Name: Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a estudiar liposomas individuales mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar inhomogeneidades en tamaño y composición. Este método permite analizar cientos de vesículas simultáneamente.

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Este trabajo fue financiado por el Consejo Danés de Investigaciones Independientes [número de subvención 5054-00165B].

1. Preparación de liposomas
NOTA: Brevemente, la preparación de liposomas generalmente incluye tres pasos cruciales: 1) preparación de películas de lípidos secos de la composición lipídica deseada; 2) rehidratación de los lípidos para la formación de liposomas; y 3) controlar el tamaño y lamelaridad de la población de liposomas.
<ol><li>Pesar los lípidos y disolverlos en tert-butanol:agua (9:1) en viales de vidrio.<ol>
<li>Disolver POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocolina; MW a 760 g/mol) a 50 mM.</li>
		<li>Disolver el colesterol (MW a 387 g/mol) a 25 mM.</li>
		<li>Disolver DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-Atto488; MW a 1.316 g/mol) a 0,1 mM.</li>
		<li>Disolver DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-Atto655; MW a 1.368 g/mol) a 0,1 mM.</li>
		<li>Disolver DSPE-PEG2000-biotina (1,2-aadisteryl-sn-glycero-3-phosphatethanolamine-N-[biotinyl(polietilenglicol)-2000]; MW a 3.017 g/mol) a 0,1 mM. NOTA: Calienta los lípidos a 55oC y usa la agitación magnética para asegurar la disolución completa de los lípidos. Alternativamente, utilice un baño de sonicación. Las existencias de lípidos no utilizados se pueden almacenar a -20 oC durante varios meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mezclar las reservas de lípidos preparadas en el paso 1.1 a una relación molar de POPC:colesterol:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotina 68.95:30:0.5:0.5:0.05, añadiendo 138 ol de POPC, 120 ol de colesterol 500 l de cada lípido fluorescente, y 50 L de lípidos fluorescentes, y 50 L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípidos fluorescentes, y 50L de lípido sfluorescent, y 50L de lípido s fluorescente, y 50L de lípido sfluorescent, y 50L de lípido. DSPE-PEG-biotina a un vial de vidrio fresco. NOTA: La composición de liposomas exacta se puede modificar fácilmente con el fin de abordar la cuestión específica de interés. Consulte la discusión para obtener más detalles.</li>
	<li>Afloje la tapa del vial de vidrio y congele el vial a presión en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Liofilizar la mezcla de lípidos congelados durante la noche.</li>
	<li>Añadir 1 mL de 200 mM de tampón D-sorbitol (buffer de sorbitol) a los lípidos secos.</li>
	<li>Calentar la mezcla a 45oC y exponerla a agitación magnética durante al menos 1 h. NOTA: El tampón debe reflejar la pregunta específica que se está abordando (por ejemplo, condiciones fisiológicas para el estudio de las interacciones entre membrana y proteína, o un tampón clínicamente aprobado específicamente para estudiar los liposomas de administración de medicamentos). Sin embargo, si no se requiere un tampón específico para el estudio, se puede aplicar un tampón sin iones para la rehidratación con el fin de reducir la multilamelaridad de los liposomas.</li>
	<li>Congele la suspensión lipídica sumergiendo el vial en nitrógeno líquido y espere hasta que la suspensión esté completamente congelada.</li>
	<li>Sumerja la suspensión congelada en un baño de calentamiento a 55 oC hasta que la mezcla esté completamente descongelada.</li>
	<li>Repita los pasos 1.7 y 1.8 hasta que la suspensión de liposoma haya estado expuesta a un total de 11 ciclos de congelación/descongelación. NOTA: Los ciclos repetidos de congelación/descongelación han demostrado reducir la multilamelaridadliposoma 23,que es primordial para la precisión del ensayo de un solo liposomas, ya que los liposomas multilamelares sesgarán la intensidad de fluorescencia frente a la relación de tamaño de los liposomas. La multilamelaridad suele ser intrínsecamente baja cuando se incluyen más de 0,5% de lípidos PEGylated en la formulación (como comúnmente se hace en liposomas para la administración de fármacos)24.</li>
	<li>Extruya la suspensión de liposomas una vez a través de un filtro de policarbonato de 800 nm utilizando un mini kit de extrusión. Siga las instrucciones del fabricante para el montaje del kit de extrusión (consulte Tabla de materiales).</li>
	<li>Almacene los liposomas a 4oC durante la noche.</li>
</ol>2. Preparación superficial de la cámara de imágenes
<ol><li>Preparar albúmina sérica bovina (BSA; 1 mg/ml), BSA-biotina (1 mg/ml) y estreptavidina (0,025 mg/ml) en 10 mM de HEPES (4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid) 95 mM NaCl buffer (buffer HEPES). NOTA: Para evitar la ráfaga liposomal, el tampón de sorbitol utilizado para la rehidratación y el tampón HEPES utilizado para la preparación de la superficie deben ser isotónicos. Por lo tanto, se recomienda comprobar la osmolaridad de los tampones antes del experimento.</li>
	<li>Mezclar 1.200 l de BSA y 120 l de biotina de BSA y añadir 300 ml de la mezcla a cada poca en una diapositiva de 8 pocillos para microscopía. NOTA: Aquí utilizamos una diapositiva de microscopio de 8 pozos disponible comercialmente con un fondo de vidrio (ver Tabla de Materiales),pero el protocolo se puede adaptar fácilmente a las cámaras de microscopio personalizadas.</li>
	<li>Incubar el tobogán durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lave la corredera 8x con 300 ml de tampón HEPES. NOTA: Tenga cuidado de no dejar los pozos sin tampón durante más de unos segundos, ya que el secado de la superficie lo dañará. Además, tenga cuidado de no rayar la superficie con la punta de la pipeta, ya que esto también la dañará. Por lo tanto, al aspirar el búfer de un pozo, hacerlo desde el borde o la esquina.</li>
	<li>Añadir 250 l de estreptavidina e incubar durante 10 min a RT.</li>
	<li>Repita los 8 lavados descritos en el paso 2.4.</li>
