Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel
21 de diciembre de 2019
Aquí se presenta un método para la bioimpresión 3D de gelatina metacriloyl.
La biónica a base de hidrogel GelMA se vuelve muy popular en la bioimpresión 3D. Sin embargo, la baja viscosidad restringe su imprenta. Aquí compartimos estrategias para imprimir GelMA en nuestro laboratorio con otros investigadores.
En este vídeo utilizamos plenamente las propiedades especiales de este biomaterial y proponemos varios métodos de impresión para diferentes estructuras 3D que podrían contribuir a otras aplicaciones biomédicas. Para tomar daño a los órganos, por ejemplo, las implicaciones son potenciales para ser utilizados en la terapia correspondiente mediante la inserción o el rastreo de las estructuras impresas gelMA. No sería fácil disolver totalmente el GelMA liofilado en poco tiempo.
Para acelerar el proceso de disolución se podría utilizar un mezclador de vórtice. Cada biomaterial utilizará propiedades especiales íntimas de GelMA. Sugerí que una nueva farmacia debería dar un paseo por lo que está condicionado crítico al imprimir.
Los detalles de la operación determinan el éxito de los procedimientos de impresión. Es por eso que elegimos una demostración visual para compartir con otros investigadores. Para fabricar microesferas comiencen conectando los dos electrodos de anillo metálico con polos de tierra y positivos.
Coloque la placa metálica conectada con el alto voltaje debajo del electrodo de anillo y una placa Petri con aceite de silicio en la placa de metal como receptor de gotas. Prepare la bio-tinta disolviendo GelMA y LAP liofilados y DPBS filtre a través de un filtro de 0,22 micrómetros para la esterilidad y luego calientela en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 15 minutos. Separe las células MDA-MB-231 con tres mililitros de 0.25 por ciento de trippsina y 0.02 por ciento solución EDTA durante tres minutos a 37 grados Celsius.
Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y centrifugarlas a 100 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y mezcle las células con un mililitro de tinta biológica preparada pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo asegurándose de evitar las burbujas de aire. Aspirar un mililitro de la bio-tinta y la mezcla celular en una jeringa estéril de tres mililitros.
Alimente la bio-tinta por la fuerza del aire comprimido y coloque la jeringa en el aparato. Encienda la potencia de alta tensión y ajuste la tensión como cero a cuatro kilovoltas. Encienda simultáneamente la luz de longitud de onda de 405 nanómetros para cruzar las gotas GelMA en cinco mililitros de aceite de silicio.
Decantar el plato Petri para deshacerse de la mayor parte del aceite de silicio y utilizar una cuchara para transferir el aceite restante y microesferas en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Añadir cinco mililitros de DPBS y agitar la mezcla centrifugar el tubo a 100 veces G y quitar el sobrenadante. Transfiera las microesferas a un plato Petri con DMEM y escúbralas a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante tres días.
Después de tres días desechar el medio y lavar las microesferas con DPBS. Fijarlos con dos mililitros de cuatro por ciento PFA durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego desechar el PFA y repetir el lavado. Permeabilizar las células con dos mililitros de 0.5 por ciento tensioactivo no iónico durante cinco minutos a temperatura ambiente desechar el surfactante y lavar las microesferas con DPBS.
A continuación, manchar las células con TRITC-faloideína durante 30 minutos y luego DAPI durante 10 minutos en la oscuridad descartando los tintes y lavando las esferas con DPBS después de cada tinción. Imagen de las microesferas con un microscopio de fluorescencia confocal. Disuelva el polvo de alginato de sodio esterilizado en agua desionizada a una relación de peso a volumen del dos por ciento.
Preparar la solución de bio-tinta estéril como se describió anteriormente y luego calentar la bio-tinta y el alginato de sodio en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 15 minutos. Trypsinize y centrifugar bMSC de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente para las células MDA-MB 231 y luego eliminar el líquido sobrenadante y resuspender el pellet celular con 2 mililitros de la bio-tinta GelMA. Aspirar dos mililitros de la mezcla de células de bio tinta en una jeringa de 10 mililitros y dos mililitros de la mezcla de alginato de sodio en otra jeringa.
Alimente las soluciones con dos bombas de jeringa bio tinta a 50 micrómetros por minuto y alginato de sodio a 350 micrómetros por minuto. Encienda la luz de longitud de onda de 405 nanómetros para irradiar el tubo transparente y reentraer las fibras GelMA. Usa un plato de Petri para recibir las fibras y recogerlas con una cuchara.
