Name: Microarrays de biopartículas para el análisis quimiotáctico y molecular del enjambre de neutrófilos humanos in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Aprende a generar microarrays de biopartículas para analizar el enjambre de neutrófilos humanos in vitro mediante imagen cuantitativa. Este protocolo permite acceder a citocinas y mediadores lipídicos secretados.

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Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento William G. Lowrie de Ingeniería Química y Biomolecular y el Centro Integral del Cáncer de la Universidad Estatal de Ohio. Los datos presentados en este informe provienen de imágenes procesadas con Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) disponibles en el Centro de Microscopía e Imagen del Campus, La Universidad Estatal de Ohio. Esta instalación es apoyada en parte por la subvención P30 CA016058, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD.

Los autores reconocen a los voluntarios sanos que amablemente donaron su sangre. Los especímenes de sangre se obtuvieron después del consentimiento informado de los voluntarios de acuerdo con el protocolo de la Junta de Revisión Institucional (IRB) #2018H0268 revisado por el Comité de Ciencias Biomédicas de la Universidad Estatal de Ohio.
1. Microfabricación de microarray de biopartículas
<ol><li>Usando procedimientos de fotolitografía estándar, genere la oblea de silicio maestra.<ol>
<li>Genere una prueba del diseño deseado utilizando un software de diseño asistido por ordenador (CAD) y, a continuación, envíelo a un fabricante de fotomáscaras para producir una fotomáscara cromada. El diseño utilizado aquí es de 4 mm x 4 mm de matrices rectangulares de 30 mm de diámetro rellenadas en círculos con un espaciado de centro a centro de 150 m. Este diseño se puede modificar como se desee para diferentes aplicaciones.</li>
		<li>Espírese una capa de 40 m de espesor de un fotorresistente negativo sobre una oblea de silicio. Hornee la oblea a 65oC durante 5 min y 95oC durante 10 min.</li>
		<li>Exponga la oblea a la luz UV a través de una fotomascarilla cromada con 150–160 mJ/cm2 (Figura 1A).</li>
		<li>Hornee la oblea a 65oC durante 5 min y 95oC durante 10 min. Sumergir la oblea en el desarrollador fotorresistente durante 10 min y enjuagar con alcohol isopropílico. En esta etapa, el patrón debe ser visible en la oblea(Figura 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Mezclar a fondo una proporción de 10:1 de prepolímero de polidimetilsiloxano y su agente de curado (es decir, 20 g de prepolímero y 2 g de agente de curado) y verter la mezcla de polidimetilsiloxano no curado (PDMS) sobre la oblea maestra en una placa Petri(Figura 1C).</li>
	<li>Trate al vacío la mezcla PDMS no curada hasta que no haya burbujas de aire presentes sobre la oblea maestra. Curar a 65oC durante la noche.</li>
	<li>Utilice un bisturí para cortar alrededor del exterior de la sección estampada de la oblea y retire lentamente la losa PDMS curada. Coloque la losa PDMS en una tabla de corte limpia con el lado estampado hacia arriba(Figura 1D).</li>
	<li>Repartir sellos individuales de la losa PDMS con un punzón de biopsia de 8 mm(Figura 1E). Para un portaobjetos de vidrio, se necesitarán ocho sellos.</li>
	<li>Coloque cada sello boca abajo en la cinta adhesiva para eliminar los restos.</li>
	<li>De antemano, prepare una solución de 1,6 mg/ml de CP en agua.<ol>
<li>Añadir la cantidad adecuada de polvo de CP al agua (por ejemplo, 0,8 g a 500 ml).</li>
		<li>Mezclar en una placa de agitación a temperatura ambiente durante la noche, o hasta que todo el sólido se disuelva en el agua. La solución de CP se puede almacenar a temperatura ambiente durante 6 meses.</li>
		<li>Si se desea, hacer la solución de CP fluorescente mediante la adición de poli-L-lisina etiquetado con isotiocianato de fluoresceína (PLL-FITC).<ol>
<li>Aliquot a unos 10 ml de la solución CP. Añadir una pequeña cantidad de PLL-FITC (0,05 mg) al volumen alícundo. La cantidad se puede modificar para ajustar el brillo de la fluorescencia como se desee.</li>
			<li>Vortex la solución CP etiquetada con FITC para 20 s, o hasta que la solución sea de un color amarillo pálido uniforme. Proteger de la luz y almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Con los sellos boca arriba, prepara cada sello con 100 l de solución de 1,6 mg/ml de CP, asegurando que no se formen burbujas de aire entre la solución CP y el sello(Figura 1F).</li>
	<li>Invierta los sellos en una capa de solución CP(Figura 1G).</li>
	<li>Retire los sellos de la solución CP después de 1 h.</li>