	<li>Almacene la corredera del microscopio con 300 ml de tampón de sorbitol en cada poca a 4 oC. La evaporación del disolvente dañará la superficie, así que coloque el portaobjetos del microscopio en una placa Petri y séllelo con parafilm a menos que el portaobjetos preparado se utilice inmediatamente.</li>
</ol>3. Inmovilización liposoma
<ol><li>Diluir la suspensión de liposomas a unos 20 éM de lípidos totales en el tampón de sorbitol. El procedimiento en la sección 1 producirá una suspensión liposoma de aproximadamente 10 mM de lípido total.</li>
	<li>Coloque la diapositiva en el microscopio y concéntrese en la superficie de la cámara utilizando la señal de reflexión láser aumentada de la interfaz de vidrio/buffer como guía.</li>
	<li>Lave la cámara 4x con 300 ml de tampón HEPES fresco.</li>
	<li>Añadir 10 l de liposoma diluido (20 m de lípido total) a un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Saque 100 ml de tampón de la cámara, agréguelo al tubo de microcentrífuga preparado en el paso 3.4, mezcle correctamente y vuelva a colocar los 110 ml en la cámara.</li>
	<li>Coloque la muestra bajo el microscopio y utilice un ajuste de microscopio rudimental capaz de detectar la señal del fluoróforo liposome para observar los liposomas que se están inmovilizando en la superficie.</li>
	<li>Apunta a una densidad superficial liposoma que sea lo suficientemente dispersa como para identificar liposomas individuales y lo suficientemente densa como para facilitar mediciones de alto rendimiento. Normalmente se utiliza un campo de visión de 50 m x 50 m, es óptimo de 300 a 400 liposomas por fotograma(Figura 2). Esto se puede lograr generalmente dentro de 5 a 10 minutos. NOTA: Si sólo se detectan partículas fluorescentes que se mueven rápidamente en el campo de visión, la causa podría ser una ausencia o una concentración demasiado baja de cualquiera de los componentes críticos para el proceso de inmovilización (BSA-biotina, estreptavidina, DOPE-PEG-biotina). Si no se detectan liposomas, podría estar relacionado con una baja concentración de liposomas, ajustes incorrectos para la detección de fluorescencia o potencialmente imágenes con un plano focal que no esté en la superficie del vidrio.</li>
	<li>Una vez que se alcance una densidad superficial liposoma adecuada, lave la cámara 3 veces con 200 ml de tampón HEPES. NOTA: Tenga en cuenta que la cinética inmovilizada también depende de propiedades liposoma como el tamaño y la carga y por lo tanto siempre debe optimizarse para cada formulación de liposomas.</li>
</ol>4. Adquisición de imágenes
NOTA: Esta sección dependerá mucho del sistema del microscopio disponible para el investigador que realice el experimento. Por lo tanto, se describirán las pautas generales sobre cómo realizar la imagen. Sin embargo, los ajustes exactos y cómo aplicarlos variarán entre las diferentes configuraciones del microscopio. Por ejemplo, algunos sistemas permiten elegir cualquier combinación de filtros de emisión deseada, mientras que otros microscopios están equipados con filtros específicos y preestablecidos.
<ol><li>Configure el microscopio para tomar imágenes de liposomas individuales. Para garantizar una calidad de imagen óptima y el análisis de datos posterior, utilice una alta resolución en escala de grises y un esquema de píxeles que permita sobremuestrear liposomas individuales. Se recomienda una profundidad de bits de 16 y al menos 1.024 x 1.024 píxeles para un área de 50 á m x 50 m. Si está disponible, el promediado de línea se puede aplicar de forma beneficiosa para reducir el ruido (por ejemplo, 3 escaneos por línea).</li>
	<li>Seleccione una potencia láser de excitación que garantice un blanqueo de fotograma a fotograma no significativo y una señal lo suficientemente fuerte como para discriminar claramente los liposomas individuales desde el fondo. El ajuste óptimo dependerá del microscopio específico utilizado, así como de la combinación de fluoróforos. Asegúrese de que los detectores no estén saturados, ya que esto sesgará la cuantificación de intensidad.</li>
	<li>La toma de imágenes de los fluoróforos DOPE-Atto488 y DOPE-Atto655 en los liposomas requiere imágenes de múltiples canales. Por lo tanto, asegúrese de que cada canal se toma una imagen secuencialmente para evitar la excitación cruzada. Por ejemplo, primero tome una imagen excitando a 488 nm y leyendo la emisión a 495 a 560 nm. A partir de entonces, tomar otra imagen por emocionante en 633 nm, pero la emisión de la lectura sólo a 660-710 nm. Los detalles dependerán del sistema del microscopio (por ejemplo, qué láseres y filtros) disponibles.</li>
	<li>Asegúrese de cubrir diferentes áreas de la superficie, adquiriendo al menos 10 imágenes de la muestra, por lo tanto, toma imágenes de al menos 3.000 liposomas individuales. Si la densidad de la superficie es inferior a 300 liposomas/marco, adquiera más imágenes. Asegúrese de reenfocar el microscopio para cada nueva imagen. NOTA: Para las imágenes de dos canales, asegúrese de asignar un nombre a los archivos de imagen para que los pares de imágenes con los mismos liposomas en diferentes canales de fluorescencia se puedan identificar fácilmente durante el análisis de datos.</li>
	<li>Para cuantificar la incertidumbre experimental relativa a la medición de la inhomogeneidad compositiva, idee la misma zona de liposomas antes y después de la reorientación (véase la figura 3 y la descripción en el texto).</li>
	<li>Exporte las imágenes desde el software del microscopio como archivos .tiff. Exportar los dos canales de los mismos liposomas individualmente.</li>
</ol>5. Análisis de datos
NOTA: Las rutinas de ajuste 2D Gaussianas especialmente desarrolladas se han empleado previamente6,11,12. Sin embargo, para aumentar la aplicabilidad del método se describe un proceso de análisis de datos que se puede implementar fácilmente en todos los laboratorios.
<ol><li>Cargue el par correspondiente de imágenes .tiff de dos canales de fluorescencia diferentes en el mismo campo de imágenes en el software FIJI (FIJI Is Just ImageJ).</li>
	<li>En el menú Imagen, elija Colory utilice la función Combinar canal para crear un compuesto de los dos canales.</li>
