannii era menos denso que el de Enterobacteriaceae, por lo que el gradiente de sacarosa se ajustó y las membranas fueron aisladas. Por lo tanto, la técnica puede ser adaptada y modificada para su uso con otros organismos.

Esta técnica proporciona un medio eficaz para aislar los HIM y OMs para bacterias Gram-negativas. Se ilustra un esquema de todo el procedimiento (Figura 1). En general, la normalización de cultivos a una DO600 de 0,6-0,8 en 1 L de medios, o la cosecha entre 6,0 y 8,0 x 1011 células bacterianas garantizará que se recoja la cantidad adecuada de material de membrana para su posterior separación.
Al lijar las bacterias y ultracentricar el lisado,...

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas segregadas espacialmente. La membrana externa se divide a partir de la membrana interna por una periplasma y una capa de peptidogglicano. La capacidad de aislar las bicapas duales de estos microbios ha sido fundamental para entender su fisiología y patogénesis.

Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

El estudio de cómo los microbios regulan la composición química de las bicapas individuales informará nuestro conocimiento de los mecanismos de matanza de antibióticos, resistencia a los antimicrobianos y patogénesis de enfermedades. Esta técnica divide la envolvente celular de bacterias gramnegativas en dos fracciones definidas sin usar detergente. Por lo tanto, los lípidos, proteínas y azúcares se pueden evaluar en un ambiente semi-nativo.Algunos de los pasos dependen del tiempo y requieren enfoque y coordinación. Inicialmente, utilice una o dos muestras. Cuando el nivel de confort aumenta, se pueden agregar más muestras.No se deben manipular más de seis muestras a la vez. Este es un procedimiento de varios días y los puntos de control visuales son útiles para evaluar la eficacia y el error. Antes de realizar estos pasos a veces finales.Rayar las bacterias de las existencias de glicerol congelados en placas de agar frescas. Una vez que las colonias se desarrollen, almacene las placas en cuatro grados centígrados. Utilice una sola colonia para inocular un tubo de cinco mililitros lleno de medios de caldo y cultivar las bacterias como se desee durante la noche.La espalda diluye el cultivo bacteriano durante la noche en un litro de los medios de caldo preferidos e incuba los matraces. Una vez alcanzada la densidad óptica deseada, retire los matraces de la incubadora y colóquelos sobre hielo. Mida la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros y calcule el volumen de cultivo que equivale a entre seis y ocho veces 10 a las unidades formadoras de colonias bacterianas undécimas.Agregue este volumen de cultivo a un tubo centrífugo y asegúrese de que los cultivos restantes permanezcan en hielo hasta que se utilicen. Pelecila las bacterias por centrifugación durante 10 minutos en un ángulo fijo, centrífuga de alta velocidad a 7.000 a 10.000 veces G y cuatro grados Celsius. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y desecharlo.Resuspender cada pellet celular en 12,5 mililitros de tampón A.Añadir una barra de agitación magnética a la suspensión celular. Añadir 180 microlitros de 10 miligramos por mililitro de lysozyme a cada resuspensión celular. Después de recoger las bacterias tratadas con lisozima EDTA por centrifugación, añadir rápidamente el inhibidor de la proteasa, cloruro de magnesio y nucleasa a las bacterias y resuspend rápidamente las células en el tampón B.Stir durante dos minutos, manteniendo las suspensiones sobre hielo.A continuación, agregue 12,5 mililitros de 1,5 mililitros de solución EDTA a cada célula re-suspensión y continúe revolviendo sobre hielo durante siete minutos adicionales. Decantar las suspensiones en tubos cónicos de 15 mililitros. Centrifugar las suspensiones a 9.000 a 11.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Deseche los sobrenadantes en un contenedor de residuos de riesgo biológico y conserve los pellets sobre hielo. Añadir 25 mililitros de tampón B a cada pellet de célula. A continuación, agregue 55 microlitros de un cloruro de magnesio molar, un microlitro de reactivo de arnés/adn/nucleasa y un microlitro de cóctel inhibidor de la proteasa.Resuspender los pellets en la mezcla. Pipeta y vórtice vigorosamente hasta que las soluciones parezcan homogéneas. Almacene las suspensiones en hielo.Vierta la muestra en el cilindro de muestra homogeneizador y lleve la célula a 20.000 PSI. Para evitar la aerosolización de patógenos, acondicione el aparato presurizado en el tampón B y ajuste los niveles de presión antes de añadir la suspensión bacteriana. Encienda la célula de presión y alude 10 mililitros del tampón B como precaución.Recoger el analitis celular en tubos cónicos de 50 mililitros sobre hielo mientras también mantiene las muestras en hielo. Para lograr una lelisis completa, repita este proceso de tres