Name: Detectar la migración y la infiltración de neutrófilos en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos en modelos de artritis en ratones mediante el ensayo de bolsa de aire y análisis hematológico automatizado. Estos métodos permiten estudiar la dinámica de neutrófilos en enfermedades inflamatorias.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 81430099 y 31500704), Proyectos de Cooperación Internacional e Intercambio (número de subvención 2014DFA32950), y el programa de investigación de la Universidad de Medicina China de Beijing ( números de subvención BUCM-2019-JCRC006 y 2019-JYB-TD013).

Todos los procedimientos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina China de Beijing.
NOTA: Se utilizaron ratones C57BL/6 (7-8 semanas de edad).
1. Aislamiento de neutrófilos
<ol><li>Adquisición de células de exudado peritoneal<ol>
<li>Preparar una solución fresca de peptona proteosa al 10% en ddH2O. Calcular el volumen necesario según el número de ratones. NOTA: Establezca el número de ratones como N, (2N+1) ml de solución debe disolverse y filtrarse de antemano.</li>
		<li>Rocíe el espacio de trabajo con 70% de etanol. Utilice un inyector de insulina para extraer 1 ml de solución de peptona y descargar burbujas.</li>
		<li>Realizar la primera inyección intraperitoneal de 1 ml de solución de peptona por ratón.<ol>
<li>Agarre el ratón en una posición de cabeza hacia abajo con una mano. Desinfecte el punto de inyección con bolas de algodón empapadas en alcohol. NOTA: La posición de inyección preferida se encuentra en el aspecto lateral del cuadrante inferior izquierdo o derecho del abdomen.</li>
			<li>Infundir los reactivos rápidamente. Inyectar 1 ml en la cavidad peritoneal de cada ratón con el inyector de insulina. NOTA: El ángulo entre la aguja y la piel debe ser de aproximadamente 15 a 30o para evitar dañar el intestino u otros órganos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Permita que la respuesta inflamatoria se desarrolle durante la noche. Después de las 12 h, realice la segunda inyección de la misma manera que la primera inyección.</li>
		<li>Tres horas después de la segunda inyección, anestesia completamente los ratones con 5% de isoflurano durante 5 minutos en una cámara de anestesia de gas a una velocidad de 2 L/min. Retire los ratones anestesiados de la cámara y sacrifique por luxación cervical. NOTA: Se garantiza una profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos antes de mover los ratones de la cámara a la unidad de respiración única. Las piernas no deben moverse cuando se pellizcan los dedos de los dedos. NOTA: Todos los pasos siguientes deben procesarse en una campana de cultivo de tejido.</li>
		<li>Rocíe el ratón con 70% de etanol. Colocar el ratón sobre una almohadilla de plástico estéril y fijar las extremidades con agujas.</li>
		<li>Utilice un conjunto estéril de herramientas quirúrgicas para hacer una incisión horizontal (1 cm) en el centro de la parte inferior del abdomen. Levante la piel de la parte superior del abdomen con fórceps y corte a lo largo de la línea media del abdomen y exponga la pared peritoneal intacta.</li>
		<li>Inyectar 5 ml de RPMI-1640 estéril medio completo en la cavidad abdominal con una aguja de 30 G x 1/2". Inserte la aguja a través de la pared peritoneal con el borde biselado de la aguja hacia arriba e inyecte todo el volumen.</li>
		<li>Agitar la almohadilla horizontalmente durante 5 min. Masajee el abdomen suavemente varias veces.</li>
		<li>Inyecte una aguja de 23 G x 1 1 1/4" en el espacio lateral del abdomen. Extraiga el líquido abdominal (5 ml) y recórtelo en un tubo centrífugo de 50 ml. NOTA: Coloque los tubos sobre hielo lo antes posible en caso de activación de neutrófilos.</li>
		<li>Inyectar otros 5 ml de medio completo y repetir el procedimiento para eliminar las células restantes del peritoneo. Aunar el líquido peritoneal en el tubo centrífugo de 50 ml.</li>