	<li>Observe si los liposomas que se muestran en dos canales diferentes muestran una buena colocación o si se produjo una deriva visible. NOTA: En caso de deriva entre los dos canales de fluorescencia (reconocido como un desplazamiento X-Y sistemático e igual entre la señal en los dos canales), uno de los fotogramas se puede traducir utilizando la función Transformar > Traducir en el menú Imagen de FIJI. Sin embargo, se debe tener cuidado con dicha manipulación de la imagen. Por lo tanto, se recomienda evitar la deriva tanto como sea posible al tomar imágenes de los liposomas.</li>
	<li>Asegúrese de que el complemento ComDet (v.0.3.6.1 o posterior) esté instalado, o haga esto en el menú Plugins.</li>
	<li>Abra el plugin ComDet para detectar partículas yendo al menú Plugins y eligiendo ComDet v.0.3.6.1 > Detectar partículas.</li>
	<li>En ComDet, asegúrese de elegir la función Detectar partículas en ambos canales individualmente. Establezca la Distancia máxima entre puntos colocalizados similar al tamaño aproximado de partículas. Por lo general, 4 píxeles es adecuado para la configuración que se describe aquí.</li>
	<li>La relación señal-ruido debe permitir la detección de partículas tenues incluso con una baja cantidad de fluorescencia. En ComDet, establezca esta relación en 3 estableciendo la Sensibilidad de Detección en ambos canales en Partículas muy tenues (SNR n.o 3). NOTA: Si bien este valor SNR suele ser apropiado, podría ser necesario establecerlo más alto (por ejemplo, si hay mucho ruido de imagen que puede identificarse como liposomas y dar lugar a falsos positivos).</li>
	<li>Asegúrese de que las casillas con Calcular colocalización y Trazar partículas detectadas en ambos canales estén marcadas, antes de pulsar OK.</li>
	<li>Después de ejecutar el análisis, se mostrarán dos ventanas emergentes con Resultados y Resumen. Exportar la tabla de datos Resultados que contienen los datos de colocalización (coordenadas de partículas e intensidad integrada de cada partícula detectada) a un software de gestión de datos de su elección guardando la tabla como un archivo .txt e importándola en el software.</li>
	<li>Asegúrese de que cada liposoma solo se incluye una vez en el conjunto de datos y no tanto el channel1/channel2 como la relación channel2/channel1. Por lo tanto, filtre los datos de modo que solo se trace Abs_frame 1 en el paso 5.11. NOTA: Al elegir Colocalizado n.o 1, se pueden eliminar del análisis falsos positivos del ruido de las imágenes. Sin embargo, los liposomas con sólo uno de los dos componentes fluorescentes presentes también serán excluidos del análisis, eliminando así potencialmente puntos de datos importantes del análisis.</li>
	<li>Trazar un histograma de la columna con datos que contienen la relación de intensidad para cada liposoma detectado.</li>
	<li>El grado de inhomogeneidad compositiva para el sistema liposomal estudiado está representado por la anchura de la distribución de la relación de intensidad. Para cuantificar la inhomogeneidad, ajuste el histograma de la relación de intensidad con una función gaussiana y extraiga la media (o) y la desviación estándar (sigma). Consulte la sección Resultados del representante.</li>
	<li>Ahora se puede calcular un valor para el grado de inhomogeneidad (DI) utilizando el coeficiente de variación definido como DI - sigma / .</li>
</ol>6. Calibración del tamaño del liposomas
<ol><li>Saque parte del stock de liposomas y extruya 21 veces a través de un filtro de policarbonato de 50 nm como se describe en el paso 1.10.</li>
	<li>Diluir los liposomas añadiendo 10 s de la suspensión de liposomas a 800 l de tampón de sorbitol en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Transfiera la muestra de liposomas diluidos a una cubeta de polipropileno de un solo uso.</li>
	<li>Mida el tamaño mediante la dispersión dinámica de la luz (DLS). Realice al menos tres corridas independientes para medir el tamaño y la polidispersidad de la suspensión liposoma. NOTA: Si es necesario, utilice una suspensión de liposoma más concentrada para la medición. También se pueden aplicar alternativas a la DLS (por ejemplo, análisis de seguimiento de nanopartículas) para medir el tamaño de los liposomas. Una descripción de cómo ejecutar dicha determinación de tamaño de partícula está fuera del alcance de este protocolo.</li>
	<li>Imagen de los liposomas de calibración en el microscopio utilizando exactamente los mismos ajustes experimentales definidos en los pasos 4.1 y 4.2.</li>
	<li>Extraer la intensidad integrada para cada liposoma de calibración en las imágenes de calibración: Extraiga la hoja de resultados filtrada que contiene intensidades de fluorescencia liposoma como se describe en los pasos 5.1 a 5.10. En la tabla de resultados, extraiga la columna "IntegratedInt".</li>
	<li>Debido a que la intensidad total integrada de un liposomas etiquetado en su membrana es proporcional a la superficie del liposo y por lo tanto es proporcional al cuadrado de su diámetro, trazar un histograma de intensidad de raíz cuadrada de la intensidad de fluorescencia de la liposomas de calibración.</li>
	<li>Ajuste el histograma de intensidad integrado producido en el paso 6.7 con una distribución normal de registro y extraiga la intensidad de fluorescencia media de los liposomas de calibración.</li>
	<li>Para determinar la relación entre la intensidad de la raíz cuadrada (IntSqrt) y el tamaño de los liposomas, calcule el factor de corrección (C) utilizando el diámetro medio de liposomas (Dia) ponderado por el número obtenido de las mediciones de DLS: Dia x C x IntSqrt es equivalente a C á Dia / IntSqrt.</li>
	<li>Calcular los valores de IntSqrt para los liposomas en el experimento de inhomogeneidad compositiva y convertirlos en diámetros multiplicándolos con el factor de corrección.</li>
	<li>Trazar el valor de la relación de intensidad en función del diámetro de los liposomas de inhomogeneidad compositiva, logrando así la inhomogeneidad en función del tamaño de los liposomas para una población de liposomas que abarcan aproximadamente 50 nm a 800 nm.</li>
</ol>