	<li>Atraviese cada sello húmedo boca abajo sobre un portaobjetos de vidrio limpio de 6 a 8 veces para eliminar el exceso de líquido.</li>
	<li>Tratar al vacío los sellos durante 1-2 min.</li>
	<li>Adherir un espaciador de imágenes de ocho pozos y 9 mm de diámetro en la parte superior de una corredera de vidrio limpio como guía para la colocación de sellos. Con este espaciador, cada diapositiva de vidrio puede tener ocho microarrays.</li>
	<li>Coloque un sello boca abajo en la diapositiva de vidrio en el centro de cada pocal del espaciador de imágenes (es decir, utilice ocho sellos en total).</li>
	<li>Coloque un peso equilibrado de 5,6 x 0,1 g encima de cada sello y permita 10 minutos para el estampado(Figura 1H). Se requiere un peso equilibrado para asegurar que el sello se presiona uniformemente sobre el portaobjetos de vidrio y promover la transferencia uniforme del CP a la diapositiva de vidrio.</li>
	<li>Retire los pesos y sellos de la diapositiva de vidrio(Figura 1I). Deje que la capa CP se seque a temperatura ambiente durante 24 horas antes de añadir las biopartículas, como se describe en el paso 1.17. Si el CP está etiquetado con FITC, la eficacia del estampado se puede comprobar en este punto con un microscopio fluorescente a 488 nm antes de continuar con el paso 1.17(Figura 1M).</li>
	<li>Corte una losa PDMS en blanco al tamaño del espaciador de imágenes y utilice el punzón de biopsia de 8 mm para crear pozos en PDMS que se alineen con los pozos de un espaciador de imágenes. Adherir la losa PDMS a la diapositiva de vidrio con el espaciador de imágenes(Figura 1J).</li>
	<li>Descongelar una solución de biopartículas (p. ej., E. coli o zymosan) y diluir a 500 g/ml en agua para inyección (WFI). NOTA: No es necesario opsonizar las biopartículas. Los receptores de superficie de neutrófilos reconocen directamente moléculas en estas biopartículas19,20,21.</li>
	<li>Añadir 100 l de solución de biopartículas a cada pozo PDMS en la diapositiva de vidrio(Figura 1K).</li>
	<li>Mece el tobogán de cristal durante 30 min.</li>
	<li>Enjuague bien los pozos con agua. El microarray de biopartículas se puede almacenar en un ambiente libre de polvo a 4 oC durante un máximo de 3 meses. En este punto, el patrón debe comprobarse con un microscopio fluorescente a 594 nm antes de proceder al paso 2.1(Figura 1N).</li>
</ol>2. Preparación de muestras
<ol><li>Recoger al menos 2 ml de sangre fresca en tubos K2-EDTA del donante deseado. El rendimiento esperado de los neutrófilos es de 1–2 x 106 células/1 ml de sangre entera. El ensayo de imágenes requiere aproximadamente 1,5 x 105 neutrófilos, y el análisis del sobrenadante requiere 1 x 106 neutrófilos. Use la sangre dentro de las 4 h.</li>
	<li>Separe los glóbulos rojos (RBR) añadiendo un agente de agregación de eritrocitos en una proporción de 1:5 a toda la sangre. Espere 45 minutos para que una capa translúcida (capa de color) se separe de la capa de RBR.</li>
	<li>Retire la capa buffy y lávela con solución salina tamponada de fosfato (PBS) usando una capa buffy de 1 ml: 9 mL PBS.</li>
	<li>Centrífuga durante 5 min a 190 x g y 20oC.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet a 5 x 107 células/ml.</li>
	<li>Utilice un kit de selección inmunomagnética negativo para aislar a los neutrófilos.<ol>
<li>Añadir 50 l de cóctel de anticuerpos/1 ml de suspensión celular. Espere 10 minutos.</li>
		<li>Añadir 100 l de perlas magnéticas/1 ml de suspensión celular. Espere 10 minutos.</li>
		<li>Agregue la suspensión de la celda a un tubo de fondo redondo y colóquelo en un imán cilíndrico. Espere 10 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vierta el sobrenadante en un tubo centrífugo. Agregue hasta 10 mL de PBS. Centrífuga durante 5 min a 190 x g y 20oC.</li>
	<li>Aspirar sobrenadante. Resuspenda el pellet blanco en la IMDM con albúmina sérica humana al 0,4%.</li>
	<li>Núcleos de manchas con 20 g/ml Hoechst 33342 durante 10 min a 37 oC.</li>
	<li>Añadir 5 ml de IMDM con 0,4% de albúmina sérica humana para enjuagar. Centrífuga durante 5 min a 190 x g y 20oC.</li>
	<li>Resuspender células a 7,5 x 105 células/ml en IMDM con 0,4% de albúmina sérica humana.</li>
	<li>Añadir 100 l de la suspensión celular a un pozo PDMS que contenga un microarray de biopartículas. Asegúrese de que la suspensión de la celda es convexa sobre la parte superior del pozo PDMS y no contiene ninguna burbuja.</li>
	<li>Cierre con un cubreobjetos de 12 mm de diámetro. Cubra bien la abertura del PDMS con un cubreobjetos de 12 mm de diámetro. Presione suavemente sobre la cubierta con pinzas para que el exceso de suspensión celular escape al borde del pozo. Use un pañuelo para eliminar el exceso de suspensión celular.</li>