		<li>Centrifugar el líquido peritoneal agrupado a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Descarta el sobrenadante. Resuspenda las células en 1 ml de medio completo RPMI-1640. NOTA: No vórtice para evitar la activación de neutrófilos.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de neutrófilos<ol>
<li>Añadir 4 ml de medio de gradiente de densidad del 70,2% recién preparado (por ejemplo, Percoll) en un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
		<li>Superponga cuidadosamente 4 ml de medio de gradiente de densidad del 54,8% recién preparado en el medio de gradiente de densidad del 70,2% lentamente a lo largo del borde del tubo con puntas de pipeta afiladas en el tubo centrífugo de 15 ml. NOTA: Tenga cuidado para evitar perturbar la interfaz entre el medio de gradiente de densidad del 54,8% y el medio de gradiente de densidad del 70,2%.</li>
		<li>Superponga con cuidado la suspensión de celda peritoneal de 1 ml en la parte superior de la capa media de gradiente de densidad del 54,8% lentamente con puntas de pipeta afiladas(Figura 1A). NOTA: Tenga cuidado para evitar perturbar la interfaz entre la suspensión celular y el medio de gradiente de densidad del 54,8%.</li>
		<li>Centrífuga a 1.500 x g durante 30 min a 22oC sin frenada.</li>
		<li>Recoger los neutrófilos en la interfaz del medio de gradiente de densidad del 54,8% y las capas medias de gradiente de densidad del 70,2%(Figura 1B)a un nuevo tubo.</li>
		<li>Agregue 1 ml de RPMI-1640 medio completo a las células recogidas y resuspenda cuidadosamente las células pipeteando suavemente varias veces. Centrifugar a 100 x g durante 10 minutos en RT y retirar cuidadosamente el sobrenadante.</li>
		<li>Repita el paso de lavado (paso 1.2.6) una vez.</li>
		<li>Añadir 0,5 ml de medio de cultivo al pellet y resuspender las células pipeteando suavemente varias veces. Tome una alícuota de 50 l para contar las células usando un analizador de hematología automática.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ensayo de migración de neutrófilos
<ol><li>Mida la migración de neutrófilos mediante el ensayoTranswell 9 o el ensayo de cámara Zigmond como se describió anteriormente10,11.</li>
</ol>3. Ensayo de bolsa de aire
<ol><li>Primera inyección de aire<ol>
<li>En el día 0, anestesia completamente los ratones con 5% de isoflurano durante 3 minutos en una cámara de anestesia de gas a una velocidad de 2 L/min, y mantener la anestesia de cada ratón en una sola unidad de respiración con 2% de isoflurano a una velocidad de 0,5 L/min. NOTA: Se garantiza una profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos antes de mover los ratones de la cámara a la unidad de respiración única. Las piernas no deben moverse cuando se pellizcan los dedos de los dedos.</li>
		<li>Utilice un filtro de 0,22 m unido a una jeringa de 5 ml para obtener un volumen de 3 ml de aire esterilizado.</li>
		<li>Levante la piel posterior del ratón anestesiado con pinzas e inyecte por vía subcutánea 3 ml de aire esterilizado con una aguja de 26 G x 3/8".</li>
		<li>Después del tratamiento, retire los ratones de la unidad de respiración. Supervise a los ratones para asegurarse de que están vivos hasta que empiecen a moverse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segunda inyección de aire<ol>
<li>El día 3, inyecte 3 ml adicionales de aire esterilizado en el bolsillo de aire previamente establecido para sostener la bolsa de aire como se describe en la sección 3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratamiento<ol>
<li>El día 6, 6 h antes del sacrificio, inyectar diferentes tratamientos en la bolsa de aire. Inyectar 1 ml de solución salina con fosfato (PBS) como control negativo. Inyectar 1 ml de 1 g/ml LPS como control positivo para inducir inflamación local.</li>
		<li>Ratones completamente anestesiados con 5% de isoflurano durante 3 min en una cámara de anestesia de gas a una velocidad de 2 L/min, y mantener la anestesia de cada ratón en una sola unidad de respiración con 2% de isoflurano a una velocidad de 0,5 L/min. Preparar tampón de lavado según la Tabla de Materiales. NOTA: Se garantiza una profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos antes de mover los ratones de la cámara a la unidad de respiración única. Las piernas no deben moverse cuando se pellizcan los dedos de los dedos.</li>