a cinco veces. Para peletizar el material celular restante, intacto, centrifugar las muestras bacterianas de lesed a 6, 169 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.Distribuir los sobrenadantes que ahora contienen las membranas homogeneizadas, en botellas de policarbonato para la ultracentrifugación. Ultracentrífuir la célula se lysates a 184, 500 veces G y cuatro grados Celsius durante al menos una hora. Deseche los sobrenadantes y conserve los pellets de membrana sobre hielo.Usando un vidrio, homogeneizador Dounce, resuspender los pellets de membrana en un mililitro de la solución de gradiente de sacarosa isopicónica de baja densidad. A continuación, utilice un vaso, pipeta Pasteur para transferir el homogeneización de la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y coloque el tubo sobre hielo. Para preparar el gradiente de sacarosa, sostenga un tubo Open-Top de polipropileno o Ultra-claro en una posición ligeramente inclinada.Añadir lentamente dos mililitros de la solución de sacarosa de mayor densidad. A continuación, agregue cuatro mililitros de la solución de sacarosa de menor densidad. Al preparar el gradiente de densidad, agregue la solución de sacarosa lentamente para evitar mezclar las capas.Las capas de sacarosa deben ser ligeramente visibles y aparecer generalmente definidas. A continuación, agregue la fracción de membrana total que previamente se resuspendió en un mililitro de baja densidad, solución de sacarosa isopicnic. Por último, llene el resto del tubo añadiendo aproximadamente seis mililitros de la solución de gradiente de sacarosa isopicónica de baja densidad.Ultracentrífafuse las muestras usando un rotor de cubo oscilante a 288.000 veces G y cuatro grados Celsius durante 16 a 23 horas. Corte el extremo de una punta de pipeta P1000 a unos cinco mililitros desde el punto. Una vez completada la centrifugación, utilice la pipeta para extraer la capa superior de color marrón del tubo.Transfiera esta capa, que contiene la fracción de membrana interna, a una botella de policarbonato para ultracentrifugación. Deje unos dos mililitros de la solución de sacarosa por encima de la interfaz entre la sacarosa 53% y la sacarosa 73%para asegurarse de que la fracción de membrana externa inferior, blanca y externa no se cruza contaminan la fracción de membrana interna. Una vez más usando una punta de pipeta P1000 con el extremo quitado, retire la capa de membrana externa y transfiétela a una botella de policarbonato.Llene el vacío restante de la botella de policarbonato con tampón de almacenamiento de membrana aislado y mezcle por inversión o tubería. Conservar las muestras sobre hielo. Para recoger las membranas, ultracentrifugar las botellas de policarbonato a 184, 500 veces G y cuatro grados Celsius durante una hora.Por último, deseche los sobrenadantes y agregue de 500 a 1.000 microlitros de búfer de almacenamiento. Resuspender las membranas por homogeneización Dounce. Recoja las muestras en tubos de microcentrífuga de dos mililitros.Los pellets de membrana total fueron raspados, homogeneizados por Dounce y ultracentrifugados sobre gradientes de densidad de sacarosa para separar las membranas internas y externas. Un gradiente de densidad de sacarosa del 20%53%73% fue suficiente para dividir algunas cepas bacterianas. Pero no para particionar A.baumannii que fue particionado con éxito usando un 20%45%73%gradiente.Para evaluar la eficiencia de la separación, se analizaron muestras de membrana para la NADH deshidrogenasa, una enzima ubicada en la membrana interna bacteriana. Una disminución de la densidad óptica a 340 nanómetros indicaba la presencia de la enzima. La densidad óptica se midió para muestras de 50 microgramos de fracciones de membrana internas y externas de tipo salvaje S.typhimurium, E.coli K12 DH5a y galE mutante S.typhimurium.Se añadió una mayor concentración de proteína al ensayar la pureza de las fracciones de membrana de A.baumannii porque un ensayo inicial con 50 microgramos sugirió que los niveles relativos de NADH deshidrogenasa eran menores para A.baumannii que para las otras cepas bacterianas. Para evaluar la contaminación cruzada de las fracciones de membrana interna con fracciones de membrana externas, se extrajeron y visualizaron LPS y LOS. Los extractos fueron cargados en un gel de poliacrilamida y teñidos con Pro-Q Emerald 300.Acinetobacter baumannii es una prioridad, multi resistente a los medicamentos, patógeno humano. Este protocolo debe ayudar a los investigadores en la comprensión de las funciones de lipooligosacáridos, fosfolípidos y lipoproteínas en los mecanismos de resistencia y virulencia de este patógeno único e importante. Este método es ideal para el análisis posterior de fosfolípidos, carbohidratos glucólidos, proteínas y moléculas pequeñas que normalmente existen dentro de las membranas duales de bacterias gramnegativas.

