Name: Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Descubre cómo identificar reguladores de la transpiración en plantas mediante imagen térmica a gran escala en Helianthus annuus. Este método permite evaluar compuestos químicos que afectan la conductancia estomática y la eficiencia hídrica.

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El trabajo fue apoyado por Pomona College Start-up Funds y Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ) así como el Programa de Biología Molecular de Pomona College a través del Programa Estelar de Asistente de Investigación de Verano (a KG).

1. Cultivo de las plantas
<ol><li>Agregue una capa de vermiculita fina de 4 cm de espesor a las bandejas de planta estándar de 10 pulg. x 20 pulgadas (254 mm x 501 mm) sin orificios.</li>
	<li>Coloque los soportes de semillas (ver Tabla de Materiales)2 cm de distancia en las bandejas de la planta.</li>
	<li>Llene los soportes de semillas con vermiculita.</li>
	<li>Coloque una semilla de girasol con su extremo puntiagudo hacia abajo en cada soporte de semilla, empujando hacia abajo para que la mitad de la semilla permanezca expuesta. NOTA: Una semilla de girasol es asimétrica y el extremo puntiagudo desde donde emergerá el radio debe apuntar hacia abajo. La colocación adecuada de las semillas es importante, ya que la reorientación de la raíz y el tallo no son posibles dentro de los soportes de semillas. El extremo redondeado de la semilla debe extenderse más allá de la parte superior del soporte de semillas.</li>
	<li>Una vez que las semillas estén en su lugar, cúbralas con una capa adicional de 2 cm de espesor de vermiculita fina. Agua por enano desde arriba. La superficie debe permanecer húmeda después de una hora. Si ese es el caso, cubra las bandejas con tapas.</li>
	<li>Cultivar plantas en una cámara de crecimiento o un invernadero. Las condiciones recomendadas son una intensidad de luz de 140 mmol fotones-2s-1 y un fotoperiodo de 16 h de luz a 22oC y 9 h de oscuridad a 20oC durante 5 días. NOTA: El riego no debe ser necesario a menos que la superficie se seque visiblemente.</li>
</ol>2. Configuración del sistema hidropónico
<ol><li>Encuentre un recipiente de tamaño adecuado para el cultivo hidropónicamente de plantas. El tamaño del envase debe adaptarse al espacio disponible en la cámara de crecimiento o invernadero. Se recomienda una profundidad mínima de 15 cm.</li>
	<li>Llene el recipiente con agua destilada y agregue fertilizante hidropónico general según lo indicado por el fabricante. La solución hidropónica resultante debe ser aireada y en constante movimiento, lo que se puede lograr mediante el uso de bombas de aire y agua.</li>
	<li>Preparen los flotadores hidropónicos.<ol>
<li>Corte una hoja de espuma de poliestireno expandido de 2 cm de espesor (ver Tabla de Materiales)a las dimensiones del recipiente. La hoja debe cubrir la mayor parte de la superficie del recipiente con el fin de limitar el crecimiento de algas. Una herramienta de quema de madera es eficaz para cortar espuma de poliestireno y es lo suficientemente versátil para este protocolo. ADVERTENCIA: Los humos o vapores liberados durante el corte en caliente de espuma de poliestireno son graves riesgos para la salud. Utilice la protección respiratoria adecuada. Los usuarios también pueden satisfacer los requisitos de ventilación cortando la espuma bajo una campana de humo.</li>
		<li>Haga agujeros (1-2 cm de diámetro) en la lámina de espuma de poliestireno utilizando una herramienta de quema de madera. La distancia entre los centros de dos agujeros se puede ajustar a las necesidades del experimento. Sin embargo, se recomienda una distancia mínima de 2,5 cm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transferencia de plántulas a hidroponía y crecimiento de plantas
<ol><li>Extraiga suavemente las plántulas de 5 días de edad de la vermiculita y transfiera inmediatamente a un recipiente lleno de agua durante 30 minutos. Este paso eliminará el exceso de vermiculita y suavizará los pericarpos restantes. La raíz primaria emergente debe ser visible.</li>
	<li>Retire las paredes del pericarpo a mano si es necesario para optimizar la futura expansión de los cotiledons.</li>
	<li>Transfiera las plántulas dentro de los soportes de semillas al flotador de espuma de poliestireno. Cultivar las plantas con una intensidad de luz de 140oM-m -2s-1, una humedad relativa del 65% y un fotoperiodo de 16 h de luz a 22oC y 9 h de oscuridad a 20oC durante 2 días.</li>
</ol>4. Preparación previa al tratamiento
NOTA: Este procedimiento se aplica a la prueba de 20 productos químicos de una pequeña biblioteca de compuestos en triplicado, con 100 m de ABA en 10 mM MES-KOH (pH a 6,2) y 10 mM MES-KOH (pH a 6,2) que contiene 1% (v/v) de dimetil sulfóxido (DMSO) como controles positivos y negativos, respectivamente.
<ol><li>Asegúrese de que haya suficientes plantas listas para el tratamiento. Las plantas listas para el tratamiento deben ser lo suficientemente maduras como para tener cotilediones completamente desplegadas, pero lo suficientemente jóvenes como para que la proliferación de raíces laterales sea mínima. Para realizar un cribado estándar, se necesitan 69 plantas de este tipo.</li>
	<li>Retire la placa de 96 pocillos que contiene los pequeños compuestos del congelador de -80 oC. Descongelar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare 80 ml de búfer MES-KOH de 10 mM ajustado a un pH de 6,2 con 1 M KOH.</li>
	<li>Microtubos de 2 ml sin tapa de etiqueta. Preparar al menos seis tubos para el tratamiento de control negativo (10 mM MES-KOH (pH a 6,2) que contiene 1% (v/v) DMSO). Utilice tres tubos para el tratamiento de ABA (100 m ABA en 10 mM MES-KOH pH a 6,2), control positivo). Utilice los 60 tubos restantes para analizar el efecto de los 20 productos químicos en triplicado.</li>
	<li>Transfiera 10 ml de cada producto químico (10 mM en DMSO) a cada uno de los tres tubos debidamente etiquetados. Pipet 10 l de 10 mM ABA disuelto en DMSO en tres tubos y 10 l de DMSO en los seis tubos de control. ADVERTENCIA: Por naturaleza, algunos compuestos pueden causar efectos graves para la salud y los usuarios deben tomar las medidas de protección adecuadas.</li>