		<li>Para cada bolsa de aire, lave la bolsa de aire con 1 ml de tampón de lavado y recoja el exudado inflamatorio en un tubo centrífugo de 15 ml. Lave la bolsa de aire con 2 ml de tampón de lavado 2x y recoja el exudado inflamatorio en el mismo tubo centrífugo.</li>
		<li>Centrífuga a 100 x g durante 10 minutos en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de lavado. Cuente las células para cuantificar la proporción de neutrófilos utilizando el analizador de hematología automática. NOTA: Consulte los resultados representativos en la Figura 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Inducción del modelo de ratón de artritis inducida por adyuvantes (AA)
<ol><li>Suspenda el adyuvante completo de Freund (CFA) vortexing al menos 5 s, luego extraiga 100 s de suspensión en un inyector de insulina. NOTA: Recomendamos el uso de CFA completamente nuevo en experimentos para garantizar la esterilidad.</li>
	<li>Anestetizar ratones como se describe en el paso 3.1.1.</li>
	<li>Marque la pata elegida e inyecte 20 ml de CFA en el espacio de la articulación del tobillo. Inyectar 20 s de suspensión en cuatro puntos periarticulares en la pata elegida (80 l en total).</li>
	<li>Retire los ratones de la unidad de respiración y coloque los ratones procesados en una nueva cámara. Supervise a los ratones para asegurarse de que respiran hasta que recuperen la capacidad de moverse.</li>
	<li>Cada 3 días, evalúe el diámetro de la articulación midiendo el diámetro de la articulación del tobillo utilizando un medidor de espesor de bolsillo(Figura 3A).</li>
	<li>Cada 3 días, evaluar la gravedad de la artritis por criterio de puntuación de la artritis(Figura 3C):0, normal, sin evidencia de eritema e hinchazón; 1, la artritis más leve, eritema e hinchazón leve confinado a los tarsals o la articulación del tobillo; 2, artritis moderada, eritema e hinchazón leve que se extiende desde el tobillo hasta los tarsallos; 3, artritis grave, eritema e hinchazón moderada que se extiende desde el tobillo hasta las articulaciones metatarsales; 4, la artritis más grave, eritema e hinchazón grave abarcan el tobillo, el pie y los dígitos, o anquilosis de la extremidad.</li>
</ol>5. Tinción inmunohistoquímica de secciones articulares
<ol><li>Aislamiento conjunto<ol>
<li>Sacrificar el ratón en la sección 4 usando dislocación cervical después de la anestesia con isoflurano. Rocíe el ratón con 70% de etanol.</li>
		<li>Retire la piel y parte del músculo de la pata trasera con pinzas y tijeras. Rocíe la articulación con 70% de etanol y retire el resto de los músculos con una toalla de papel.</li>
		<li>Fijar la articulación del tobillo en 4% paraformaldehído durante 2 días en RT. Descalcificar la articulación en 10% EDTA durante 1 mes en RT y cambiar el medio semanalmente.</li>
		<li>Incruste el tejido en parafina y prepare secciones de tejido de 4 m de espesor.<ol>
<li>Coloque el tejido en un molde marcado con cierto volumen de parafina líquida. Enfriar brevemente.</li>
			<li>Ajuste el espesor a 4 m y corte las rodajas en un microtome. Flotar secciones en un baño de agua a 43 oC.</li>
			<li>Montar las secciones en portaobjetos y poner los portaobjetos en el horno a 70 oC durante 2 h. Para su uso futuro, conserve las diapositivas a -20 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Safranina O y tinción verde rápida de secciones articulares NOTA: Los siguientes pasos de tinción se llevan a cabo en RT.<ol>
<li>Colocar los portaobjetos del paso 5.1.4.3 en un estante y realizar los siguientes lavados para rehidratar a RT: xileno durante 5 min (3x), 100% etanol para 2 min (2x), 95% etanol para 2 min (2x), 70% etanol para 2 min, y 50% etanol para 15 min.</li>
		<li>Mancha en 0.1% solución verde rápida durante 5 min. Enjuagar en ácido acético 1% durante 10 s.</li>
		<li>Mancha en 0,1% solución de tinción de safranina O durante 20 min. Sumergir los portaobjetos en los siguientes lavados: 95% etanol para 2 min (2x), 100% etanol para 2 min (2x), y xileno durante 2 min (2x).</li>