</ol>3. Ejecución del ensayo y el análisis de imágenes
<ol><li>Cargue la matriz de micropartículas con células en la estación de imágenes de células vivas con un microscopio equipado con una incubadora de jaulas establecida en 37 oC, 5% CO2y 90% de humedad relativa.</li>
	<li>Utilice la microscopía fluorescente y de campo brillante para grabar imágenes a un aumento de 10x cada 10 s a 405 nm, 594 nm y campo brillante. En un experimento típico, las imágenes se recogen hasta 2 h.</li>
	<li>Utilice un software automatizado de seguimiento celular para realizar un seguimiento de la migración de neutrófilos individuales hacia el clúster de biopartículas.<ol>
<li>Utilice el modo de regresión automática de un software de seguimiento de celdas de detección de puntos. Establezca el radio de la mancha en 5 m (el tamaño aproximado de un núcleo de neutrófilos). Establezca la longitud mínima de la pista en 120 s y un tamaño de separación máximo de un fotograma.</li>
		<li>A partir de los datos generados por el software de seguimiento de la célula, extraer los archivos que contienen la posición y la velocidad de los neutrófilos. Estos archivos se pueden utilizar con un software de gráficos para generar pistas de migración de neutrófilos (Figura 2C) y un mapa de calor de la velocidad frente al tiempo (Figura 2D), respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice las imágenes fluorescentes de 405 nm para realizar un seguimiento del tamaño del enjambre a lo largo del tiempo en un software de análisis de imágenes de su elección.<ol>
<li>Definir regiones de interés (ROI) alrededor de cada grupo de biopartículas donde los neutrófilos se enjambre. Mantenga el mismo tamaño de ROI para analizar cada clúster de biopartículas.</li>
		<li>Analice la intensidad fluorescente media de las imágenes de 405 nm dentro de cada ROI a lo largo del tiempo.</li>
		<li>Genere una curva de calibración de la intensidad fluorescente media para el tamaño del enjambre tomando medidas manuales en varios tamaños de enjambre desde 0 m2 hasta el tamaño máximo del enjambre. Utilice esta calibración para calcular el tamaño del enjambre a lo largo del tiempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Recolección de supernadantes y detección de proteínas
<ol><li>Incubar los neutrófilos en los polos que contienen el microarray de biopartículas a 37oC y 5%co2 durante 3 h. Tome muestras en los puntos de tiempo deseados. Normalmente, las muestras se tomarán a 0, 0,5, 1 y 3 h. Para superar el límite de detección del ensayo de matriz de proteínas, se utilizó todo el volumen de sobrenadante de un solo pozo (200 l) para cada punto de tiempo. Cada punto de tiempo fue analizado por triplicado.</li>
	<li>Usando un microscopio de campo brillante, verifique que se formen enjambres en el microarray.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante con una pipeta de 200 ml y cargar en un tubo de filtro de centrífuga de 0,45 m.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 190 x g y 20 oC durante 5 min y recoger el volumen filtrado.</li>
	<li>Almacene las muestras a -80 oC hasta el tiempo de procesamiento.</li>
	<li>Utilice un kit de microarray que detecte una gama de proteínas humanas para procesar muestras.<ol>
<li>Agregue 200 ml de cada muestra a un tubo de diálisis separado suministrado con el kit.</li>
		<li>Coloque los tubos de diálisis en un vaso de precipitados que contenga al menos 500 ml de PBS (pH a 8,0). Revuelva suavemente sobre una placa de agitación durante al menos 3 h a 4 oC. Cambie el PBS en el vaso de precipitados y repita este paso.</li>
		<li>Transfiera cada muestra a un tubo de centrífuga limpio y centrífuga a 9.000 x g durante 5 min para eliminar los precipitados. Transfiera cada sobrenadante a un tubo limpio.</li>
		<li>Biotinylacada cada muestra añadiendo 36 l de reactivo de etiquetado 1x del kit por cada 1 mg de proteína total en la muestra dializada a 180 ml de muestra dializada. Incubar a 20oC durante 30 min. Mezclar suavemente cada 5 min.</li>
		<li>Añadir 3 ml de solución de tope provista sin el kit en cada tubo de muestra. Transfiera cada muestra a un tubo de diálisis nuevo y repita los pasos 4.6.2–4.6.3. En esta etapa, la muestra se puede almacenar a -20 oC o -80 oC hasta que esté listo para continuar.</li>
		<li>El portaobjetos de vidrio suministrado con el kit se almacena a -20 oC. Deje que llegue a temperatura ambiente. Coloque el portaobjetos de vidrio montado en una campana de flujo laminar durante 1-2 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir 400 l del tampón de bloqueo suministrado con el kit en cada poca del tobogán de vidrio montado. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Centrifugar las muestras preparadas durante 5 min a 9.000 x g para eliminar precipitados o partículas. Diluir 5x con tampón de bloqueo.</li>
