Name: Célula-célula Fusión de Líneas Celulares Editadas genoma para la Perturbación de la Estructura Celular y la Función (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprende la fusión de líneas celulares editadas genómicamente para estudiar la estructura y función celular mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite rastrear orgánulos y analizar su homeostasis.

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Este trabajo fue financiado por una beca Wellcome Trust Henry Wellcome a R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant número 100090/12/Z). El fundero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Ashok Venkitaraman y Paul French por su asesoramiento y orientación crítica sobre el proyecto. Agradecemos a Chiara Cossetti y Gabriela Grondys-Kotarba en las instalaciones de citometría Cambridge Institute for Medical Research Flow por su excelente apoyo. Agradecemos a Liam Cassiday, Thomas Miller y Gianmarco Contino por revisar el manuscrito.

1. Etiquetado diferencial de celdas fluorescentes
<ol><li>Etiquetado genético con CRISPR Cas9<ol>
<li>Utilice la edición del genoma CRISPR Cas9 para etiquetar la rootletina (u otros genes de interés) con las proteínas fluorescentes meGFP o mScarlet-I en líneas celulares de cáncer humano. NOTA: Los protocolos detallados para la edición del genoma se tratan en otros lugares24,25,26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiquetado de colorante fluorescente<ol>
<li>Cultivar células cancerosas humanas Cal51 en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), L-glutamina y 100 g/ml de penicilina/estreptomicina a 37 oC y 5% deCO2 en una incubadora humidificada. NOTA: Es importante asegurarse de que las células se revisen regularmente para detectar la ausencia de contaminación por micoplasma, y para la identidad de la línea celular. No utilice celdas que hayan sido ampliamente pasajeras en cultivo (>15 pasajes). Las células deben estar sanas y crecer exponencialmente. Evite la confluencia excesiva o la sobreconfluencia.</li>
		<li>Seque cada tipo de celda (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I y células de Cal51 sin etiquetar parentales) de tal manera que las células de 6 x 106 estén presentes al día siguiente para cada muestra, con una confluencia del 70-90%. NOTA: Se trata de aproximadamente un matraz de cultivo t75 o un plato de 10 cm por tipo de célula. Las celdas parentales sin etiquetar se requieren como un control negativo más adelante en el protocolo. Este protocolo permite la producción de 20.000 celdas fusionadas, pero este número podría aumentarse mediante el escalado vertical del protocolo con un mayor número de lotes.</li>
		<li>Al día siguiente, precalentar DMEM, trippsina y 1 x solución salina con fosfato (PBS) colocándolos en un baño de agua a 37 oC.</li>
		<li>Lave las células rootletin-meGFP y rootletin-mScarlet-I 2x en PBS vertiendo o aspirando medio y reemplazándolo con 10 mL de PBS.</li>
		<li>Etiquetar células de rootletina-meGFP Cal51 añadiendo 500 nM de tinte de células violetas(Tabla de materiales)en PBS durante 1 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Etiquete las células rootletin-mScarlet-I de Cal51 añadiendo 200 nM de tinte de células rojas lejanas(Tabla de materiales)en PBS durante 1 min en RT. NOTA: Mantenga las muestras protegidas de la luz siempre que sea posible después de la tinción fluorescente, para evitar el fotoblanqueo de la fluorescencia.</li>
		<li>Detenga las reacciones de etiquetado del tinte añadiendo 10 ml de DMEM durante 5 min.</li>
		<li>Retire las células Parentales Cal51 sin etiquetar de la incubadora (del paso 1.2.2). NOTA: Estas celdas se utilizarán más adelante como controles negativos sin etiquetar (paso 3.3.2).</li>
		<li>Lave todas las células una vez vertiendo el medio de crecimiento y reemplazándolo con 10 ml de PBS.</li>
		<li>Vierta PBS e incubar durante 5 minutos en condiciones de cultivo con 1 ml de trippsina 1x precalentada.</li>
		<li>Transfiera las células a un tubo cónico de plástico de 15 ml y centrífuga a 1000 x g durante 5 min.</li>
		<li>Retire y deseche cuidadosamente la tripsina del pellet celular con una pipeta.</li>