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<li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials+Interfaces%22%5BJournal%5D)">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807(2019).</li>
<li>Münter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li>
<li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles%3A+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li>
<li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Formulation+Method%2C+Lipid+Composition%2C+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity%3A+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li>
<li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements%3A+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li>
<li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choose+Your+Label+Wisely%3A+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649(2014).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Es importante tener en cuenta que si bien describimos en detalle cómo el ensayo de liposomas individuales se puede utilizar para estudiar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales, la plataforma es muy versátil. Como se ha mostrado y discutido anteriormente en la introducción, el protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar aspectos de la fusión membrana-membrana, interacciones proteína-membrana o caracterización portadora de fármacos liposomal. Para cualquier pregunta científica que se aborde, el...

Los liposomas son vesículas esféricas a base de fosfolípidos que se utilizan en gran medida tanto en la investigación básica como en la aplicada. Funcionan como excelentes sistemas de modelos de membrana, ya que sus propiedades fisioquímicas se pueden manipular fácilmente variando los componentes lipídicos que componen el liposoma1,2. Además, los liposomas constituyen el sistema de nanoportadores de administración de fármacos más utilizado, ofreciendo una mejor farmacocinética y farmacodinámica, así como una alta biocompatibilidad3.
Durante muchos años, los liposomas se han estudiado principalmente utilizando técnicas a granel, dando sólo acceso a los valores de lectura promedio del conjunto. Esto ha llevado a la mayoría de estos estudios a suponer que todos los liposomas en el conjunto son idénticos. Sin embargo, estos valores promediados por conjunto solo son correctos si el conjunto de datos subyacente se distribuye uniformemente alrededor del valor medio, pero puede representar una conclusión falsa y sesgada si el conjunto de datos incluye varias poblaciones independientes, por ejemplo. Además, suponiendo que el conjunto signifique representar a toda la población puede pasar por alto la información contenida dentro de la inhomogeneidad entre liposomas. Sólo recientemente han surgido ensayos cuantitativos que son capaces de sondear liposomas individuales, revelando grandes inhomogeneidades entre liposomas individuales con respecto a propiedades fisicoquímicas importantes incluyendo liposomas tamaño4, composición de lípidos5,6,y encapsulación eficiencia7, destacando la importancia de estudiar liposomas en el nivel de liposomas individuales.
Un área de investigación donde el promediado de conjunto de propiedades de liposomas se ha demostrado para sesgar los resultados está estudiando las interacciones proteína-membrana dependientes del tamaño de liposomas8,9. Tradicionalmente, los investigadores que estudian estos procesos se han limitado a la preparación de liposomas con diferentes diámetros medios de conjunto por extrusión a través de filtros con diferentes tamaños de poros 9. Sin embargo, la extracción del diámetro de los liposomas individuales utilizando ensayos de liposomas individuales ha revelado grandes solapamientos de población, con liposomas extruidos utilizando filtros de 100 nm y 200 nm que muestran hasta un 70% de superposición en su distribución de tamaño4. Esto podría sesgar severamente las mediciones a granel de las interacciones proteína-membrana dependientes del tamaño liposoma10. Realizando los estudios de interacción membrana-proteína utilizando el ensayo de un solo liposomas, los investigadores en su lugar aprovecharon el tamaño-polidispersidad dentro de la muestra, lo que les permite estudiar una amplia gama de diámetros de liposoma dentro de cada experimento individual, facilitando nuevos descubrimientos de cómo la curvatura de la membrana y la composición pueden afectar el reclutamiento de proteínas a las membranas4,11,12. Otro campo donde la aplicación de ensayos de un solo liposoma ha demostrado ser instrumental es en estudios mecánicos de fusión de membrana mediada por proteínas13,14. Para tales mediciones cinéticas, la capacidad de estudiar eventos de fusión individuales alivió la necesidad de la sincronización experimental del proceso de fusión, permitiendo nuevas perspectivas mecanicistas que de otro modo se habrían perdido en el promedio espaciotemporal realizado en mediciones de conjuntos a granel. Además, se han utilizado liposomas individuales como andamio de membrana, permitiendo la medición de proteínas individuales y ofreciendo nuevos conocimientos sobre la dinámica estructural de proteínas transmembranas15,16. Además, tales configuraciones basadas en proteoliposomas hicieron posible estudiar la función de los transportadores transmembranas individuales17 y los complejos proteicos formados poros18, así como el mecanismo de los péptidos bioactivos permeabilizadores de membrana19. Los liposomas individuales también se han utilizado como nanofluídicos de materia blanda con liposomas individuales inmovilizados en superficie que sirven como cámaras para reacciones enzimáticas en volúmenes de 10-19 L, aumentando el rendimiento y la complejidad de los ensayos de cribado con un consumo mínimo de producto20.
Recientemente, ensayos de liposomas individuales se han utilizado para caracterizar liposomas de administración de medicamentos en un nivel de detalle previamente sin pre-enpreenented. Los investigadores fueron capaces de cuantificar inhomogeneidades significativas en la cantidad de polímero unido a la superficie de liposomas individuales21. Los ensayos de un solo liposomas también permitieron mediciones de liposomas de administración de fármacos en medios complejos, como plasma sanguíneo, revelando cómo los elementos anclados a la superficie liposoma a través de anclajes lipídicos pueden ser susceptibles a la disociación cuando los liposomas están expuestos a condiciones que imitan a los experimentados durante la circulación in vivo22. En general, la versatilidad y utilidad de los ensayos de un solo liposo se corroboran por la gran variedad de problemas que estas configuraciones se han empleado para abordar, y imaginamos que la metodología continuará desarrollándose y encontrando uso en nuevos campos científicos.
Aquí describimos un ensayo de liposomas único basado en microscopía de fluorescencia que permite estudiar liposomas individuales de una manera de alto rendimiento(Figura 1). Para ilustrar el método, lo usamos para cuantificar el tamaño y la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales dentro de un conjunto. El ensayo emplea imágenes de microscopio de fluorescencia de liposomas individuales inmovilizados en una superficie de vidrio pasivado. Primero describimos los pasos críticos en el proceso de fabricación de liposomas que asegura el etiquetado y la inmovilización adecuados de liposomas fluorescentes. A continuación, describimos la preparación de la superficie necesaria para facilitar la inmovilización de liposomas antes de esbozar el procedimiento para asegurar densidades superficiales de liposomas adecuadas. Discutimos los parámetros de microscopía importantes para adquirir imágenes de alta calidad y delinear cómo realizar un análisis de datos simple, permitiendo la extracción de tamaño de liposomas e inhomogeneidad compositiva. Este protocolo genérico debe proporcionar una buena base para que el investigador interesado desarrolle el ensayo para su interés específico de investigación.