		<li>Retire el búfer de bloqueo de cada poca. Añadir 400 l de las muestras diluidas en los pozos apropiados. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente mientras se balancea.</li>
		<li>Decantar las muestras de cada pozo. Lavar 3x con 800 sl del tampón de lavado 1x que proporcioné con el kit a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno mientras mece.</li>
		<li>En un recipiente limpio, sumerja el portaobjetos de vidrio montado en 1x tampón de lavado I. Lavar 2x a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno mientras se balancea.</li>
		<li>Agregue 400 s l de 1 x estreptavidina conjugada con Cy3 a cada submatriz. Cubierta con tiras adhesivas de plástico. Proteger de la luz para el resto del protocolo.</li>
		<li>Incubar durante 2 h a temperatura ambiente mientras se balancea.</li>
		<li>Decantar la solución y desmontar la corredera de vidrio de las cámaras de muestra.</li>
		<li>En el tubo centrífugo de 30 ml suministrado con el kit, agregue cuidadosamente el portaobjetos de vidrio y suficiente tampón de lavado 1x I para cubrir el portaobjetos de vidrio. Lavar 3 x durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras se balancea.</li>
		<li>En el tubo centrífugo de 30 ml, lave 2x con 1x tampón de lavado II durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras se balancea.</li>
		<li>Lavar el portaobjetos de vidrio con 30 ml de ddH2O durante 5 min. Retire el portaobjetos de vidrio del tubo de centrífuga y deje secar durante 20 minutos en una campana de flujo laminar. El portaobjetos de vidrio preparado puede almacenarse a -20 oC hasta que esté listo para escanear.</li>
		<li>Escanee el portaobjetos de vidrio con un escáner de microarray a una emisión de fluorescencia de 555 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li>
<li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li>
<li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li>
<li>Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3%3A+An+open-ended+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li>
<li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflictos de intereses.

Desarrollamos una plataforma de microsello para generar matrices uniformes de biopartículas para estimular el enjambre de neutrófilos in vitro. La naturaleza in vitro de nuestra plataforma nos permite eludir las complicaciones que surgen con los experimentos in vivo enjambre, a saber, la mala capacidad para analizar los mediadores liberados por los neutrófilos enjambres5. Además, los modelos in vivo se realizan típicamente en roedores11,12,</sup...

Los neutrófilos, el glóbulo blanco más abundante en el torrente sanguíneo1, están ganando atención como posibles dianas diagnósticas y terapéuticas2,3 porque pueden estar involucrados en una variedad de condiciones médicas incluyendo gota4, sepsis3, trauma5,6, cáncer1,7,8, y diversas enfermedades autoinmunes5,9. El enjambre de neutrófilos es un proceso multietapa, estrechamenteregulado con una complejidad que lo convierte en un foco particularmente interesante de estudio5,10,11. Durante el enjambre, los neutrófilos aíslan un sitio de inflamación del tejido sano circundante5,10,11. La regulación adecuada del enjambre de neutrófilos es esencial para promover la cicatrización de heridas y, en última instancia, la resolución de inflamación5,12. El enjambre de neutrófilos se ha estudiado principalmente in vivo en roedores12,13,14,15 y pez cebra10,11,12,15 modelos. Sin embargo, la naturaleza de estos modelos animales in vivo da lugar a limitaciones5. Por ejemplo, los mediadores liberados por neutrófilos durante el enjambre no son fácilmente accesibles para el análisis5. Además, hay muchas fuentes potenciales para un mediador dado in vivo, por lo que un experimento in vivo debe introducir una deficiencia genética para inhibir la producción celular y / o la interacción con el fin de investigar el papel de ese mediador en un proceso dado13. Un experimento in vitro elude esta complicación al permitir la observación de neutrófilos sin el contexto de células adicionales. Además, la investigación que describe la migración coordinada por neutrófilos humanos es limitada16. En una plataforma de enjambre in vitro, los neutrófilos humanos pueden ser analizados directamente. Una plataforma de enjambre in vitro podría ampliar los conocimientos adquiridos a partir de estudios in vivo proporcionando oportunidades para llenar las lagunas que dejan las limitaciones de los estudios in vivo.