	<li>Añadir 990 ml de 10 mM MES-KOH (pH a 6,2) a cada uno de los 69 tubos. Dispensar el tampón MES con suficiente fuerza para mezclar el producto químico con el tampón MES, pero tenga mucho cuidado de no usar tanta fuerza que los productos químicos y el tampón MES squirt fuera del tubo. Alternativamente, vórtice a baja velocidad.</li>
</ol>5. Configure la cámara termográfica
<ol><li>Monte la cámara termográfica en un soporte de copia. Conecte todos los cables a un ordenador portátil. NOTA: La grabación se realiza en condiciones de temperatura (20 oC a 25 oC), humedad (50% a 70%) y la calidad de la luz (110 a 140 mófonos-2s-1) similar a los utilizados para el cultivo de las plantas.</li>
	<li>Encienda la cámara y luego el portátil y abra el software de análisis de imágenes térmicas. NOTA: Las instrucciones posteriores para la grabación se aplican a un software específico utilizado (consulte Tabla de materiales).</li>
	<li>Ajuste los ajustes de grabación.<ol>
<li>Pase el ratón sobre el botón rojo de grabación en la parte superior de la ventana central. Aparecerá un menú desplegable. Haga clic en el icono de llave en el icono Grabar configuración.</li>
		<li>Seleccione el modo de registro y las opciones adecuados. Se podría utilizar la opción de registro periódicamente, con un fotograma capturado por minuto y una parada manual. Tenga en cuenta el destino del archivo donde el software guardará el vídeo. Cierre la ventana Configuración de registro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Preparación y tratamiento de plantas
<ol><li>Coloque los tubos sin tapa que contengan los productos químicos en los bastidores de tubos. Alternativamente, una hoja de espuma de poliestireno se puede cortar y pinchar con una herramienta de quema de madera como se describe en el paso 2.3 para hacer un bastidor de tubo personalizado. El diámetro de cada orificio debe estar muy cerca del diámetro externo de los tubos sin tapa para mantenerlos firmemente. NOTA: El campo de visión de la cámara es un factor limitante que debe tenerse en cuenta a la hora de decidir cómo se mantendrán los tubos sin tapa en su lugar.</li>
	<li>Distribuir uniformemente los tubos de control positivos y negativos, así como los tubos experimentales en los bastidores para tener en cuenta el sesgo relacionado con la posición17.</li>
	<li>Preparar los siguientes materiales junto a las plantas cultivadas hidropónicamente: tijeras de microdisección, un plato poco profundo con agua, delicadas toallitas de tarea, los 69 tubos sin tapa que contienen los diferentes productos químicos.</li>
	<li>Repita los pasos siguientes para cada planta que se va a tratar. El brote de girasol siempre permanecerá en el soporte de semillas.<ol>
<li>Levante cuidadosamente el soporte de semillas y sumerja rápidamente la raíz en el plato poco profundo que contiene agua.</li>
		<li>Cortar la raíz primaria bajo el agua para evitar la cavitación. El corte debe ocurrir 0,8-1 cm por debajo del extremo más basal del soporte de semillas.</li>
		<li>Inserción de la planta recién cortada en uno de los tubos que contienen los productos químicos.</li>
		<li>Si hay gotas de agua en los cotiledón, seque suavemente con una delicada toallita de tarea. NOTA: Estos cuatro pasos deben realizarse lo más rápido posible (10 min o menos) para evitar incoherencias en el estudio cinético.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mueva las plantas debajo de la cámara termográfica y asegúrese de que todas las plantas estén dentro del campo de visión de la cámara. Ajuste la altura de la cámara y la posición de los bastidores según sea necesario.</li>
</ol>7. Grabación
<ol><li>Enfoca la cámara a la superficie de los cotiledón pulsando Ctrl + Alt + A.</li>
	<li>Pase el ratón sobre el botón rojo y haga clic en la opción Grabar una película. Se debe abrir una nueva ventana que confirme que la grabación debe abrirse.</li>
	<li>Detenga la grabación 1-2 horas más tarde. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>8. Recopilación de datos
<ol><li>Ir a Archivo ? Abiertos ? Busque el archivo . SEQ y ábralo.</li>
	<li>Deja de tocar la película.</li>
	<li>En el lado izquierdo de la ventana principal, haga clic en añadir un icono de ROI del cursor de medición (3x3 píxeles). ROI significa Región de Interés.</li>
	<li>Pase el ratón sobre el centro de un cotileón de la primera planta y haga clic izquierdo una vez. El cursor 1 ya está en su lugar. Etiquete el segundo cotileon de la primera planta repitiendo el procedimiento. Debe tenerse en cuenta el orden de las etiquetas.</li>
	<li>Repita el procedimiento. Todas las plantas deben estar etiquetadas con dos cursores.</li>
	<li>Haga clic en el icono Editar ROIs. En la ventana principal, haga clic izquierdo y mantenga presionado en la esquina superior izquierda y desplácese a la esquina inferior derecha para seleccionar todos los IU.</li>
	<li>Pase el ratón sobre el icono Visor de estadísticas y seleccione Trazado temporal. Se abrirá una nueva ventana.</li>
	<li>Dirige la película. Un gráfico se llenará con los datos.</li>
	<li>En esta ventana, haga clic en la flecha doble en la esquina superior derecha para abrir un nuevo menú.</li>
	<li>Haga clic en el icono Guardar. Guardar como valores X e Y en el trazado (.csv). Cierre el software una vez exportados los datos.</li>
</ol>9. Análisis de datos
<ol><li>Abra el archivo .csv con un software de análisis de datos (por ejemplo, Microsoft Excel). Tenga en cuenta que las tres primeras columnas (De a C) proporcionan información sobre el número de fotograma, el tiempo absoluto y el tiempo relativo. Las columnas restantes proporcionan la temperatura de cada ROI a lo largo del tiempo.</li>
	<li>Decidir la naturaleza de la herramienta estadística que se utilizará; esta decisión depende de diferentes factores, incluido el diseño experimental. NOTA: En nuestro ejemplo, se calcula una puntuación estándar, o puntuación z, para cada muestra en función de la media de la población y la desviación estándar de la población. Para cada muestra, se calcula un valor p a partir de la puntuación z. Este método permite la confirmación de los controles positivos y negativos, así como la identificación de nuevos compuestos que se probarán más.</li>
</ol>