		<li>Monte las secciones de tejido y observe los tejidos bajo un microscopio. NOTA: Consulte las imágenes representativas en la Figura 4A.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción inmunohistoquímica para visualizar neutrófilos<ol>
<li>Hornee las secciones de parafina durante 2 h a 78 oC. Colocar los portaobjetos en un estante y realizar los siguientes lavados para rehidratar a RT: xileno durante 15 min (2x), 100% etanol para 5 min (2x), 95% etanol para 5 min, 80% etanol para 5 min, H2O para 3 min, y PBS durante 3 min. NOTA: No deje que las diapositivas se sequen en ningún momento durante este paso.</li>
		<li>Agregue una gota de tampón de permeabilización para cubrir el tejido. Incubar secciones en una bandeja controlada por humedad a 37oC.</li>
		<li>Enjuague los portaobjetos en PBS durante 3 min (3x). Evite enrredarse el tejido directamente.</li>
		<li>Realice la recuperación de epítopos de antígeno inducidos por calor utilizando una caldera de presión.<ol>
<li>Organizar diapositivas en un bastidor. Sumerja las diapositivas en la caldera de presión llena de búfer de recuperación.</li>
			<li>Ponga la caldera de presión en un horno microondas. Ajuste el horno microondas a 600 W y caliente los portaobjetos durante 10 minutos.</li>
			<li>Después de hervir, mantenga los portaobjetos en la caldera para enfriara a 90 oC. Saque las diapositivas y enjuáguelas en PBS durante 3 min (3x).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quench actividad endógena de peroxidasa en recién preparado 3% H2O2 a RT durante 15 min. Enjuagar diapositivas en PBS durante 3 min (3x).</li>
		<li>Delinee un círculo grande alrededor de la muestra con una pluma hidrófoba, evite tocar la muestra. Bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en una cámara controlada por humedad a 37 oC durante 60 min.</li>
		<li>Retire la solución de bloqueo. Añadir rápidamente 50 l de anticuerpo primario diluido en PBS a cada sección. A continuación, incubar los portaobjetos en una bandeja controlada por humedad a 4 oC durante la noche. NOTA: Se utilizan diferentes relaciones de dilución para diferentes anticuerpos (1:25 para MPO y 1:20 para NE).</li>
		<li>En el segundo día, saque la bandeja y déjela reposar en RT durante 30 minutos. A continuación, enjuague las diapositivas en PBS durante 3 min (3x).</li>
		<li>Añadir 50 l de anticuerpos secundarios diluidos en PBS al tejido. NOTA: Se aplicaron diferentes relaciones de dilución: 1:1.000 para MPO y 1:1.500 para NE.</li>
		<li>Incubar los portaobjetos en una bandeja controlada por humedad a 37oC durante 30 min. A continuación, enjuague las diapositivas en PBS durante 3 min (3x).</li>
		<li>Desarrollar en solución diluida de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) durante 5 min. Mantenga un ojo en la reacción en caso de desarrollo de un color oscuro. Enjuague los portaobjetos en agua destilada.</li>
		<li>Contratin los portaobjetos en hematoxilina durante 10 s. Enjuague los portaobjetos en agua del grifo durante 5 min.</li>
		<li>Enjuagar en alcohol ácido solución de diferenciación superrápida para 3 s. A continuación, enjuague en agua del grifo durante 10 minutos.</li>
		<li>Sumerja los portaobjetos en los siguientes lavados a RT: 80% etanol para 5 min, 95% etanol para 5 min, 100% etanol durante 5 min y xileno durante 15 min (2x). Fije la cubierta con solución de montaje. Observe el tejido bajo un microscopio. NOTA: Consulte las imágenes representativas en la Figura 4B.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los protocolos detallados de neutrófilos altamente purificados de sangre periférica7, médula ósea y tejidos18 han estado disponibles durante mucho tiempo. Aquí adoptamos un método de aislar a los neutrófilos del líquido peritoneal19 en el que los neutrófilos maduros permanecen inactivados para estudios antiinflamatorios y antioxidantes adicionales.
Usamos el experimento de la bolsa de aire para explorar la infiltración ind...

