Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus

Este protocolo utiliza imágenes térmicas para identificar nuevos compuestos capaces de regular la transpiración de la planta. Esta técnica es versátil con respecto a las especies vegetales que se pueden probar, la naturaleza del compuesto y el tipo de imagen. Para configurar las plantas para el cultivo, primero agregue una capa de cuatro centímetros de espesor de vermiculita fina a bandejas de plantas estándar de 10 por 20 pulgadas sin agujeros y coloque los soportes de semillas a dos centímetros de distancia en las bandejas.

Llene los soportes de semillas con vermiculita y coloque un extremo puntiagudo de semilla de girasol hacia abajo en cada soporte para que la mitad de la semilla permanezca expuesta. Cuando todas las semillas hayan sido chapadas, cúbralas con dos centímetros adicionales de vermiculita fina y niebla con agua desde arriba. Después de una hora, cubra las bandejas con tapas y coloque las plantas en una cámara de crecimiento en un invernadero.

Para instalar el sistema hidropónico, llene un recipiente de tamaño adecuado para el cultivo de plantas hidropónicamente con agua destilada y agregue fertilizante hidropónico general según lo indicado por el fabricante. A continuación, utilice bombas de aire y agua para airear la solución hidropónica resultante con movimiento constante. Para preparar los flotadores hidropónicos, corte una lámina de espuma de poliestireno expandido de dos centímetros de espesor a las dimensiones del contenedor y utilice la herramienta de quema de madera para hacer agujeros de uno a dos centímetros de diámetro en la espuma.

A continuación, coloque los flotadores en el sistema hidropónico. Cinco días después de la siembra, tire suavemente de las plántulas de la vermiculita. Coloque inmediatamente las plántulas en un recipiente de agua durante 30 minutos para eliminar el exceso de vermiculita y suavizar los pericarpos restantes.

Cuando las raíces primarias emergentes sean visibles, retire los pericarpos a mano según sea necesario. Transfiera las plántulas dentro de los soportes de semillas en los flotadores de espuma de poliestireno preparados en el sistema hidropónico. Cultivar las plantas en hidroponía durante dos días.

Deje que los productos químicos de la pequeña biblioteca de compuestos se descongelen a temperatura ambiente. Etiqueta seis microtubos sin tapa y dos mililitros para el tratamiento de control negativo, tres tubos para el tratamiento ABA y los 60 tubos finales para el análisis de los efectos de los 20 productos químicos de interés en el triplicado. Añadir 10 microlitros de cada producto químico en cada uno de los tubos de ensayo, 10 microlitros de 10 MILilitros ABA y dimetil sulfóxido en los tres tubos ABA, y 10 microlitros de dimetil sulfóxido en los seis tubos de control.

A continuación, mezcle cuidadosamente 990 microlitros de 10 mililitros de hidróxido de potasio MES en cada tubo. Coloque los tubos en un portatubos con el control positivo y negativo y los tubos experimentales distribuidos uniformemente dentro del bastidor para tener en cuenta el sesgo relacionado con la posición. Para configurar la cámara termográfica, primero monte la cámara en un soporte de copia y conecte todos los cables a un portátil.

Encienda la cámara antes de encender el portátil y abra el software de análisis de imágenes térmicas. Para ajustar los parámetros de grabación, pase el ratón sobre el botón Grabar para permitir la selección del icono de llave inglesa en Configuración de grabación y seleccione el modo de grabación y las opciones adecuados. Para el tratamiento de las plántulas, levante cuidadosamente el soporte de semillas y sumerja rápidamente la raíz en el plato poco profundo que contiene agua.

Cortar la raíz primaria de cada plántula bajo el agua 0,8 a un centímetro por debajo del extremo más basal del soporte de semilla para evitar la capitación e insertar la planta recién cortada en un tubo de productos químicos. Cuando todas las plántulas hayan sido transferidas, coloque las plantas bajo la cámara termográfica y confirme que todas las plantas están dentro del campo de visión de la cámara. Para enfocar la cámara en la superficie de los cotiledones, pulse Control Alt A y haga clic en Grabar una película.

Se abrirá una nueva ventana que confirme la grabación. Después de una o dos horas, detenga la grabación. Para el análisis de datos, abra los archivos seq correctos y detenga la película.

Haga clic en el icono Añadir una región de cursor de medición de interés de tres por tres píxeles y mueva el ratón sobre el centro de un cotiledone de la primera planta. Haga clic izquierdo en la imagen para etiquetar el cotiledone. Etiquetar el segundo cotiledone de la primera planta de la misma manera.

Cuando todos los plantas se hayan etiquetado con dos cursores, haga clic en el icono editar regiones de interés y haga clic con el botón izquierdo del 18 y desplácese para seleccionar todas las regiones de interés. A continuación, pase el ratón sobre el icono del visor de estadísticas y seleccione el trazado temporal. Se abrirá una nueva ventana.

Ejecute la película, un gráfico se llenará con los datos. A continuación, en la ventana del gráfico, haga clic en la flecha doble para abrir un nuevo menú y haga clic en el icono de guardar para guardar los datos. El uso del tinte rojo eritrosina B demuestra la capacidad de los productos químicos para ser absorbido visiblemente a través de una raíz cortada en los cotiledones de una plántula de girasol dentro de 10 minutos.

Cuando las plantas son tratadas con ABA, se detecta un aumento en la temperatura de las hojas en los cotiledones de girasol dentro de los 30 minutos que se asocia con la disminución de la abertura estomatal y la conductancia estomatal. Además, se observa un aumento de la temperatura foliar 15 minutos después del tratamiento con 10 ABA micromolar y 20 minutos después del tratamiento con cinco ABA micromolares que demuestran que la medición de la temperatura de la hoja por imágenes térmicas es un buen proxy para medir la apertura y la conductividad estomatal. En este experimento representativo, un tratamiento estadístico estándar basado en la puntuación permite la identificación de productos químicos que promueven el cierre o la apertura del estomatal.

Para medir los efectos de los compuestos en la transpiración, es importante cultivar las plantas en condiciones óptimas de luz, humedad y temperatura. Este protocolo se puede aplicar a la mayoría de los dicots. También se puede utilizar para evaluar el efecto de nuevos compuestos en el rendimiento fotosintético, por ejemplo midiendo la fluorescencia de clorofila.