<ol><li>Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+adaptation+to+drought+stress%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Plant adaptation to drought stress.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
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<li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+dimeric+ABA+receptors+elicits+guard+cell+closure%2C+ABA-regulated+gene+expression%2C+and+drought+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).</li>
<li>Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+agrochemical+ligands+for+engineered+abscisic+acid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors.</a> Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics+reveals+negative+regulation+of+abscisic+acid+signaling+by+a+plant+immune+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway.</a> Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Abscisic+Acid+Antagonists+Identified+with+Chemical+Array+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Chemical+Inhibitor+of+ABA+Signaling+Targets+All+ABA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).</li>
<li>Takeuchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designed+abscisic+acid+analogs+as+antagonists+of+PYL-PP2C+receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions.</a> Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).</li>
<li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+modification+of+sunflower+oil+to+expand+its+industrial+value%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).</li>
<li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies%3A+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).</li>
<li>Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermography+to+explore+plant-environment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Thermography to explore plant-environment interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).</li>
<li>Merlot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+infrared+thermal+imaging+to+isolate+Arabidopsis+mutants+defective+in+stomatal+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation.</a> The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El número de compuestos que se pueden probar en un día determinado depende principalmente de (i) el espacio ambientalmente controlado disponible para el cultivo de las plantas y para realizar la pantalla, así como (ii) el número de individuos que pueden participar en el paso 6 del protocolo. Recomendamos el uso de tres réplicas experimentales para consolidar la interpretación de los resultados después del tratamiento estadístico. En un día típico, uno a dos individuos pueden examinar 60 compuestos en triplicados sin difi...