Los neutrófilos son los glóbulos blancos más abundantes y representan entre el 50 y el 70% de toda la población de glóbulos blancos en humanos1. Los neutrófilos son uno de los principales respondedores durante la inflamación aguda. Los neutrófilos pueden ser reclutados en sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas liberadas por células residentes entejidos 2,3,4, que está mediada por las interacciones entre las moléculas de adhesión celular en la superficie de los neutrófilos y las células de endotelio vascular5. Los neutrófilos son fundamentales para albergar defensa y desempeñar un papel en las reacciones inflamatorias patológicas debido a su poderosa capacidad para dañar el tejido a través de la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otras moléculas dañinas para el tejido3,6.
Estudios anteriores han descrito varios protocolos de aislamiento de neutrófilos de ratones o humanos. Oh y otros demostraron un método de separación de gradiente de densidad para aislar a los neutrófilos humanos de toda la sangre humana7. Sin embargo, el aislamiento de suficientes neutrófilos de la sangre del ratón es difícil debido al pequeño volumen sanguíneo. Alternativamente, un gran número de neutrófilos de ratón puros y viables pueden ser obtenidos del fluido peritoneal del ratón, y estos neutrófilos purificados se pueden utilizar ex vivo para examinar varios aspectos de las funciones celulares ex vivo, incluyendo la infiltración de neutrófilos, migración, quimiotaxis, ráfaga oxidativa, citoquina y trampa extracelular de neutrófilos (NET) producción8. Ensayos Transwell9 o ensayos de cámara Zigmond10,11 se pueden utilizar para evaluar la migración de neutrófilos in vitro. El modelo de bolsa de aire se utiliza para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos in vivo. El modelo de bolsa de aire subcutánea es un modelo animal in vivo conveniente para estudiar la migración de células inflamatorias.
Tradicionalmente, los neutrófilos eran considerados como eliminadores de patógenos en fases agudas de la inflamación. Sin embargo, los hallazgos recientes han demostrado que los neutrófilos son células complicadas que realizan una variedad significativa de funciones especializadas. Los neutrófilos pueden regular muchos procesos tales como lesión aguda y reparación, tumorigenesis, respuesta autoinmune, e inflamación crónica12,13. Los neutrófilos también modulan las respuestas inmunitarias adaptativas y pueden regular las células B y las células T14,15. La escasez sustancial de neutrófilos provoca mortalidad o inmunodeficiencia grave en humanos y el agotamiento de los neutrófilos en ratones conduce a la mortalidad, mientras que la activación o el reclutamiento excesivos de neutrófilos en los órganos provoca nifa tras las enfermedades inmunitarias, como la artritis reumatoide (AR) y el lupus eritematoso sistémico (LES)6. Los neutrófilos son las células más abundantes en el líquido sinovial de los pacientes con AR. Los neutrófilos producen cantidades excesivas de mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (NE) a través de la degradación, que exacerba la erosión del cartílago. LA MPO es una enzima peroxidasa expresada principalmente en los gránulos de los neutrófilos16. NE se asocia con la destrucción del cartílago articular17. MPO y NE podrían utilizarse para evaluar el estado de la migración de neutrófilos y la infiltración en el tejido de los pacientes con AR.
Este artículo proporciona tres métodos convencionales para evaluar la migración de neutrófilos normales inducidos in vivo e in vitro, así como la infiltración de neutrófilos patológicos en un modelo de inflamación específica de la articulación del ratón.

