Name: Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprende a evaluar células T auxiliares foliculares y respuestas del centro germinal en ratones infectados con virus de la gripe A. Este protocolo permite analizar la diferenciación de células Tfh y la producción de anticuerpos específicos.

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Agradecemos al personal de las instalaciones de citometría de flujo, las instalaciones de ABSL2 y las instalaciones de animales SPF del Institut Pasteur de Shanghai por su ayuda técnica y asesoramiento. Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Programa de Investigación Estratégica Prioritaria de la Academia China de Ciencias (XDB29030103), Programa Nacional clave de I+D de China (2016YFA0502202), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31570886).

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a los roles especializados en proporcionar ayuda de células B para generar anticuerpos de alta afinidad, las células Tfh han sido ampliamente estudiadas en los mecanismos de diferenciación y manipulación para proporcionar nuevas estrategias para el diseño de vacunas. La infección por el virus de la gripe induce vigorosas respuestas de las células Tfh y GC B, siendo así un modelo adecuado para este campo de investigación. En este documento, describimos protocolos de infección por el virus de la gripe por inoculació...

En la última década, numerosos estudios se han centrado en el subconjunto de células CD4+ T recientemente identificado, subconjunto de células Tfh, por sus funciones esenciales en el desarrollo del centro germinal (GC) B. El linfoma de células B 6 (Bcl6), que se considera principalmente como represor genético, es el factor definitorio del linaje de las células Tfh para la evidencia de que la expresión ectopic de Bcl6 es suficiente para impulsar la diferenciación tfh, mientras que la deficiencia de Bcl6 resulta en la diferenciación tfh desaparecida1,2,3. A diferencia de otros subconjuntos auxiliares CD4+ T que realizan su función de efector mediante la migración a los sitios de inflamación, las células Tfh proporcionan la ayuda celular B principalmente en la zona folicular de células B de bazo y ganglio linfático. Las moléculas co-estimulantes ICOS y CD40L, desempeñan un papel significativo en la interacción entre las células Tfh y GC B. Durante la diferenciación tfh, ICOS transmite las señales necesarias de las células B del cognato y también actúa como un receptor que recibe señales de migración de las células B del transeúnte para la localización de la zona celular B4,5. CD40L es un mediador de señales de células Tfh para la proliferación de células B y supervivencia6. Otro factor que juega el papel similar a CD40L es la citoquina IL21, que es secreta principalmente por las células Tfh. IL21 regula directamente el desarrollo de células GC B y la producción de anticuerpos de alta afinidad, pero su papel en la diferenciación de Tfh sigue siendo controvertido7,8. PD-1 y CXCR5, que ahora se utilizan con mayor frecuencia en la identificación de células Tfh en el análisis de citometría de flujo, también desempeñan un papel significativo en la diferenciación y función de este subconjunto. CXCR5 es el receptor de la quimiocina folicular de células B y media la localización de células Tfh en folículos celulares B9. Pd-1 ahora se identifica no sólo para tener la función de orientación folicular, sino también transmitir señales críticas en el proceso de maduración de afinidad de células GC B10. Sobre la base de estos hallazgos, evaluar la expresión de estas moléculas podría básicamente reflejar la maduración y la función de las células Tfh.
El GC es una estructura microanatomical transitoria inducida en órganos linfoides secundarios y altamente dependiente de las células Tfh, siendo así una lectura perfecta para evaluar la respuesta de Tfh. En GC, después de recibir señales mediadas por citoquinas y moléculas co-estimulantes, las células B están sujetas a conmutación de clases e hipermutación somática para generar anticuerpos de alta afinidad11. La conmutación diferencial de la clase de anticuerpos se produce en el nicho diferencial de citoquinas, en el que IL4 e IL21 inducen la conmutación de la clase IgG1 mientras que el IFNḥ induce el cambio de clase IgG212. Las células plasmáticas son los productores de anticuerpos secretos y son células diferenciadas terminalmente. Al igual que las células Tfh, el desarrollo de células B en GC se asocia con la expresión dinámica de muchas moléculas significativas. Según el estudio actual, las células GC B se pueden identificar como B220+PNA+Fas+ o B220+GL7+Fas+ células y células plasmáticas, en comparación con sus precursores, expresión downregulate de B220 y cd138 upregulate expresión133. Además, ambas características se pueden detectar en el análisis de citometría de flujo e inmunofluorescencia, siendo así una evaluación adecuada de la respuesta de GC.
Respuestas celulares y humorales robustas son inducidas en la infección por el virus de la gripe, con células Tfh y Th1 dominando CD4+ T respuesta celular14,lo que lo convierte en un modelo perfecto para el estudio de diferenciación de células Tfh. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), que es una cepa adaptada al ratón de uso común, se utiliza con frecuencia en este estudio14,15,16. Aquí, describimos algunos protocolos básicos del ensayo relevante para el estudio de Tfh en la infección por el virus de la gripe: 1) inoculación intranasal del virus PR8; 2) células Tfh específicas de antígenos, células GC B y plasma y detección IL21 con citometría de flujo; 3) visualización histológica de GC; 4) detección de titer de anticuerpos específicos de antígenos en suero con ELISA. Estos protocolos proporcionan las técnicas necesarias para nuevos investigadores en el estudio asociado a Tfh.