<table><tbody><tr><td>Portaobjetos de microscopía de 8 pocillos (y micro; portaobjetos)</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>Portaobjetos de microscopía con fondo de cristal</td></tr><tr><td>Avanti Mini Kit de extrusión</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td>Consumibles (filtros Whatman) se pueden adquirir de GE Healthcare</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>Negociado a través de la computadora Sigma</td></tr><tr><td>con el complemento FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td><td></td><td></td> <td>ComDet debe estar instalado. Además, se necesitará un software de manejo de datos (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad, Prism, etc.) capaz de cargar .txt archivos para trazar los datos</td></tr><tr><td>DOPE-Atto488</td><td>Atto-Tech</td><td>AD488-165</td><td></td></tr><tr><td>DOPE-Atto655</td><td>Atto-Tech</td><td>AD655-165</td><td></td></tr><tr><td>DOPE-PEG-Biotin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880129</td><td>Negociado a través de Sigma</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>S-6021</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td></td><td></td><td>, por ejemplo, ScanVac, Coolsafe de Labogene</td></tr><tr><td>Viales de vidrio,</td><td>cromatografía marrón</td><td>150903</td><td>viales de vidrio que pueden resistir la congelación instantánea en nitrógeno líquido. La versión de 8 mL de los viales tiene un tamaño que también encaja con las jeringas del kit de extrusión</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Honeywell Fluka</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Baño</td><td></td><td></td><td>calefactor Capaz de calentar hasta un mínimo de 65 &deg; C</td></tr><tr><td>Placa calefactora con agitación</td><td></td><td></td> magnética <td>Capaz de calentar hasta un mínimo de 65 ° C</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td> líquido <td>Incluido el contenedor para almacenamiento, p. ej. Baño de goma</td></tr><tr><td>Barras de agitación magnéticas</td><td>VWR</td><td>442-4520 (UE)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086 (UE)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td>Para las imágenes de este protocolo, un microscopio confocal Leica SP5 tiene se ha utilizado</td></tr><tr><td>Na HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Honeywell Fluka</td><td>71686</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>Negociado a través de Sigma</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>terc-Butanol (2-metil-2-propanol)</td><td>Honeywell Riedel-de Ha&euml; n</td><td>24127</td><td></td></tr><tr>Agua <td></td><td></td><td>ultrapura</td><td>, p. ej. MilliQ</td></tr></tbody></table>