separation-cell-envelope-for-gram-negative-bacteria-into-inner-outer

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo para la separación de membranas internas y externas...

Método para el aislamiento de Francisella tularensis Membranas externas

Fuente: Cian, M. B. et. al., Separación de la envoltura celular de bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la separación de las fracciones de membrana interna y externa de bacterias gramnegativas mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Las fracciones de membrana se purifican y almacenan a bajas temperaturas para el análisis específico de componentes específicos...

Separación de las fracciones de membrana interna y externa de bacterias gramnegativas

Fuente: Watson, D. C., et.al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el aislamiento y la concentración de vesículas extracelulares (EV) derivadas de la membrana externa de bacterias modificadas genéticamente. El proceso consiste en cultivar las bacterias para liberar vehículos eléctricos, seguido de pasos secuenciales de centrifugación y filtración para eliminar células y desechos.

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Fuente: Figueroa, D. et al. Producción y visualización de esferoplastos y protoplastos bacterianos para caracterizar la localización de péptidos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo muestra la preparación de esferoplastos a partir de bacterias gramnegativas en forma de varilla. Las bacterias se cultivan en presencia de un antibiótico para formar filamentos alargados. Estos se lavan con una solución hipertónica y se tratan con un tampón de lisis para eliminar la pared celular externa.

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Se presenta un protocolo para la investigación in vitro de bombas de expulsión de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite la generación de un gradiente de protones robusta, reversible y ajustable dentro de la membrana de los liposomas y por lo tanto debe ser adaptable a cualquier proteína de la membrana activado por la fuerza protomotive.

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La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

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Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Describimos un procedimiento sencillo para la complementación cromosómica de una sola copia de un gen de bomba de eflujo utilizando un sistema de expresión basado en mini-Tn7 en una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en eflujo modificada. Esta precisa herramienta genética permite controlar la expresión génica, lo cual es clave para la caracterización de las bombas de eflujo en patógenos multirresistentes.

Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única

Aprende a separar el sobre celular de bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa sin detergentes. Este método permite analizar lípidos, proteínas y azúcares en condiciones seminativas para estudiar resistencia antibiótica.

Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii (Video) | JoVE Journal

Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

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