Transfiera las fibras a un plato con DMEM/F12 y escúbralas durante tres días a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. Después de cultivar las células siguen las instrucciones previamente descritas para observar las fibras bajo un microscopio de fluorescencia confocal. Disuelva GelMA y LAP y DPBS liofilados y añada pigmento comestible magenta en la solución para mejorar la precisión de impresión.
Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 micrómetros para la esterilidad y calentarla en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 15 minutos. Cree los modelos 3D con el software CAD e importe los documentos del modelo al software superior de la bioimpresora DLP aplicada. Añadir diez mililitros de la bio-tinta preparada a la vaguada de la bioimpresora.
Establezca los parámetros de impresión de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y, a continuación, comience a imprimir. Cuando esté completo, retire la estructura impresa de la bioimpresora y sumerjala en DPBS en un plato Petri. Separe y pelete las células MDA-MB 231 como se describió anteriormente.
Resuspenderlos con dos mililitros de DMEM y añadir la suspensión a la estructura impresa. Cultivo de las células a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono durante tres días y luego preparar las estructuras para la observación con un microscopio de fluorescencia confocal como se describió anteriormente. Prepare un peso del 10 por ciento para volar GelMA y una solución laP de 0.5 por ciento de peso a volumen y luego filtre a través de un filtro de 0,22 micrómetros.
Esterilice el polvo de gelatina bajo la luz UV durante 30 minutos y agréguelo a la solución laP de GelMA a una relación peso-volumen del cinco por ciento. Calienta la mezcla en un baño de agua de 37 grados centígrados durante 15 minutos. Llene los moldes con la tinta biológica preparada y colóquelos en un refrigerador de cuatro grados Centígrados durante 30 minutos.
Utilice una cuchilla para retirar las láminas de hidrogel parcialmente reticuladas de los moldes. Combine láminas de hidrogel moldeada en 2D y vinú las con GelMA irradiando a 405 nanómetros durante un minuto. Separar y peletizar los HUVEC mezclan las células con dos mililitros de DMEM e inyectan la suspensión en el microcanal con la boquilla y la jeringa.
Durante las siguientes tres horas, voltee el chip al revés cada 15 minutos para lograr asientos de celda uniformes y completos. Cultivar las virutas en un plato de Petri durante tres días en DMEM a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono y luego prepararlos para la observación morfológica. Cuando las gotas De GelMA cayeron en el aceite de silicona receptora mantuvieron una forma de esferoide estándar sin colas.
Las células encapsuladas que experimentaban la fuerza de campo eléctrico de alto voltaje mantuvieron su capacidad de propagación que verificó la biocompatibilidad del método de fabricación electro-asistida. Una bio impresora DLP fue elegida para fabricar estructuras GelMA con formas más complejas como la oreja nasal y la cámara múltiple. HUVECs de semillas unidos a los materiales GelMA y esparcidos en la superficie de las estructuras GelMA reticuladas demostrando que esta aplicación tiene potencial para la ingeniería de tejidos.
Se utilizó una estrategia de reticulación dos veces para fabricar chips microfluídicos basados en GelMA. Los chips con varios microcanales fueron construidos mediante el diseño de diferentes moldes bajo demanda y los HUVEC fueron sembrados en los canales y unidos a la pared del canal formando la forma macroscópica del recipiente. La fuente de alto voltaje se aplica al fabricar microesferas.
Los investigadores deben examinar el circuito antes y no tocar los milibares expuestos protegiendo a los operadores o hace que las células de un daño por cortocircuito. La base de agua ultrasónica podría ser otra opción para acelerar la velocidad de merecido. Definitivamente esta contribución resumió los métodos de bioimpresión 3D de GelMA en nuestro laboratorio.
Los investigadores podrían referirse al vídeo y mejorar o ampliar las estrategias de impresión para satisfacer los requisitos biomédicos adicionales.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para la bioimpresión 3D de gelatina metacrilada (GelMA). Se analizan estrategias para mejorar la capacidad de impresión de GelMA, lo cual es crucial para diversas aplicaciones biomédicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Impresión biológica 3D
- Biomateriales
- Ingeniería biomédica
Antecedentes
- Los hidrogeles de GelMA están ganando popularidad en la bioprinting 3D.
- La baja viscosidad de la GelMA limita su capacidad de impresión.
- Se necesitan estrategias para mejorar su aplicación en campos biomédicos.
- Las aplicaciones potenciales incluyen la terapia para el daño orgánico.
Objetivo del estudio
- Compartir estrategias eficaces de impresión para GelMA.
- Explorar las propiedades especiales de GelMA para diversas estructuras 3D.
- Contribuir al desarrollo de aplicaciones biomédicas.