<table><tbody><tr><td>0,1% Solución Verde Rápida</td><td>Solarbio</td><td>8348b</td><td>Transfiera 20 mg de grene rápido FCF de un vial a otro vaso de precipitados de 100 ml. Añada 20 ml de H2O en el vaso de precipitados y disuelva la mancha agitándola para obtener una solución verde rápida al 0,1 %, y fíltrela con un filtro Nalgene PES de 75 mm</td></tr><tr><td>Solución de tinción de safranina O al 0,1 %</td><td>Solarbio</td><td>8348a</td><td>Transfiera 20 mg de tinción de safranina O en un vial a un vaso de precipitados de 100 ml. Añada 20 ml de H2O en el vaso de precipitados y disuelva la mancha agitándola para formar una solución de tinción de safranina O al 0,1 % y fíltrela con un filtro Nalgene PES de 75 mm</td></tr><tr><td>Solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 0,5 M, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>324506</td><td>estéril</td></tr><tr><td>100</td><td></td>% metanol Obras químicas <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de PekínTubo centrífugo cónico de polipropileno de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4" Aguja</td><td>BD</td><td>305120</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8" Aguja</td><td>BD</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>3% albúmina sérica bovina (BSA)</td><td></td><td></td><td>Disuelva 0,3 g BSA en 10 mL PBS</td></tr><tr><td>3% H2O2</td><td></td><td></td><td>Mezcle 1 mL 30% H2O2 con metanol con 9 mL de metanol</td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidina (DAB) KIT</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9018</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1/2" Aguja</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Jeringa</td><td>BD</td><td>Z683574</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo de centrífuga cónico de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>50% Mezcla de etanol</td><td></td><td></td><td>500 mL 100% etanol con 500 mL dH2O</td></tr><tr><td>54.8% Percoll</td><td></td><td></td><td>Mix 2.74 mL SIP con 2.26 mL 1&veces; PBS, stand still</td></tr><tr><td>70% Mezcla de etanol</td><td></td><td></td><td>700 mL 100% etanol con 300 mL dH2O</td></tr><tr><td>70.2% Percoll</td><td></td><td></td><td>Mix 3.51 mL SIP con 1.49 mL 1&veces; PBS, stand still</td></tr><tr><td>80% Mezcla de etanol</td><td></td><td></td><td>800 mL 100% etanol con 200 mL dH2O</td></tr><tr><td>95% Mezcla de etanol</td><td></td><td></td><td>950 mL 100% etanol con 50 mL dH2O</td></tr><tr><td>Alcohol ácido Solución de diferenciación ultrarrápida</td><td>Beyotime</td><td>C0165S</td><td></td></tr><tr><td>ANTICUERPOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo antimieloperoxidasa</td><td>Abcam</td><td>ab208670</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-elastasa de neutrófilos</td><td>Abcam</td><td>ab21595</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de Hematología</td><td>Automático Sysmex</td><td>XS-800i</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adyuvante de Freund completo, 10 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1002036152</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>CITOGLAS</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de espesor de esfera</td><td>Mitutoyo</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos Eppendorf, 1,5 mL</td><td>Sigma</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS) Premium</td><td>PAN</td><td>P30-1302</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia gaseosa</td><td>ZS Dichuang</td><td>ZS-MV-IV</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Conejo IgG H& L (HRP)</td><td>PPLYGEN</td><td>C1309</td><td>Este es el anticuerpo secundario utilizado en la tinción inmunohistoquímica.</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>Industrias biológicas, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-016-1A</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción de hematoxilina</td> estéril <td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9609</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacárido (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L3012</td><td></td></tr><tr><td>MEDIOS Y SUPLEMENTOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safranina modificada O-fast Green FCF Kit de tinción de cartílago</td><td>Solarbio</td><td>G1371</td><td></td></tr><tr><td>N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP)</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Solución de estreptomicina de penicilina, 100 veces;</td><td>Invitrogen</td><td>1514022</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>10245207</td><td>Medio de gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Mezcla tampón</td><td></td><td></td> de permeabilización <td>100 &mu; L Triton X-100 con 1 L dH2O para obtener 0.01% Triton X-100</td></tr><tr><td>Solución salina tampón de fosfato (PBS), 1&veces;</td><td></td><td></td><td>Mezcle 90% ddH2O con 10% (v/v) 10&veces; PBS,</td></tr> solución <tr><td>salina tampón de fosfato (PBS) esterilizada en autoclave, 10 veces;</td><td></td><td></td><td>Disuelva 16 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 2,88 g de Na2HPO4&middot; 2H2O, 0,48 g KH2PO4 (anhidro) en 200 mL ddH2O, ajuste de pH 7.4, esterilizado en autoclave</td></tr><tr><td>ARTÍCULOS Y EQUIPOS</td><td></td><td></td><td></td>DE PLÁSTICO</tr><tr><td>POLVO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptona</td><td>Oxoid</td><td>1865317</td><td></td></tr><tr><td>tampón</td><td></td><td></td> <td>de recuperaciónMezcle 18 mL de tampón de recuperación A con 82 mL de tampón de recuperación B, agregue dH2O a 1000 mL, ajuste el pH a 6.0</td></tr><tr><td>Tampón de recuperación A Stock para IHC</td><td></td><td></td><td>Disuelva 4.2 g de ácido cítrico (C6H5O7&middot; H2O) en 200 mL dH2O</td></tr><tr><td>Stock de tampón de recuperación B para IHQ</td><td></td><td></td><td>Disolver 5,88 g de citrato trisódico dihidratado (C6H5Na3O7&middot; 2H20) en 200 mL dH2O</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medio</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medio completo</td><td></td><td></td><td>El medio RPMI-1640 se complementa con un 10% de FBS y un 1% de penicilina/estreptomicina.</td></tr><tr><td>Shu Rui U40 Aguja de inyección de insulina estéril desechable 1 mL</td><td>BD</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos</td><td>CITOGLAS</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>SOLUCIÓN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td><td></td><td></td><td>Mezcle 90% (v/v) de percoll con 10% (v/v) 10 veces; PBS, quieto durante 20 minutos</td></tr><tr><td>Tampón de lavado en bolsa de aire Ensayo</td><td></td><td></td><td>diluido 0,5 M EDTA a 10 mM con HBSS</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detectar la migración y la infiltración de neutrófilos en ratones