La tolerancia al estrés en las plantas es un rasgo poligénico influenciado por una variedad de características y mecanismos moleculares, celulares, de desarrollo y fisiológicos1. Las plantas en un entorno fluctuante necesitan modular continuamente sus movimientos estomatales para equilibrar la demanda fotosintética de carbono manteniendo el agua suficiente y previniendo la invasión de patógenos2; sin embargo, los mecanismos por los cuales se toman estas "decisiones" de compensación se entienden mal3. La introducción de moléculas bioactivas en las plantas puede modular su fisiología y ayudar a sondear nuevos mecanismos de regulación.
El cribado a gran escala de moléculas pequeñas es una estrategia eficaz utilizada en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer y ensayos farmacológicos para probar los efectos fisiológicos de cientos a miles de moléculas en un corto período de tiempo4,5. En biología vegetal, el cribado de alto rendimiento ha demostrado su eficacia, por ejemplo, en la identificación de la molécula sintética pyrabactin6, así como el descubrimiento del receptor de ácido abscístico (ABA)7,8. Desde entonces, agonistas y antagonistas de los receptores ABA, y pequeñas moléculas capaces de modular la expresión de genes reporteros inducibles ABA han sido identificados9,10,11,12,13,14,15. Los enfoques de cribado de alto rendimiento disponibles actualmente para identificar pequeños compuestos que pueden modular la apertura estomatal tienen algunos inconvenientes: (i) los protocolos que giran alrededor de la vía de señalización ABA pueden impedir la identificación de nuevos mecanismos independientes de aba, y (ii) las estrategias in vivo utilizadas para la identificación de moléculas pequeñas bioactivas dependen principalmente de sus efectos fisiológicos sobre la germinación de semillas o el crecimiento de la plántula, y no en la regulación de la transpiración vegetal por se.
Además, aunque hay muchas maneras de tratar las plantas con moléculas bioactivas, la mayoría de ellas no son adecuadas para un estudio a gran escala del movimiento estomatal. En resumen, las tres técnicas más comunes son la aplicación foliar mediante pulverización o inmersión, tratamiento del sistema radicular y riego radicular. La aplicación foliar no es compatible con las metodologías más comunes y rápidas para medir la apertura estomatal ya que la presencia de gotas en la superficie de la hoja interfiere con la recopilación de datos a gran escala. Las principales limitaciones del riego radicular son los grandes requisitos de volumen de muestra, la retención potencial de los compuestos por elementos en la rizosfera, y la dependencia de la toma activa de raíces.
Aquí, presentamos un método a gran escala para identificar nuevos compuestos que regulan la transpiración de plantas que no necesariamente implican mecanismos DE respuesta a la sequía ABA o conocidos y permite un tratamiento eficiente y confiable de las plantas. En este sistema, las plantas de Helianthus annuus son tratadas utilizando un enfoque de alimentación de raíces que consiste en cortar la raíz primaria de las plántulas cultivadas hidropónicamente y sumergir el sitio de corte en la solución de la muestra. Una vez tratado, el efecto de cada compuesto en la transpiración de las plantas se mide utilizando una cámara termográfica infrarroja. Dado que un determinante importante de la temperatura de la superficie de la hoja es la tasa de evaporación de la hoja, los datos de imágenes térmicas pueden correlacionarse directamente con la conductancia estomatal. El cambio relativo en la temperatura foliar después del tratamiento químico proporciona así un medio directo para cuantificar la transpiración de la planta.
H. annuus es uno de los cinco mayores cultivos de semillas olea-oilenales en el mundo16 y los descubrimientos realizados directamente en esta planta pueden facilitar futuras transferencias de tecnología. Además, las plántulas H. annuus tienen cotiledón grande y plano, así como una gruesa raíz primaria, que era ideal para el desarrollo de este protocolo. Sin embargo, este método se puede adaptar fácilmente a otras plantas y una variedad de compuestos.
Este protocolo se puede utilizar para identificar eficazmente moléculas capaces de desencadenar el cierre estomatal o promover la apertura estomatal, lo que tiene implicaciones importantes para entender las señales que regulan la conductividad estomatal y la adaptación de las plantas al medio ambiente Tensiones.