<table><tbody><tr><td>Immunostaining de células Tfh, células Tfh específicas de NP y Bcl-6</formaldehído fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% Sigma</td><td></td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 ratón</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugado-IAbNP311-325 MHC tetrámero de clase II</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCL-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>clon:7D1</td></tr><tr><td>Biotina-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>clon: SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>clon:GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>clon:IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>clon:IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>clon:MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>clon:7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>clon:29F.1A12</td></tr><tr><td>Estreptavidina BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Tinción intracelular de IL21</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehído</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano IgG</td> Jackson <td>ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>humano FCc IL-21 receptor</td><td>R& D System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de células muertas Aqua vivos/muertos fijables</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr><tr><td>GC Tinción de células B y plasmáticas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>clon:RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>clon:281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE/Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>clon:Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>clon:11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td><Ensayo fuerte> de título de anticuerpos específicos de HA con ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biological</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ig anti ratón de cabra (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>IgM anti ratón de cabra (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr>Anti <tr><td>ratón de cabra IgG1 (Sistema de clontipado SBA-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr> Anti <tr><td>ratón de cabra IgG2b (Sistema de clontipado SBA-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr> Anti <tr><td>ratón de cabra IgG2c (Sistema de clontipado SBA-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB Juego de reactivos de sustrato</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Histology</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>IgD anti-ratón</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>PNA biotinilado</td><td>Vector laboratories</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>diluido Alexa Fluor 488-estreptavidina</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>suero de cabra normal</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración de oro Pro-long</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>Kit de bloqueo STREPTAVIDIN/BIOTIN</td><td>Laboratorios vectoriales</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de las células auxiliares foliculares t y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe a en ratones

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Las células T Follicular Helper (Tfh) son un subconjunto independiente de células CD4+ T especializado en proporcionar ayuda para el desarrollo del centro germinal (GC) y la generación de anticuerpos de alta afinidad. En la infección por el virus de la gripe, se inducen respuestas sólidas de células Tfh y GC B para facilitar la erradicación eficaz del virus, lo que confiere un modelo de ratón cualificado para el estudio asociado a Tfh. En este artículo, describimos protocolos en la detección de la respuesta inmune básica asociada a Tfh durante la infección por el virus de la gripe en ratones. Estos protocolos incluyen: inoculación intranasal del virus de la gripe; flujo de tinción de citometría y análisis de células Tfh policlonales y específicas de antígenos, células GC B y células plasmáticas; detección de inmunofluorescencia de GCs; ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA) de anticuerpos específicos del virus de la gripe en suero. Estos ensayos básicamente cuantifican la diferenciación y la función de las células Tfh en la infección por el virus de la gripe, proporcionando así ayuda para estudios sobre el mecanismo de diferenciación y estrategia de manipulación.

Caracterización de la morbilidad del ratón en la infección por el virus de la gripe Después de la infección por el virus de la gripe, los ratones son menos activos y anoréxicos debido a una enfermedad, que se refleja en la pérdida de peso grave, un síntoma comúnmente utilizado para controlar la morbilidad del ratón19. Como se muestra en la Figura 1a , ratones infectados por el virus PR8 comenzaron a perder peso en el día 6, alcanz...