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Los neutrófilos son un miembro importante del sistema inmunitario innato y desempeñan un papel fundamental en la defensa del huésped contra patógenos y reacciones inflamatorias patológicas. Los neutrófilos pueden ser reclutados a sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas. La infiltración abrumadora de neutrófilos puede provocar daño indiscriminado a los tejidos, como en la artritis reumatoide (AR). Neutrófilos aislados del exudado peritoneal responden a un quimioatraer definido, N-formilo-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro en los ensayos de cámara Transwell o Zigmond. El experimento de la bolsa de aire se puede utilizar para evaluar la quimiotaxis de los neutrófilos hacia el lipopolisacárido (LPS) in vivo. El modelo de ratón de artritis inducida por adyuvantes (AA) se utiliza con frecuencia en la investigación de RA, y la tinción inmunohistoquímica de secciones articulares con anticuerpos antimieloperoxidasa (MPO) o antineutrófilos elastasa (NE) es un método bien establecido para medir infiltración de neutrófilos. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.

Las células de exudado peritoneal se recogieron del líquido de lavado de ratones. Las células se resuspendieron en 1 ml de medio completo RPMI-1640, en capas en dos pasos (54,8%/70,2%) gradiente de densidad discontinua(Figura 1A) y centrifugado a 1.500 x g para 30 min. Los neutrófilos (95%, 1 x 107 neutrófilos/ratón) se recuperaron de la interfaz inferior(Figura 1B).
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Aquí, presentamos tres métodos para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos tanto in vivo como in vitro. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.