		<li>Resuspenda suavemente los gránulos de células etiquetadas violeta y de color rojo lejano en 1 ml de PBS.</li>
		<li>Resuspenda suavemente el pellet de células parentales (no fluorescentes) en 1 ml de DMEM y vuelva a la incubadora. NOTA: Esta muestra no se someterá a fusión célula-célula, pero se utilizará más adelante durante la citometría de flujo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fusión de células celulares
<ol><li>Mezclar 3 x 106 celdas etiquetadas violetas con 3 x 106 celdas etiquetadas de color rojo lejano en un tubo de 15 ml pipeteando suavemente 0,5 ml de cada tipo de célula utilizando una pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Centrifugar las células no mezcladas restantes del paso 2.1 a 1.000 x g durante 5 min, luego verter PBS, resuspender el pellet en 1 ml de DMEM y volver a la incubadora. NOTA: Estas muestras de etiqueta única no mezcladas restantes se utilizarán más adelante como controles negativos y de compensación en la sección 3 del protocolo.</li>
	<li>Centrifugar las células mixtas del paso 2.1 a 1.000 x g durante 5 min y aspirar cuidadosamente PBS usando una pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Añadir 0,7 ml de solución PEG al 50% 1450 de forma ligera al pellet celular (paso 2.3) utilizando una pipeta de 1 ml durante un período de 30 s.</li>
	<li>Dejar actuar durante 3,5 min en RT. NOTA: El tiempo de incubación con PEG puede optimizarse dependiendo del tipo de célula, aunque tenga en cuenta que el tiempo de incubación más largo aumenta la toxicidad celular.</li>
	<li>Añadir 10 ml de DMEM sin suero en sentido de gota durante 30 s y dejar en la incubadora durante 10 min.</li>
	<li>Gire hacia abajo a 1.000 x g durante 5 min, deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente en 1 ml de medio completo (DMEM que contiene FBS). NOTA: Proceda directamente a la sección 3. Hay toxicidad asociada con la exposición a PEG seguida de citometría de flujo e imágenes, así que mantenga las células en condiciones de cultivo tanto como sea posible procediendo rápidamente entre pasos.</li>
</ol>3. Clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer las células fusionadas
<ol><li>Prepare todas las células para la citometría de flujo pipeteando suavemente cada muestra por separado a través de un filtro de 70 m en un tubo FACS. NOTA: Se requieren cuatro muestras: células fusionadas, células rojas lejanas etiquetadas, células violetas etiquetadas individuales, células parentales sin etiquetar. Una vez extraídas de la capucha del cultivo de tejido estéril, las células tienen la capacidad de infectarse, por lo que minimiza el tiempo de exposición de las muestras a un entorno no estéril a partir de ahora. Las celdas se ordenan en medio DMEM completo.</li>
	<li>Utilice un citómetro capaz de ordenar una sola celda.<ol>
<li>Configure el clasificador de celdas para una ordenación aséptica. Realice el control de calidad del instrumento según la recomendación del fabricante.</li>
		<li>Dibuja una gráfica de dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral y una gráfica de discriminación de doblete.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cree puertas para identificar celdas fusionadas.<ol>
<li>Emocionar los colorantes fluorescentes a longitudes de onda de 405 nm y 635 nm. Detectar a 450 nm y 660 nm (longitudes de onda violeta y de color rojo lejano, respectivamente). Trazar longitudes de onda de color rojo versus violeta.</li>
		<li>Ejecute las células parentales sin etiquetar a través del citómetro y registre la intensidad de la fluorescencia. NOTA: Los valores por encima de esta línea base definen la positividad para la tinción de tinte.</li>
		<li>Ejecute células violetas etiquetadas individuales a través del catómetro. Confirme que no hay derrame de violeta en el canal rojo lejano.</li>
		<li>Ejecute celdas rojas lejanas etiquetadas a través del citómetro y confirme que no hay derrame de rojo lejano en el canal violeta. NOTA: Para los datos representativos mostrados, las células se clasificaron a 20 psi en una clasificadora equipada con una boquilla de 100 m.</li>