Para hacer frente a la necesidad de una plataforma in vitro que imita el enjambre de neutrófilos in vivo, desarrollamos una plataforma de microsello que nos permite patrones de microarrays de biopartículas que estimulan el enjambre de neutrófilos de una manera controlada espacialmente. Generamos microarrays de biopartículas en portaobjetos de vidrio en un proceso de dos pasos. En primer lugar, utilizamos microestampado para generar un microarray de puntos de polielectrolito catiónico (CP). En segundo lugar, añadimos una solución de biopartículas que se adhieren a los puntos CP a través de la interacción electrostática. Al crear primero el patrón de la capa CP, podemos patrón selectivo de biopartículas cargadas negativamente para generar el patrón de enjambre de neutrófilos deseado. La capa cargada positivamente contiene las biopartículas cargadas negativamente a través del vigoroso paso de lavado que elimina las biopartículas de las áreas en el tobogán de vidrio que no tienen el CP. Tiene una carga superficial muy alta que inmoviliza las biopartículas del tamaño de un micron al portaobjetos de vidrio, inhibiendo así a los neutrófilos de eliminar las partículas de la posición patrón en el portaobjetos de vidrio. Esto da como resultado racimos de biopartículas dispuestos en un microarray. Cuando añadimos neutrófilos al microarray, formaron enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. A través del seguimiento de la migración de neutrófilos, descubrimos que los neutrófilos enjambres migran activamente hacia los cúmulos de biopartículas. Además, utilizamos esta plataforma para analizar ciertos mediadores que los neutrófilos liberan durante el enjambre. Encontramos 16 mediadores que se expresan diferencialmente durante el enjambre. Sus concentraciones siguen tres tendencias generales a lo largo del tiempo: aumento, disminución o pico. Nuestra plataforma de enjambre de neutrófilos in vitro facilita el análisis del enjambre de neutrófilos humanos controlado espacialmente, así como la recopilación y análisis de mediadores liberados por enjambre de neutrófilos. En una publicación anterior, demostramos que los pacientes con ciertas condiciones médicas (trauma, enfermedad autoinmune y sepsis), tenían neutrófilos que funcionaban de manera diferente a los de los donantes sanos5. En futuros estudios de investigación, nuestra plataforma podría utilizarse para analizar la función de neutrófilos entre una variedad de poblaciones de pacientes. Esta plataforma puede analizar cuantitativamente la compleja coordinación involucrada en el enjambre de neutrófilos. Se pueden realizar estudios adicionales para proporcionar información sobre la función neutrófila de una población de pacientes específica o la respuesta de neutrófilos a un patógeno de interés.