Métodos Utilizados
- Utilización de las propiedades únicas del GelMA.
- Desarrollo de diversos métodos de impresión.
- Estrategias para incrustar o trazar estructuras impresas.
- Abordaje de los desafíos en la disolución del GelMA liofilizado.
Resultados principales
- Se demostraron técnicas de impresión efectivas para GelMA.
- Se mostraron aplicaciones potenciales en terapia.
- Se identificaron desafíos en la disolución de GelMA.
- Se aportaron conocimientos para investigaciones futuras en bioprinting 3D.
Conclusiones
- Mejores métodos para la bioimpresión 3D de GelMA pueden potenciar aplicaciones biomédicas.
- Se necesita más investigación para optimizar la capacidad de impresión de GelMA.
- Potencial para contribuciones significativas a la terapia de órganos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La bioimpresión 3D de hidrogeles de GelMA permite la fabricación de estructuras complejas cargadas con células para aplicaciones en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. El protocolo aborda los desafíos de imprimibilidad mediante la formación de gotas asistida por corriente eléctrica, la extrusión de fibras y el patrón basado en DLP, lo que posibilita la fabricación reproducible de microesferas, fibras y chips microfluídicos. Estos métodos aumentan la confianza predictiva en modelos preclínicos al proporcionar andamios biocompatibles y ajustables que imitan las señales de la matriz extracelular.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las interacciones célula-matriz mediante motivos sensibles a RGD y MMP en GelMA, apoyando la desvinculación mecanicista de objetivos terapéuticos.
- Valor operativo: Proporciona formatos estandarizados de microesferas y fibras para el cribado de alto rendimiento del comportamiento celular bajo estímulos biofísicos controlados.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera microentornos 3D cuantificables para evaluar la expansión celular, viabilidad y morfogénesis en respuesta a perturbaciones farmacológicas o genéticas.
- Valor operativo: Permite la estandarización de ensayos mediante formulaciones de GelMA fotoenlazables con rigidez y tasas de degradación ajustables.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la fabricación de chips microfluídicos perfundibles revestidos con HUVECs, lo que permite modelos de tejidos vascularizados para estudios de transporte y toxicidad de fármacos.
- Valor operativo: Permite la producción escalable de arquitecturas 3D complejas (por ejemplo, nariz, oreja, cámaras múltiples) para la validación preclínica de terapias regenerativas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El flujo de trabajo integra la preparación de bio-tinta, la encapsulación celular y la reticulación asistida por voltaje o luz para producir constructos de hidrogel funcionales adecuados para la evaluación biológica posterior.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre la adhesión mediada por integrinas y la remodelación dependiente de proteasas en contextos tridimensionales.
- Selección: Permite la fabricación reproducible de microesferas y fibras de hidrogel para ensayos estandarizados de compuestos en matrices tridimensionales fisiológicamente relevantes.
- Análisis: Proporciona lecturas estructurales y fluorescentes (por ejemplo, imágenes confocales de actina y núcleos) para cuantificar las respuestas celulares en distintas condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con el trabajo preclínico mediante la generación de chips microfluídicos vascularizados que modelan la formación y función de microvasos humanos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma modular adaptable a diversos tipos celulares y geometrías, reduciendo el esfuerzo de redesarrollo entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la validación de objetivos al permitir la evaluación funcional de células en hidrogeles degradables y adhesivos que reproducen características clave del microentorno.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante la formulación estandarizada de bio-tinta, filtración estéril y parámetros controlados de reticulación.
- Valor estratégico: Reduce los plazos de desactivación de riesgos biológicos al proporcionar modelos predictivos en etapas tempranas de integración tisular y vascularización.
- Impacto en la cartera: Apoya las decisiones de continuar o descartar en programas de medicina regenerativa al permitir una rápida iteración de diseños de andamiajes e interacciones célula-material.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en química de hidrogeles, preparación estéril de bio-tinta y sistemas de reticulación eléctricos u ópticos.
- Necesita instrumentación que incluya fuentes de alimentación de alto voltaje, bombas de jeringa, fuentes de luz de 405 nm y bioploters DLP.
- Exige la estandarización entre equipos del contenido de viscosidad de la bio-tinta, densidad celular y duración de la reticulación para lograr reproducibilidad entre laboratorios.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos celulares (por ejemplo, MDA-MB-231, bMSCs, HUVECs) y cinéticas de gelificación a través de concentraciones de GelMA.
- Incluye limitaciones prácticas, como la baja viscosidad de la GelMA que requiere métodos auxiliares (por ejemplo, impresión electrohidrodinámica, coextrusión con alginato) para mantener la fidelidad de la forma.