<table><tbody><tr><td>1020 bandejas de cultivo de plástico sin orificios</td><td></td><td></td> de drenaje <td>Bandejas estándar de 10 x 20</td></tr><tr><td>pulgadas Microtubos de 2,0 mL, sin tapa</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-283NC</td><td></td></tr><tr><td>Ácido abscísico (ABA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de aire</td><td>Active Aqua</td><td>AAPA7.8L</td><td>2 Salidas, 3W, 7,8 L/min</td></tr><tr><td>Piedras difusoras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de compuestos químicos</td><td>MicroSource Discovery</td><td></td><td>Colección de productos naturales</td></tr><tr><td>Creative Versa-Tool (herramienta para quemar madera)</td><td>Nasco</td><td>9724549</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO), cultivo de células vegetales probado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Mancha solar enana Semillas de girasol</td><td>Outsidepride.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eritrosina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>200964</td><td></td></tr><tr><td>Set de fertilizantes hidropónicos (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)</td><td>General Hydroponics</td><td>GL51GH1421.31.11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Limpiadores para tareas delicadas</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Laptop</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de</td><td></td><td></td><td></td> microdisección</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>ResearchIR Software</td><td>FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R-Tech Tablero de espuma de poliestireno rígido</td><td>Soportes para semillas Insulfoam</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Araponics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Super Tub (tina de plástico)</td><td>Maccourt</td><td>ST3608</td><td>Bañera de 36 x 24 x 8 pulgadas utilizada para hidroponía</td></tr><tr><td>T450sc LWIR (infrarrojo de onda larga) Cámara termográfica de mano</td><td>FLIR</td><td>FLIR-T62101</td><td>Viene con el cable de carga requerido y el cable USB necesario para conectarse a la computadora portátil</td></tr><tr><td>Vermiculita</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de agua</td><td>SunSun</td><td>HW-304B Pro Filtro</td><td></td> de recipiente</tr></tbody></table>

identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en helianthus annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