<table><tbody><tr><td>"The Big Easy" EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18001</td><td>Imán para usar con el kit de aislamiento de neutrófilos</td></tr><tr><td>Incubadora de células</td><td>Okolab</td><td>777057437 / 77057343</td><td>Incubadora de jaula Okolab para control de temperatura y CO2</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de neutrófilos humanos EasySep STEMCELL Technologies</td><td></td><td>17957</td><td>Kit para la selección inmunomagnética negativa de neutrófilos humanos</td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA54010 / MEF55037</td><td>Microscopio de investigación invertido</td></tr><tr><td>Escherichia coli (cepa K-12) BioParticles Texas Red conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Biopartícula en polvo, se disuelve en agua antes de añadirlo a la matriz Zetag&reg;</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core Punzón de biopsia de 8 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z708925</td><td>Para cortar sellos PDMS</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7906</td><td>Agente de agregación de eritrocitos para separar la capa leucocitaria de los glóbulos rojos en la sangre humana fresca</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Tinción fluorescente</td></tr><tr><td>de núcleo humano L1000 Array</td><td>Raybiotech Inc.</td><td>AAH-BLG-1000-4 Matriz de</td><td>alta densidad para detectar 1000 proteínas humanas</td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana (HSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5843</td><td>HSA de baja endotoxina, para preparar soluciones al 2 % en IMDM para neutrófilos aislados</td></tr><tr><td>Medio de Dulbeccos modificado de Iscove (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td>Para resuspender tubos de K2-EDTA de neutrófilos aislados</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-657-32</td><td>Tubos para la extracción de sangre</td></tr><tr><td>Fotomascarilla de cromo de baja reflexión</td><td>Fotomáscara de gama frontal</td><td>N/A</td><td>Dimensiones: 5" x 5" x 0,09" (largo x ancho x profundidad)</td></tr> <tr><td>Escáner de microarrays</td><td>Perkin Elmer</td><td>ASCNGX00</td><td>Lector de fluorescencia de microdominios con patrones de proteínas</td></tr><tr><td>Microscopía Imagen Analsysis Software - Imaris</td><td>Bitplane</td><td>9.3.0</td><td>Software para el análisis</td></tr> <tr><td>automático de seguimiento de célulasPaquete de software de investigación avanzada NiS Elements</td> Software <td>de MQS31100</td><td>de Nikon Instruments</td><td>para la obtención automática de imágenes de células vivas y el cálculo del tamaño del enjambre</td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína de poli-L-lisina (PLL-FITC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3069-10MG</td><td>30.000 - 70.000 MW PLL marcado con FITC, utilizado para etiquetar con fluorescencia la solución CP</td></tr><tr><td>SecureSeal Espaciador de imágenes de 8 pocillos</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>8 pocillos, 9 mm de diámetro, espaciador de imagen adhesivo</td></tr><tr><td>Silicon</td><td>Wafer University Wafer</td><td>590</td><td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &mu; m SSP test</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Laurell</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td>Se utiliza para hilar un 40-&micro; m capa de fotorresistencia sobre oblea de silicio</td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td>2025</td><td>Fotorreresistencia negativa para hacer oblea maestra de silicio</td></tr><tr><td>Revelador SU-8</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>revelador fotorresistente. Retire el SU-8 2025 no reticulado de la oblea de silicio</td></tr><tr><td>Sylgard 184 (polidimetilsiloxano, PDMS)</td><td>Dow</td><td>1673921</td><td>kit de elastómero de silicona de 2 partes para la fabricación de microsellos y pozos de PDMS</td></tr><tr><td>Sistema de enmascaramiento de exposición UV</td><td>Klo&eacute;</td><td>UV-KUB 2</td><td>Se utiliza para reticular la fotorresistencia en una oblea de silicio a través de una máscara de cromo con luz ultravioleta</td></tr><tr><td></td><td>Agua Thermo Fisher Scientific</td><td>A1287303</td><td>Agua de alta calidad para diluir biopartículas</td></tr><tr><td>Zetag 8185</td><td>BASF</td><td>8185</td><td>Polielectrolito catiónico (CP), polvo, copolímero de acrilamida y monómero catiónico cuaternizado, forma una "solución de entintado" para microestampado cuando se disuelve en agua</td></tr><tr><td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>Biopartícula en polvo, se disuelve en agua antes de agregarlo a la matriz Zetag</td></tr></tbody></table>

microarrays de biopartículas para el análisis quimiotáctico y molecular del enjambre de neutrófilos humanos in vitro

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

El enjambre de neutrófilos es un proceso cooperativo por el cual los neutrófilos cierran un sitio de infección y promueven la reorganización de los tejidos. El enjambre se ha estudiado clásicamente in vivo en modelos animales que muestran patrones característicos de migración celular. Sin embargo, los modelos in vivo tienen varias limitaciones, incluyendo mediadores intercelulares que son difíciles de acceder y analizar, así como la incapacidad de analizar directamente a los neutrófilos humanos. Debido a estas limitaciones, es necesario una plataforma in vitro que estudia el enjambre de neutrófilos humanos y proporcione un fácil acceso a las señales moleculares generadas durante el enjambre. Aquí, un proceso de microsello de varios pasos se utiliza para generar un microarray de biopartículas que estimula el enjambre imitando una infección in vivo. El microarray de biopartículas induce a los neutrófilos a enjambre de una manera controlada y estable. En el microarray, los neutrófilos aumentan en velocidad y forman enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. Además, se analizó el sobrenadante generado por los neutrófilos y se descubrió que 16 proteínas se expresaron diferencialmente en el transcurso del enjambre. Esta plataforma de enjambre in vitro facilita el análisis directo de la migración de neutrófilos y la liberación de proteínas de una manera reproducible y controlada espacialmente.