Detectar la migración y la infiltración de neutrófilos en ratones

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Este método trata de describir tres métodos utilizados con frecuencia para evaluar la migración de neutrófilos normales in vivo e in vitro, así como la infiltración de neutrófilos patológicos en el modelo de artritis del ratón. Creemos que este método podría ser útil para otros investigadores en este campo. Este protocolo contiene los detalles metodológicos para evaluar la capacidad de migración de los neutrófilos en los sitios de inflamación mediante el uso de ensayo de bolsa de aire y artritis inducida por adyuvante.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de artritis comparando el grupo modelo con el grupo de tratamiento. Este método podría proporcionar información sobre la enfermedad inflamatoria y se puede aplicar a la enfermedad inflamatoria intestinal. Demostrando el procedimiento serán Qingyi Lu y Haixu Jiang, estudiantes de posgrado de nuestro laboratorio.Después de la anestesia de los ratones en el día cero, utilice un filtro de 0,22 micras unido a una jeringa de cinco mililitros para obtener un volumen de tres mililitros de aire esterilizado. Levante la piel posterior del ratón anestesiado con pinzas y utilice por vía subcutánea una aguja de calibr

detecting-migration-and-infiltration-of-neutrophils-in-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe una manera no invasiva de dos fotones (2P), microscopía de enfoque para el estudio de leucocitos de recalada en la almohadilla plantar del ratón. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes de tejidos y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Este video muestra imágenes in vivo para estudiar la dinámica de reclutamiento de neutrófilos en un sitio de infección en un ratón transgénico inmunocomprometido con neutrófilos que expresan GFP. Consiste en inyectar bacterias luminiscentes para causar una infección. Esto conduce al reclutamiento de neutrófilos al sitio de la infección, cuyo seguimiento se realiza mediante imágenes.

Monitorización de la dinámica de reclutamiento de neutrófilos y la carga bacteriana en el lugar de la infección en un modelo murino

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

La migración transepitelial del neutrófilo en respuesta a la infección bacteriana de la mucosa contribuye a lesión epitelial y a la enfermedad clínica. Se ha desarrollado un modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos y capas polarizadas de células epiteliales humanas cultivadas en filtros transwell para facilitar las investigaciones hacia el desentrañamiento de los mecanismos moleculares que orquestan este fenómeno.

In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

Hemos desarrollado un modelo in vitro que imita un componente importante de la respuesta inflamatoria aguda durante la infección de la vejiga con Escherichia coli uropatógena. El ensayo de migración de neutrófilos transuroepithelial permite la evaluación cuantitativa de la migración de neutrófilos humanos a través de los epitelios de la vejiga, se cultivaron en soportes permeables, en respuesta a la infección bacteriana o sustancias quimioatrayentes.

Evaluación cuantitativa de neutrófilo humano migración a través de una vejiga cultivada Epitelio

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Este protocolo actual emplea reporteros fluorescentes, marcaje in vivo y técnicas de imagen intravital para permitir el monitoreo del proceso dinámico de cebado de neutrófilos en animales vivos.

Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed

Aquí, presentamos un protocolo para detectar la presencia de neutrófilos en las secciones fijas/permeabilized histología y evaluar el estado de activación de los neutrófilos purificados vivo. En particular, el péptido de40 MUB ATA lactoferrina presente en gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. Exposición de los contenidos del gránulo a través de permeabilización o neutrófila activación permite el marcado de los neutrófilos.

El péptido de40 de MUB para uso en la detección de eventos de la inflamación mediada por neutrófilos

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

La migración de neutrófilos se basa en la remodelación rápida y continua de la membrana plasmática en respuesta al quimioatrayente y sus interacciones con el microambiente extracelular. En este trabajo se describe un procedimiento basado en Microscopía Subcelular Intravital para investigar la dinámica de la remodelación de la membrana en neutrófilos inyectados en el oído de ratones anestesiados.

Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

Aprende a evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos en modelos de artritis en ratones mediante el ensayo de bolsa de aire y análisis hematológico automatizado. Estos métodos permiten estudiar la dinámica de neutrófilos en enfermedades inflamatorias.

Detectar la migración y la infiltración de neutrófilos en ratones

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