Cuantificación de la adhesión de células tumorales en criosecciones de nodos linfáticos

Los sitios más frecuentes para la metástasis son los ganglios linfáticos originales. Los somatids se pueden utilizar para detectar la afinidad adhesiva entre las secciones de los ganglios linfáticos de las células tumorales in vitro. Una ventaja de esta técnica es que las secciones de los ganglios linfáticos frescos proporcionan una complejidad natural del tejido original, que no sería posible recrear utilizando proteínas purificadas.

Este método podría ser útil para estudios de oncología molecular que buscan identificar genes o terapias que interfieren con la adhesión de las células tumorales a los órganos diana metastásicos, como los ganglios linfáticos. Para cosechar los ganglios linfáticos dentro de los treinta minutos posteriores al sacrificio, coloque la rata Wistar adulta en recumbencia dorsal en una tabla de disección limpia a temperatura ambiente y rocíe el pelaje con 70%alcohol isopropílico. Usando instrumentos esterilizados, levante la piel abdominal y haga una incisión de la piel medial para exponer las vísceras abdominales.

Extrae el intestino hasta que los ganglios linfáticos torácicos y abdominales se vuelvan visibles. Usando tijeras de punta contundente, excúme cuidadosamente los ganglios linfáticos sin dañar la arteria mesentérica superior subyacente, y coloque el ganglio linfático en un tubo de 15 ml que contenga 5 ml de PBS estéril. Cuando se hayan cosechado todos los ganglios linfáticos, coloque un ganglio linfático por cryomold boca abajo en la base de cada molde y agregue el medio de temperatura de corte óptimo suficiente para cubrir los tejidos.

Después de congelar el presión, utilice un criostato para adquirir secciones de 5 a 8 micrómetros de espesor a 22 grados Celsius y recoja las secciones en diapositivas de microscopio de vidrio. Las criocciones de buena calidad de las rebanadas consecutivas del mismo ganglio linfático son fundamentales para minimizar las diferencias entre las rodajas y facilitar tasas de adhesión celular consistentes. Para el etiquetado de células tumorales, cosecha las células de interés de un cultivo celular adecuadamente escenificado y re-suspende las células en un 1 x 10 a las 6 células por ml de concentración y medio libre de suero.

Transfiera 1 ml de células a un nuevo tubo cónico de 15 ml y etiquete las células con 2 microgramos por ml de DiI(C18) durante diez minutos a 37 grados centígrados, con agitación suave a los cinco minutos para evitar la sedimentación celular. Al final de la incubación, pele el cabello de las células por centrifugación y lave las células etiquetadas dos veces con 10 ml de medio fresco libre de suero para eliminar cualquier exceso de colorante. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las células en un 1 x 10 a las 6 células por ml de medio libre de suero, complementado con 0.1%concentración de albúmina sérica bovina.

Procediendo de las células tumorales etiquetadas sobre las secciones del tejido de los ganglios linfáticos cosechados, lave suavemente las secciones dos veces en PBS, seguida de la rehidratación en PBS fresco durante quince minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, bloquee cualquier unión no específica con 2,5% de albúmina sérica bovina durante treinta minutos a 37 grados centígrados, antes de usar un hisopo de algodón para secar los portaobjetos. Utilice una pluma hidrófoba para dibujar una barrera alrededor de cada sección y agregue 100 microlitros de células etiquetadas en cada ganglio linfático rodeado.

Después de una a dos horas a 37 grados celsius en una cámara humidificada, retire las células sin adherencia con cuatro lavados suaves en PBS y fije las células de fluorescencia adherentes restantes con 3.7% de formaldehído en PBS durante quince minutos a temperatura ambiente. Para la cuantificación del índice adhesivo, utilice el objetivo 10x en un microscopio de fluorescencia para obtener imágenes TIFF individuales de cada sección en los campos fluorescentes brillantes y rojos. A continuación, nombre y guarde las imágenes sistemáticamente antes de abrir las imágenes en Fiji.

Después de establecer la escala, utilice la herramienta poligonal para seleccionar la región de interés que se va a cuantificar. Seleccione esta opción para cuantificar el área de los ganglios linfáticos. Los datos se expresarán en milímetros cuadrados.

A continuación, seleccione Plugins, Analizar, Contador de celdas y haga clic en la foto que desea cuantificar. Haga clic en Inicializar y seleccione Tipo de contador. Luego, haga clic en las celdas de la foto.

El índice de adhesión de los ganglios linfáticos se expresará como el número de células tumorales adherentes por área cubierta de ganglios linfáticos. Para inicializar la siguiente foto, abra la siguiente foto y repita la cuantificación como se muestra. Como se observó, la morfología de las células adherentes se redondea en forma, y las células se dispersan heterogéneamente por todo el ganglio linfático de interés.

El índice de adhesión de los ganglios linfáticos es de dos a tres veces mayor en las líneas celulares de cáncer de mama negativo NDRG4, en comparación con el medido para las células positivas NDRG4 correspondientes. Este procedimiento se puede adaptar para ayudar a las tasas de adhesión en otros tejidos diana metastásicos, como el cerebro o los pulmones, para evaluar los sitios preferenciales secundarios de adhesión para las células tumorales inseminadas. Recuerde que tanto los tejidos frescos como los congelados deben considerarse biopeligrosos y deben manipularse con las precauciones de biosecuerpo adecuadas.