Cuando se añaden neutrófilos al microarray de biopartículas, los neutrófilos que contactan con los cúmulos de biopartículas se activan e inician la respuesta de enjambre. El microarray de biopartículas fue validado mediante microscopía fluorescente de lapso de tiempo para rastrear la migración de neutrófilos hacia los cúmulos de biopartículas (Video S1). La migración de núcleos de neutrófilos individuales se realiza un seguimiento a medida que migran hacia el cúmulo de biopartículas. Cuando los neutrófil...

Este protocolo genera microarrays de biopartículas que proporcionan enjambre de neutrófilos controlado espacialmente. Proporciona un fácil acceso a los mediadores que los neutrófilos liberan durante la migración y permite el análisis cuantitativo de imágenes.

Microarrays de biopartículas para el análisis quimiotáctico y molecular del enjambre de neutrófilos humanos in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Este protocolo es significativo porque permite un análisis in vitro del enjambre de neutrófilos, que supera muchas limitaciones de nuestra incapacidad actual para experimentar. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un fácil acceso a las citoquinas y mediadores de lípidos secretados que los neutrófilos liberan durante el enjambre y permite el análisis cuantitativo de imágenes. Si bien aplicamos esta técnica a los neutrófilos, podría extenderse para analizar la migración de otros glóbulos blancos como monocitos y linfocitos T.Comience preparando una polielectrolita catiónica de 1,6 miligramos por mililitro, o solución de CP, añadiendo la cantidad adecuada de polvo de CP al agua y mezclándolo en la placa de agitación durante la noche o hasta que todos los sólidos se disuelvan. Si lo desea, la solución se puede hacer fluorescente mediante la adición de poli-L-lisina etiquetada con FITC. Genere la oblea de silicio maestro utilizando procedimientos de fotolitografía estándar.El diseño utilizado aquí es una matriz rectangular de cuatro por cuatro mililitros de círculos rellenos de 30 micrómetros de diámetro, con un centro de 150 micrómetros para el espaciado central, pero se puede modificar como se desee para diferentes aplicaciones. Recubrir una capa de 40 micrómetros de espesor de fotorresistente negativo en una oblea de silicio. Luego hornea la oblea a 65 grados Centígrados durante cinco minutos.Y 95 grados Celsius durante 10 minutos. Exponga la oblea a la luz UV a través de una fotomasca cromada con 150 a 160 mililitros por centímetro cuadrado. Hornee la oblea de nuevo a 65 grados Centígrados durante cinco minutos y 95 grados centígrados durante 10 minutos.A continuación, sumergirlo en el desarrollador de fotorresistsión durante 10 minutos. Y enjuáguelo con alcohol isopropílico. El patrón ahora debe ser visible en la oblea.A continuación, mezcle a fondo una proporción de 10 a una proporción de polidimetilsiloxano, o PDMS, prepolímero y su agente de curado. Y vierta la mezcla no curada sobre la oblea maestra en un plato de Petri. El vacío trata la mezcla DE PDMS no curada hasta que no haya burbujas de aire presentes.Luego cure durante la noche a 65 grados centígrados. Al día siguiente, usa un bisturí para cortar alrededor del exterior de la sección con patrón de la oblea. Y retire lentamente la losa de PDMS curada, colocándola en una tabla de corte limpia con el lado estampado hacia arriba.Golpee los sellos individuales de la losa PDMS con un punzón de biopsia de ocho milímetros y coloque cada sello boca abajo en la cinta adhesiva para eliminar los desechos. Con estos sellos mirando hacia arriba, ceba cada sello con 100 microlitros de la solución CP pre-preparada, asegurando que no se formen burbujas de aire entre la solución y el sello. A continuación, invierta los sellos en una capa de solución CP y retírelos después de una hora.Coloca cada sello húmedo boca abajo sobre un portaobjetos de vidrio limpio de seis a ocho veces para eliminar el exceso de líquido. A continuación, tratar al vacío los sellos durante uno a dos minutos. Adherir un espaciador de imágenes de ocho pozos y ocho milímetros de diámetro en la parte superior de una diapositiva de vidrio limpio como guía para la colocación de sellos.Coloque un sello boca abajo en el portaobjetos de vidrio en el centro de cada pozo del espaciador de imágenes. A continuación, coloque un peso equilibrado de 5,6 gramos encima de cada sello y espere 10 minutos para el estampado. Retire los pesos y los sellos del portaobjetos y deje que la capa CP se seque a temperatura ambiente durante 24 horas antes de agregar biopartículas.Si el CP está etiquetado con FITC, compruebe la eficacia del estampado con un microscopio fluorescente. Corte una losa PDMS en blanco al tamaño del espaciador de imágenes y utilice el punzón de biopsia de ocho milímetros para crear pozos en el PDMS que se alineen