un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

La mayoría de las investigaciones que emplean liposomas como sistemas de modelos de membrana o portadores de administración de fármacos se basa en técnicas de lectura a granel y por lo tanto intrínsecamente asume que todos los liposomas del conjunto son idénticos. Sin embargo, las nuevas plataformas experimentales capaces de observar liposomas a nivel de una sola partícula han hecho posible realizar estudios altamente sofisticados y cuantitativos sobre interacciones proteína-membrana o propiedades portadoras de fármacos en liposomas individuales, evitando así errores derivados del promedio del conjunto. Aquí presentamos un protocolo para preparar, detectar y analizar liposomas individuales mediante un ensayo de microscopía basado en fluorescencia, facilitando tales mediciones de una sola partícula. La configuración permite tomar imágenes de liposomas individuales de forma paralela masiva y se emplea para revelar el tamaño intramuestra y las inhomogeneidades compositivas. Además, el protocolo describe las ventajas de estudiar liposomas a nivel de liposomas individuales, las limitaciones del ensayo y las características importantes a tener en cuenta al modificarlo para estudiar otras preguntas de investigación.

Siguiendo el protocolo descrito permite crear imágenes de liposomas individuales de forma paralela masiva(Figura 1). La inmovilización superficial exitosa de liposomas debe ser inmediatamente evidente tras la adición de la solución de liposomas a la cámara (paso 3.6 en el protocolo) ya que las manchas de intensidad limitada de difracción deben aparecer en la imagen(Figura 1B y Figura 1</stron...

Este protocolo describe la fabricación de liposomas y cómo estos pueden ser inmovilizados en una superficie e imágenes individualmente de una manera paralela masiva utilizando microscopía de fluorescencia. Esto permite la cuantificación del tamaño y la inhomogeneidad compositiva entre los liposomas individuales de la población.

Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

La mayoría de las investigaciones con liposomas se basan en técnicas audaces que intrínsecamente asumen que todos los liposomas son idénticos. Mediante el estudio de liposomas individuales, se pueden observar inhomogeneidades significativas. La única técnica de liposomas presentada aquí nos permite estudiar cientos de liposomas simultáneamente y detectar inhomogeneidades en su tamaño y composición.El método se puede ajustar fácilmente para estudiar otros sistemas en un solo nivel de liposomas como interacciones de membrana proteica. Todo lo que necesitas es que el compuesto que estudias sea etiquetado fluorescentemente. Con este video, proporcionamos a los investigadores la herramienta sobre cómo pueden realizar estudios de liposomas individuales.Esperamos que esté claro que el ensayo se puede modificar fácilmente para estudiar una serie de otros temas científicos. Para empezar, mezclar las reservas de lípidos preparadas 138 microlitros de POPC y 120 microlitros de colesterol en un vial de vidrio fresco. A continuación, añada 500 microlitros cada uno de los dos lípidos con etiqueta fluorescente y 50 microlitros de DSPE-PEG-biotina.Afloje la tapa del vial de vidrio y congele el vial en nitrógeno líquido durante uno o dos minutos. Liofilizar la mezcla de lípidos congelados durante la noche en un secador de congelación. Por la mañana, añadir un mililitro de 200 militros D-sorbitol tampón a los lípidos secos.Calienta la mezcla a 45 grados Centígrados y exponga a la agitación magnética durante al menos una hora. A continuación, congele la suspensión de lípidos sumergiendo el vial en nitrógeno líquido y espere hasta que la suspensión esté completamente congelada. A continuación, sumerja la suspensión congelada en un baño de calefacción a 55 grados centígrados hasta que la mezcla esté completamente descongelada.Exponer la mezcla a un total de 11 ciclos de congelación y descongelación. Después de eso, usando un mini kit de extrusión, extruya la suspensión liposoma una vez a través de un filtro de policarbonato de 800 nanómetros. Mezclar 1.200 microlitros de BSA y 120 microlitros de biotina BSA.Añadir 300 microlitros de la mezcla a cada pozo en un portaobjetos de ocho pozos e incubar el portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Incline ligeramente la corredera y desde el borde de cada pozo aspirar el medio. Agregue inmediatamente 300 microlitros de tampón HEPES en cada pozo para lavar.Lavar cada pozo ocho veces en total. Añadir 250 microlitros de estreptavidina e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita los ocho lavados como se describió anteriormente.Coloque la diapositiva en el microscopio y ajuste el joystick del microscopio para centrarse en la superficie de la cámara. Esto se puede hacer fácilmente usando la señal de reflexión láser aumentada de la interfaz del búfer de vidrio como guía. En un tubo de microcentrífuga, añadir 10 microlitros del caldo de liposoma diluido que contenga 20 lípidos totales micromolares.Transfiera 100 microlitros de tampón desde la cámara al tubo de microcentrífuga, mezcle correctamente y transfiera los 110 microlitros de nuevo a la cámara. Poner la cámara bajo el microscopio y utilizar un ajuste de microscopio rudimental capaz de detectar la señal de los fluoróforos liposomas para observar los liposomas que se inmovilizan en la superficie. Configure el microscopio como se describe en el manuscrito.Para imaginar los fluoróforos DOPE ATTO488 y DOPE ATTO655 en los liposomas, imagine varios canales. Asegúrese de que cada canal se toma una imagen secuencial para evitar la excitación cruzada. Por ejemplo, primero tome una imagen apasionante a 488 nanómetros y la emisión de lectura a 495 a 590 nanómetros.A partir de entonces, cambie la configuración y tome otra imagen a partir de 633 nanómetros, pero la emisión de lectura sólo a 660 a 710 nanómetros. Analizar. En el menú de imágenes, elija color y utilice la función de canal de fusión para crear un compuesto de los dos canales. Observe si los liposomas en dos canales diferentes muestran una buena co-localización o si se produjo una deriva visible.Para detectar partículas, abra el menú de plugins, elija ComDet y haga clic en detectar partículas. En ComDet, compruebe que la configuración es correcta y pulse OK. Después de ejecutar el análisis, se muestran dos ventanas emergentes con resultados y resumen. La tabla de resultados contiene la relación de intensidad entre los dos canales.Exporte los resultados de la tabla de datos que contienen los datos de co-localización. Ajuste el histograma de la relación de intensidad con una función gaussiana y extraiga la media y la desviación estándar. La media y la desviación estándar se pueden utilizar para calcular el grado de inhomogeneidad.Preparar una formulación liposoma que ha sido extruida varias veces a través de un filtro de 50 nanómetros. Calibre el tamaño de los liposomas comparando la intensidad de la fluorescencia con los datos de tamaño de DLS. Con los mismos ajustes experimentales del microscopio que anteriormente, imagine los liposomas de calibración.Trazar un histograma de intensidad de raíz cuadrada de la intensidad de fluorescencia de los liposomas de calibración. Ajuste el histograma con una distribución normal del registro y extraiga la intensidad media de fluorescencia de los liposomas de calibración como la media geométrica. Para determinar la relación entre la intensidad de la raíz cuadrada y el tamaño del liposoma, calcule el factor de corrección dividiendo el diámetro liposoma promedio obtenido de las mediciones dinámicas de dispersión de luz con la media geométrica de la intensidad de la raíz cuadrada.Calcular valores de intensidad de raíz cuadrada para los liposomas en el experimento de inhomogeneidad compositiva y convertir estos dos diámetros multiplicando con el factor de corrección. Trazar el valor de la relación de intensidad en función del diámetro de los liposomas de inhomogeneidad compositiva, logrando así la inhomogeneidad en función del tamaño del liposoma para una población de liposomas que abarcan desde aproximadamente 50 nanómetros hasta 800 nanómetros. En este protocolo, la inmovilización superficial exitosa de liposomas fue inmediatamente evidente tras la adición de la solución de liposoma a la cámara indicada por las manchas de intensidad limitada de difracción.Se recomienda inmovilizar suficientes liposomas para lograr una densidad de 300 a 400 liposomas por fotograma. Una densidad más baja hace que el análisis de datos consuma más tiempo, mientras que una mayor densidad hace que sea difícil distinguir liposomas individuales. Si todo el campo de visión no está en el foco adecuado, la placa de muestra podría estar inclinada.Además, si los liposomas parecen grandes y borrosos, esto indica que el tampón en la cámara podría haberse evaporado y la superficie seca. Los histogramas de la relación de intensidad suelen revelar una distribución gaussiana alrededor de un valor de relación media. Si se observan fuertes desviaciones de una distribución gaussiana, indica un problema de sensibilidad de detección que sugiere que se ha excluido un subconjunto de liposomas que muestran una señal más débil.Después de ajustar el histograma de la relación de intensidad con una función gaussiana, se tradujo un grado de valor de inhomogeneidad de 0,23 al 32% de la población que diferenció en más del 23% de la relación molar media del conjunto. Se encontró que la cuantificación de la incertidumbre experimental era 0,1. El ensayo nunca será mejor que los materiales que usas, por lo que los liposomas unilaminar de alta calidad son esenciales.Por lo tanto, cuando los prepare, no corte ninguna esquina, como dejar fuera los ciclos de congelación y descongelación. Las imágenes deficientes conducirán a una gran incertidumbre experimental y te harán sobreestimar la inhomogeneidad, así que tómate el tiempo para adquirir buenas imágenes enfocadas. Lo que el ensayo básicamente hace es estudiar la densidad superficial de la etiqueta fluorescente.Si esta etiqueta fluorescente está en un lípido percolado, entonces este ensayo se puede utilizar para probar liposomas de prueba de calidad para la administración de medicamentos. La configuración se ha aplicado para estudiar cómo los péptidos se unen a las membranas y detectar la curvatura. Esto ha dado a los investigadores una visión única de las señales moleculares que gobiernan cómo se clasifican los péptidos dentro de las células.