Este documento describe los protocolos de evaluación de la respuesta Tfh y GC B en el modelo de ratón de infección por el virus de la gripe.

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Las células foliculares auxiliares T son un subconjunto de células T CD4 recientemente identificadas que proporcionan ayuda a las células B en la producción animal de alta afinidad. La demostración de la identificación de células Tfh en una infección por el virus de la influenza ayudará a los nuevos investigadores a comprender cómo realizar las técnicas necesarias para los estudios asociados con Tfh. Debido a que un título inadecuado del virus puede causar mortalidad o una respuesta inmunitaria demasiado débil, aconsejamos determinar el título antes de realizar un experimento.Para la inoculación del virus PR8 de ratones machos C57 negros 6 de ocho semanas de edad. En condiciones de nivel de bioseguridad 2, descongele a menos 80 grados Celsius las existencias almacenadas del virus PR8 en hielo. Vórtice el virus para obtener una solución homogénea.Diluir el virus en dos unidades de plataforma por microlitro de PBS en un tubo preenfriado de 1,5 mililitros y confirmar la falta de respuesta al pinzamiento de los pies en los animales anestesiados. Vórtice el virus de nuevo. Cargue una punta de pipeta de 20 microlitros con 10 microlitros de virus.Agregue con cuidado gotas de virus en una nariz de hasta tres animales sedados antes de repetir la inoculación en el otro lado. Luego, coloque a todos los ratones en decúbito esteral en jaulas calientes con monitoreo hasta la recuperación completa, y pese a cada ratón diariamente durante 10 días. Al final del experimento, coloque a los ratones en una campana de flujo laminar de nivel 2 de bioseguridad y asegure al primer animal a una tabla de disección de espuma absorbente cubierta de papel.Use tijeras de disección para cortar la piel a lo largo de la línea media abdominal, estirando la piel con pinzas y sujetando la piel a la tabla de disección. Abra el peritoneo para recoger el bazo y colóquelo en un filtro de 70 micrómetros con un plato de 6 centímetros que contiene 5 mililitros de DMEM suplementado con 1% de FBS. Divida el diafragma y las costillas hasta el timo y asegure la costilla a un lado para exponer la cavidad torácica.Mover el pulmón y el corazón para ubicar el ganglio linfático mediastínico cerca del lado ventral de la tráquea. Luego, coloque el ganglio linfático en su propio colador en un segundo plato de 6 centímetros que contenga 5 mililitros de medio y use émbolos de jeringa de 3 mililitros para triturar suavemente ambos tejidos a través de la malla de ambos coladores. Enjuague cada colador con 1 mililitro de DMEM fresco más FBS y transfiera las suspensiones de celdas a tubos de centrífuga individuales de 15 mililitros.Recoja las células por centrifugación y resuspenda completamente los gránulos en 1 mililitro de DMEM fresco más FBS por tubo. Luego agregue cuatro mililitros adicionales de medio a la suspensión de células del bazo y coloque ambos tubos en hielo. Para teñir las células para la expresión de CXCR5, invierta el tubo varias veces para mezclar y transfiera 2 veces 10 a las 6 células por muestra a tubos FACS individuales.Agregue 2 mililitros de tampón de tinción a cada tubo y mezcle las células mediante vórtice. Granular las células por centrifugación y desechar los sobrenadantes. Golpee suavemente cada tubo en papel absorbente dos veces y golpee suavemente los dos fondos para volver a suspender las células en el sobrenadante residual.Bloquee la unión inespecífica con 0,2 microlitros de bloqueo del receptor Fc por tubo y agite el tubo suavemente para mezclar antes de colocar los tubos en hielo durante 10 minutos. Al final de la incubación, agregue 0,3 microlitros de biotina anti-ratón CXCR5 a cada tubo y mezcle agitando suavemente. Coloque los tubos en hielo durante una hora con un suave movimiento a los 30 minutos.Al final de la incubación, agregue 2 mililitros de tampón de tinción a los tubos y al vórtice para mezclar antes de sedimentar las células por centrifugación. Deseche el sobrenadante y mueva para volver a suspender las células en el tampón residual. A continuación, coloque los tubos en hielo y etiquete las células con anticuerpos contra el marcador de superficie de interés, como se describe en la tabla que se acaba de demostrar.Al final de la incubación, lavar las células con 2 mililitros de tampón de tinción y volver a suspender cada gránulo en 400 microlitros de tampón de tinción fresco para su análisis por citometría de flujo. Los ratones infectados con el virus PR8 comienzan a perder peso el sexto día, alcanzando la pérdida más alta el octavo día y volviendo a los niveles de peso iniciales el día 10. Como se esperaba, no se observa pérdida de peso en los ratones de control tratados con PBS.La infección viral también conduce a una fuerte expansión de los linfocitos dentro del ganglio linfático que drena. Como se observó en el análisis de citometría de flujo, la diferenciación de las células foliculares auxiliares T se inicia en el quinto día y alcanza su punto máximo en el día 10 después de la infección con un número robusto de células auxiliares foliculares T inducidas en ratones infectados por el virus de la influenza en comparación con los animales de control. Además, tanto en los ganglios linfáticos mediastínicos como en el bazo, el número de células T CD4 positivas para el antígeno de la influenza se induce significativamente en comparación con los observados en ratones de control con mayores poblaciones de células CXCR5 positivas para PD-1 en animales PR8.Además, la tinción intracelular para IL-21 revela que la infección por PR8 induce una producción significativamente mayor de esta citocina en respuesta a la infección por virus. La tinción inmunofluorescente indica la presencia de una reacción inducida en el centro germinal en ratones infectados con PR8, y ELISA demuestra la generación de anticuerpos específicos contra el virus de la influenza en animales infectados por el virus. Es importante realizar la tinción CXCR5 sobre hielo durante una hora, ya que la calidad de la tinción se verá afectada por la temperatura de tinción y el tiempo.Aunque demostramos la tinción de CXR5 e IL-21, otros marcadores de superficie, factores de transcripción y citocinas se pueden evaluar mediante este método para proporcionar multitud de datos sobre la diferenciación y la función de Tfh.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Se utilizaron dos métodos basados en citometría de flujo: un ensayo de cebado de células T in vitro y una tinción de citocinas intracelulares para medir la capacidad de presentación de antígenos de las células dendríticas y las respuestas de las células T específicas de antígeno a una infección mutante por el virus del Nilo Occidental en ratones.