La adaptación de las plantas a las tensiones bióticas y abióticas se rige por una variedad de factores, entre los que la regulación de la apertura estomatal en respuesta al déficit de agua o patógenos juega un papel crucial. La identificación de moléculas pequeñas que regulan el movimiento estomatal puede contribuir, por lo tanto, a comprender la base fisiológica por la que las plantas se adaptan a su entorno. Los enfoques de cribado a gran escala que se han utilizado para identificar los reguladores del movimiento estomatal tienen limitaciones potenciales: algunos dependen en gran medida de la vía de señalización hormonal del ácido abscés (ABA), excluyendo así los mecanismos independientes de la ABA, mientras que otros dependen de la observación de efectos fisiológicos indirectos a largo plazo como el crecimiento y desarrollo de las plantas. El método de cribado presentado aquí permite el tratamiento a gran escala de plantas con una biblioteca de productos químicos junto con una cuantificación directa de su transpiración por imágenes térmicas. Dado que la evaporación del agua a través de la transpiración da como resultado un enfriamiento de la superficie de la hoja, las imágenes térmicas proporcionan un enfoque no invasivo para investigar los cambios en la conductancia estomatal a lo largo del tiempo. En este protocolo, las plántulas Helianthus annuus se cultivan hidropónicamente y luego se tratan mediante la alimentación de las raíces, en la que la raíz primaria se corta y se sumerge en el producto químico que se está probando. Las imágenes térmicas seguidas de un análisis estadístico de los cambios de temperatura cotiledóres a lo largo del tiempo permiten la identificación de moléculas bioactivas que modulan la apertura estomatal. Nuestros experimentos de prueba de concepto demuestran que un producto químico se puede llevar desde la raíz cortada hasta el cotilería de la plántula de girasol en 10 minutos. Además, cuando las plantas son tratadas con ABA como un control positivo, se puede detectar un aumento en la temperatura de la superficie de la hoja en cuestión de minutos. Nuestro método permite así la identificación eficiente y rápida de nuevas moléculas que regulan la apertura estomatal.

Un experimento con el tinte rojo Eritrosina B (0,8 kDa) demuestra la capacidad de los productos químicos para ser absorbidos visiblemente a través de una raíz cortada en los cotiledones de una plántula de girasol en 10 minutos(Figura 1).
Cuando las plantas son tratadas con ABA, se detecta un aumento en la temperatura de las hojas en los cotilediones de girasol en cuestión de minutos. Este aumento de...

Proporcionamos un método para identificar moduladores de transpiración foliar mediante cribado a gran escala de una biblioteca compuesta.

Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Este protocolo utiliza imágenes térmicas para identificar nuevos compuestos capaces de regular la transpiración de la planta. Esta técnica es versátil con respecto a las especies vegetales que se pueden probar, la naturaleza del compuesto y el tipo de imagen. Para configurar las plantas para el cultivo, primero agregue una capa de cuatro centímetros de espesor de vermiculita fina a bandejas de plantas estándar de 10 por 20 pulgadas sin agujeros y coloque los soportes de semillas a dos centímetros de distancia en las bandejas.Llene los soportes de semillas con vermiculita y coloque un extremo puntiagudo de semilla de girasol hacia abajo en cada soporte para que la mitad de la semilla permanezca expuesta. Cuando todas las semillas hayan sido chapadas, cúbralas con dos centímetros adicionales de vermiculita fina y niebla con agua desde arriba. Después de una hora, cubra las bandejas con tapas y coloque las plantas en una cámara de crecimiento en un invernadero.Para instalar el sistema hidropónico, llene un recipiente de tamaño adecuado para el cultivo de plantas hidropónicamente con agua destilada y agregue fertilizante hidropónico general según lo indicado por el fabricante. A continuación, utilice bombas de aire y agua para airear la solución hidropónica resultante con movimiento constante. Para preparar los flotadores hidropónicos, corte una lámina de espuma de poliestireno expandido de dos centímetros de espesor a las dimensiones del contenedor y utilice la herramienta de quema de madera para hacer agujeros de uno a dos centímetros de diámetro en la espuma.A continuación, coloque los flotadores en el sistema hidropónico. Cinco días después de la siembra, tire suavemente de las plántulas de la vermiculita. Coloque inmediatamente las plántulas en un recipiente de agua durante 30 minutos para eliminar el exceso de vermiculita y suavizar los pericarpos restantes.Cuando las raíces primarias emergentes sean visibles, retire los pericarpos a mano según sea necesario. Transfiera las plántulas dentro de los soportes de semillas en los flotadores de espuma de poliestireno preparados en el sistema hidropónico. Cultivar las plantas en hidroponía durante dos días.Deje que los productos químicos de la pequeña biblioteca de compuestos se descongelen a temperatura ambiente. Etiqueta seis microtubos sin tapa y dos mililitros para el tratamiento de control negativo, tres tubos para el tratamiento ABA y los 60 tubos finales para el análisis de los efectos de los 20 productos químicos de interés en el triplicado. Añadir 10 microlitros de cada producto químico en cada uno de los tubos de ensayo, 10 microlitros de 10 MILilitros ABA y dimetil sulfóxido en los tres tubos ABA, y 10 microlitros de dimetil sulfóxido en los seis tubos de control.A continuación, mezcle cuidadosamente 990 microlitros de 10 mililitros de hidróxido de potasio MES en cada tubo. Coloque los tubos en un portatubos con el control positivo y negativo y los tubos experimentales distribuidos uniformemente dentro del bastidor para tener en cuenta el sesgo relacionado con la posición. Para configurar la cámara termográfica, primero monte la cámara en un soporte de copia y conecte todos los cables a un portátil.Encienda la cámara antes de encender el portátil y abra el software de análisis de imágenes térmicas. Para ajustar los parámetros de grabación, pase el ratón sobre el botón Grabar para permitir la selección del icono de llave inglesa en Configuración de grabación y seleccione el modo de grabación y las opciones adecuados. Para el tratamiento de las plántulas, levante cuidadosamente el soporte de semillas y sumerja rápidamente la raíz en el plato poco profundo que contiene agua.Cortar la raíz primaria de cada plántula bajo el agua 0,8 a un centímetro por debajo del extremo más basal del soporte de semilla para evitar la capitación e insertar la planta recién cortada en un tubo de productos químicos. Cuando todas las plántulas hayan sido transferidas, coloque las plantas bajo la cámara termográfica y confirme que todas las plantas están dentro del campo de visión de la cámara. Para enfocar la cámara en la superficie de los cotiledones, pulse Control Alt A y haga clic en Grabar una película.Se abrirá una nueva ventana que confirme la grabación. Después de una o dos horas, detenga la grabación. Para el análisis de datos, abra los archivos seq correctos y detenga la película.Haga clic en el icono Añadir una región de cursor de medición de interés de tres por tres píxeles y mueva el ratón sobre el centro de un cotiledone de la primera planta. Haga clic izquierdo en la imagen para etiquetar el cotiledone. Etiquetar el segundo cotiledone de la primera planta de la misma manera.Cuando todos los plantas se hayan etiquetado con dos cursores, haga clic en el icono editar regiones de interés y haga clic con el botón izquierdo del 18 y desplácese para seleccionar todas las regiones de interés. A continuación, pase el ratón sobre el icono del visor de estadísticas y seleccione el trazado temporal. Se abrirá una nueva ventana.Ejecute la película, un gráfico se llenará con los datos. A continuación, en la ventana del gráfico, haga clic en la flecha doble para abrir un nuevo menú y haga clic en el icono de guardar para guardar los datos. El uso del tinte rojo eritrosina B demuestra la capacidad de los productos químicos para ser absorbido visiblemente a través de una raíz cortada en los cotiledones de una plántula de girasol dentro de 10 minutos.Cuando las plantas son tratadas con ABA, se detecta un aumento en la temperatura de las hojas en los cotiledones de girasol dentro de los 30 minutos que se asocia con la disminución de la abertura estomatal y la conductancia estomatal. Además, se observa un aumento de la temperatura foliar 15 minutos después del tratamiento con 10 ABA micromolar y 20 minutos después del tratamiento con cinco ABA micromolares que demuestran que la medición de la temperatura de la hoja por imágenes térmicas es un buen proxy para medir la apertura y la conductividad estomatal. En este experimento representativo, un tratamiento estadístico estándar basado en la puntuación permite la identificación de productos químicos que promueven el cierre o la apertura del estomatal.Para medir los efectos de los compuestos en la transpiración, es importante cultivar las plantas en condiciones óptimas de luz, humedad y temperatura. Este protocolo se puede aplicar a la mayoría de los dicots. También se puede utilizar para evaluar el efecto de nuevos compuestos en el rendimiento fotosintético, por ejemplo midiendo la fluorescencia de clorofila.