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Bioingeniería

Se introduce una rápida basada en fluorescencia ensayo que controla la tasa de extinción de fluorescencia como una medida de la actividad del canal gramicidina. Los canales de gramicidina se utilizan como sensores de fuerza molecular para monitorear los cambios en las propiedades de bicapa lipídica detectada por las proteínas de dos capas de expansión.

Gramicidina basado en ensayo de fluorescencia, para la determinación de moléculas pequeñas posibles para modificar las propiedades bicapa lipídica

La distribución espacial y la dinámica temporal de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática es un tema candente en biología. En este caso, este problema se aborda mediante un análisis de fluctuación de imagen espacio-temporal que proporciona conceptualmente las mismas cantidades físicas de seguimiento de una sola partícula, pero utiliza etiquetas moleculares pequeñas y configuraciones de microscopía estándar.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

El protocolo presentado describe el análisis del transporte mediado por proteínas de membrana a nivel de transportador único utilizando bicapas lipídicas sin disolventes que atraviesan poros. Esto se logra mediante la creación de chips de matriz de nanoporos producidos a granel, combinados con la adquisición y el análisis de datos altamente paralelos, lo que permite el establecimiento futuro de cribados de efectores de proteínas de membrana.

Membrana de transporte de procesos analizados por un sistema de nanoporos viruta altamente paralela a la Resolución de la proteína individual

Describimos un ensayo basado en fluorescencia para medir la mezcla de fosfolípidos en grandes liposomas unilamelares reconstituidos con opsina.

Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

Aquí, presentamos un protocolo para estudiar el mecanismo molecular de la translocación de protones a través de membranas lipídica de liposomas sola, usando citocromo bo3  como ejemplo. Combinación electroquímica y microscopia de fluorescencia, cambios en el pH en el lumen de las vesículas individuales, contienen solo o múltiples enzimas, puede ser detectado y analizado individualmente.

Medidas solo de liposomas para el estudio de enzimas de membrana bombas de protones usando electroquímica y microscopia fluorescente

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Este protocolo describe un ensayo para la caracterización de la formación de gotas lipídicas (LD) en organoides intestinales humanos tras la estimulación con ácidos grasos. Discutimos cómo se utiliza este ensayo para la cuantificación de la formación de LD, y cómo se puede utilizar para la detección de alto rendimiento de medicamentos que afectan a la formación de LD.

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

El objetivo de este protocolo es sintetizar liposomas marcados con fluorescencia y utilizar la citometría de flujo para identificar la localización in vivo de liposomas a nivel celular.

Preparación, administración y evaluación de la captación celular in vivo específica del tejido de liposomas marcados con colorante fluorescente

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Este artículo ofrece una descripción detallada de cómo crear muestras para el seguimiento de una sola proteína en bicapas lipídicas soportadas por sólidos. También explica un microscopio de fluorescencia sencillo con sensibilidad a una sola molécula y una tasa de fotogramas rápida. Finalmente, describimos el procedimiento para extraer trayectorias de una sola proteína.

Seguimiento de proteínas individuales en bicapas lipídicas mediante microscopía de fluorescencia

Aprende a estudiar liposomas individuales mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar inhomogeneidades en tamaño y composición. Este método permite analizar cientos de vesículas simultáneamente.

Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales (Video) | JoVE Journal

Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales

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