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

Hay una falta general de conocimiento sobre cómo funcionan las vacunas. Aquí proponemos el uso combinado de genética inversa y ratones quiméricos de médula ósea para obtener información sobre las respuestas inmunitarias tempranas del huésped a las vacunas, con un enfoque especial en las células dendríticas y la inmunidad de las células T.

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

Se describe un método para medir la activación de funciones efectoras Fc-mediada por anticuerpos dirigidos la hemaglutinina del virus de la gripe. Este análisis también pueden ser adaptado para evaluar la capacidad de inducir Inmunidad mediada por Fc de anticuerpos monoclonales o sueros policlonales dirigidos a otras glicoproteínas virales de superficie.

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

Se describe un protocolo para evaluar las respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1- / - modelo murino para la infección del virus (ZIKV) Zika. Este método es fundamental para la investigación de los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis de las vacunas ZIKV y también es valiosa para la evaluación de su eficacia.

Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

Este artículo describe un nuevo modelo de ratón para la transición del neumococo de un colonizador asintomático a un patógeno causante de enfermedades durante la infección viral. Este modelo se puede adaptar fácilmente para estudiar las interacciones polimicrobianas y huésped-patógeno durante las diferentes fases de la progresión de la enfermedad y entre varios huéspedes.

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El estudio actual muestra protocolos para evaluar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y manipular la expresión génica en estas células.

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

Este protocolo proporciona instrucciones para la administración intranasal de IAV y el análisis posterior del daño pulmonar del ratón y los cambios transcripcionales asociados a los tipos de células pulmonares.

Modelado de la reparación alveolar pulmonar displásica y funcional después de la infección por influenza

Aprende a evaluar células T auxiliares foliculares y respuestas del centro germinal en ratones infectados con virus de la gripe A. Este protocolo permite analizar la diferenciación de células Tfh y la producción de anticuerpos específicos.

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones (Video) | JoVE Journal

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones

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