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Biology

Biología

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Un método simple para imágenes Arabidopsis Uso de hojas perfluorodecalina como un medio de imágenes infiltrativas

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Medición de conductancia de la hoja hidráulica y la conductancia estomática y sus respuestas a la irradiación y la deshidratación mediante el método de evaporación Flux (EFM)

Este protocolo se desarrolló para evaluar la tolerancia a la sequía de una gran colección de germoplasma de la lechuga vegetal de hoja (Lactuca sativa L.), con el fin de identificar un pequeño grupo de lechugas candidatas para su uso en estudios fisiológicos, moleculares y genéticos para identificar los rasgos subyacentes de tolerancia a la sequía junto con los programas de mejoramiento.

Semi-Alto rendimiento para Screening Potencial Sequía-tolerancia en lechuga (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) colecciones de germoplasma

Aquí presentamos un protocolo que permite visualizar los sitios de formación de hielo y las vías de propagación del hielo en las plantas utilizando termografía infrarroja de alta resolución (HRIT).

El uso de alta resolución Termografía Infrarroja (HRIT) para el Estudio de Hielo La nucleación y Hielo Propagación de Plantas

Se desarrolló un método para determinar la capacidad calorífica específica y la conductividad térmica del tejido foliar mediante un sondeo láser de infrarrojo cercano no invasivo y sin contacto, que requiere menos de 1 minuto por muestra.

Un láser de sondeo rápido método facilita la determinación no invasiva y sin contacto de la hoja de Propiedades Térmicas

Este método de fenotipado gravimétrico de relaciones de agua de alto rendimiento, telemétrico y de planta entera permite mediciones directas y simultáneas en tiempo real, así como el análisis de múltiples rasgos fisiológicos relacionados con el rendimiento involucrados en interacciones dinámicas entre plantas y entornos.

Una plataforma telemétrica y gravimétrica para el fenotipado fisiológico en tiempo real de las interacciones entre plantas y entornos

Aquí, presentamos un método simple para la observación directa y la medición automatizada de las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana en Arabidopsis thaliana. Este método aprovecha un dispositivo portátil de imágenes estomáticas, junto con una canalización de análisis de imágenes diseñada para imágenes foliares capturadas por el dispositivo.

Observación directa y medición automatizada de las respuestas estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 en Arabidopsis thaliana

Diseñamos un protocolo de fenotipado basado en imágenes para determinar las respuestas morfológicas y fisiológicas a tratamientos únicos y combinados de calor, sequía y encharcamiento. Este enfoque permitió la identificación de respuestas tempranas, tardías y de recuperación a nivel de toda la planta, particularmente en las partes aéreas, y destacó la necesidad de utilizar múltiples sensores de imagen.

Fenotipado basado en imágenes de alto rendimiento para determinar las respuestas morfológicas y fisiológicas a estreses simples y combinados en patata

A gran escala de pantallas de bibliotecas metagenómicas

A gran escala inmunodetección de las proteínas diana a través del cerebro de los primates todo es posible mediante el empleo de tejidos novedosos métodos de inclusión y corte en combinación con el uso de aparatos creativas para la tinción de lotes de varias secciones de flotación libre en un momento dado.

Lote de inmunotinción para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro del mono entero

Descubre cómo identificar reguladores de la transpiración en plantas mediante imagen térmica a gran escala en Helianthus annuus. Este método permite evaluar compuestos químicos que afectan la conductancia estomática y la eficiencia hídrica.

Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus (Video) | JoVE Journal

Identificación de nuevos reguladores de la transpiración de plantas mediante el cribado térmico de imágenes a gran escala en Helianthus Annuus

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