con los pozos del espaciador. A continuación, adhiera la losa PDMS a la corredera de vidrio.Descongelar una solución de biopartículas y diluirla a 500 microgramos por mililitro en agua para inyección. Agregue 100 microlitros de solución de biopartículas a cada PDMS bien en el portaobjetos de vidrio y sacude el portaobjetos durante 30 minutos. Enjuague bien los pozos con agua y compruebe el patrón en la diapositiva con un microscopio fluorescente.La micromatástica de la biopartícula se puede almacenar en un ambiente libre de polvo a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres meses. Preparar las células resuspendándolas a 7,5 veces 10 a las quintas células por mililitro en IMDM con 0,4% de albúmina sérica humana. Añada 100 microlitros de la suspensión a un pozo PDMS que contenga la micromatástica de biopartículas, asegurándose de que la suspensión celular sea convexa sobre la parte superior del PDMS y no contenga burbujas.Selle el pozo con un resbalón de cubierta de 12 milímetros de diámetro y presione suavemente hacia abajo con pinzas para que el exceso de suspensión celular se escape al borde del pozo, luego use un tejido para eliminar el exceso. Para crear imágenes de las células, cargue la matriz de micropartículas con células en la estación de imágenes de células vivas de un microscopio equipado con una incubadora de jaulas de 37 grados centígrados, un 5% de dióxido de carbono y un 90% de humedad relativa. Utilice microscopía de campo brillante, fluorescente y de lapso de tiempo para grabar imágenes con aumento de 10X cada 10 segundos a 405 nanómetros, 594 nanómetros y campo brillante.Incubar los neutrófilos en los pozos con biopartículas a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono durante tres horas, tomando muestras en los puntos de tiempo deseados. Utilice un microscopio de campo brillante para verificar que los enjambres se forman en el microarray. Recoger todo el volumen de sobrenadante de un solo pozo, y cargarlo en un tubo de filtro de centrífuga de 0,45 micrómetros, asegurándose de analizar cada punto de tiempo en triplicado.Centrifugar los tubos a 190 veces G y 20 grados Celsius durante cinco minutos, y recoger el volumen filtrado. A continuación, guarde las muestras a menos 80 grados centígrados hasta el tiempo de procesamiento. Al intentar este protocolo, trabaje con fotorresistir y desarrollador en la campana de humos.Tener un protocolo aprobado por el IRB antes de tomar sangre de donantes humanos. Recuerde que los materiales derivados de la sangre humana son BSL2. Cuando se añaden neutrófilos a la micromatástica de la biopartícula, los neutrófilos que contactan los cúmulos de biopartículas se activan e inician la respuesta de enjambre.La micromatrices de biopartículas fue validada utilizando microscopía fluorescente de lapso de tiempo para rastrear las migraciones de neutrófilos hacia los racimos de biopartículas. Enjambres de neutrófilos estables se forman alrededor de cada cúmulo después de 30 a 60 minutos de exposición. Por el contrario, los neutrófilos no muestran migración colectiva en ausencia de cúmulos de biopartículas.La intensidad de fluorescencia de los núcleos de neutrófilos manchados se utilizó para determinar que el tamaño medio del enjambre alrededor de los racimos de biopartículas era de aproximadamente 1490 micrómetros al cuadrado. En ausencia de racimos, la fluorescencia de una región de interés determinada se mantuvo constante a lo largo del tiempo. Las pistas de migración de neutrófilos muestran que los neutrófilos convergieron en un grupo de biopartículas cuando uno estaba presente, pero no se observó convergencia en el sistema de control.Se midió la velocidad de los neutrófilos enjambres y no inactivados, y se encontró una diferencia estadísticamente significativa en las distribuciones de velocidad. La velocidad media de los neutrófilos enjambres fue de 20,6 micrómetros por minuto, mientras que la velocidad media para los neutrófilos de control fue de dos micrómetros por minuto. Las concentraciones de 16 proteínas que los neutrófilos liberan durante el enjambre se analizaron con el tiempo.10 proteínas aumentaron su concentración. Dos disminuyó. Y los cuatro restantes aumentaron durante la primera hora de enjambre, pero disminuyeron a partir de entonces.Al realizar este procedimiento, asegúrese de que todo esté limpio y sus sellos se secan correctamente, ya que estos son esenciales para el patrón exitoso de las partículas bacterianas. El desarrollo de esta técnica permitirá a los investigadores explorar nuevas preguntas en el campo del enjambre de neutrófilos, incluyendo cómo los mediadores libres y las vesículas extracelulares participan en la comunicación intercelular de neutrófilos.

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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