		<li>Ejecute brevemente la muestra de fusión para confirmar que las celdas fusionadas son visibles con las puertas creadas en el paso 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alinee la corriente de clasificación de forma centralizada en una placa de imágenes de 8 pozos.</li>
	<li>FacS ordenar las células fusionadas, presentes como células etiquetadas de doble color violeta positivo y de color rojo lejano directamente en una placa de imágenes de 8 pozos que contiene 100 l de medio de crecimiento. NOTA: El número máximo recomendado de células es de 50.000 euros por plato de 8 pozos. Garantice el estado celular durante la clasificación. La confluencia celular puede influir en la salud celular, por lo que mantener las células entre el 20 y el 90 % de la confluencia después de ordenar mediante la clasificación de un número adecuado de células para la placa de imágenes. Cada gota ordenada contiene aproximadamente 3 nL de líquido de vaina. Asegúrese de que el líquido de la vaina no diluya significativamente el medio de crecimiento durante la clasificación.</li>
	<li>Inmediatamente después de la clasificación, llevar las células de vuelta a la incubadora y dejar para >2 h o durante la noche. NOTA: Las células adherentes se volverán a adherir gradualmente a la capa durante este período, a partir de la clasificación, y por lo tanto su morfología cambiará con el tiempo si se lleva directamente al microscopio.</li>
</ol>4. Tinción inmunofluorescente e imágenes de fusiones de células celulares
NOTA: Las células fusionadas se pueden crear imágenes en vivo o después de la fijación y una mayor tinción fluorescente (o ambas), dependiendo de los experimentos y las mediciones requeridas.
<ol><li>Imágenes de células vivas<ol>
<li>Reemplace el medio de crecimiento por un medio de imagen sin rojo fenol(Tabla de materiales)y proceda directamente a la toma de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fijación y tinción<ol>
<li>Preparar paraformaldehida (PFA) fresco al 4% en PBS.</li>
		<li>Fije las células incubando en 100 s de 4% PFA durante 15 minutos en RT. Retire PFA después de 15 min. PRECAUCION: La PFA es tóxica cuando se inhala, por lo que este paso debe realizarse en una campana de humos con el equipo de protección personal adecuado. NOTA: Después de la fijación, el experimento se puede pausar y reiniciar más tarde si es necesario. Almacene la muestra a 4 oC protegida de la luz si es necesario.</li>
		<li>Lavar las células 3 veces en 200 ml de PBS a RT.</li>
		<li>Permeabilizar las células durante 10 min a RT en 200 l de tensioactivo no iónico al 0,1%(Tabla de materiales)y 0,1% detergente no iónico(Tabla de materiales)diluido en PBS.</li>
		<li>Bloquear en 200 l de albúmina sérica bovina al 3% en PBS durante 30 min a RT.</li>
		<li>Incubar con anticuerpos en 150 ml de PBS que contengan 3% de albúmina sérica bovina y un tensioactivo no iónico al 0,1% y un detergente no iónico al 0,05% durante 1 h a RT. NOTA: Los anticuerpos primarios utilizados para generar los resultados representativos son el nanobody anti-GFP conjugado fluorescentemente (utilizado en la dilución 1:400), y el anti-mScarlet-I nanobody conjugado fluorescentemente (utilizado en 1:500 dilución). Estos mejoran la señal de las proteínas ya fluorescentes.</li>
		<li>Lavar 2 veces durante 5 min en 300 éL de PBS y luego dejar en 200 éL de PBS. NOTA: Las muestras se muestran en PBS. Las muestras se pueden almacenar a 4 oC protegidas de la luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adquisición de imágenes<ol>
<li>Adquiera imágenes con un microscopio de fluorescencia adecuado capaz de crear imágenes de cuatro colores (por ejemplo, iluminación confocal, de campo ancho y estructurada).</li>
		<li>Emocione los canales meGFP y mScarlet-I con láseres de longitud de onda de 488 nm y 561 nm, respectivamente. Ajuste los detectores para que detecten a 505 a 550 nm y a 590 a 650 nm. Emocione los canales de tinte violeta y rojo lejano con láseres de 405 nm y 633 nm, respectivamente. Ajuste los detectores para que detecten a 430 a 500 nm y a 660 a 750 nm.</li>
		<li>Determinar empíricamente la intensidad del láser de tal manera que no se produzca un fotoblanqueo significativo y que las células permanezcan sanas (si las imágenes de células vivas).</li>
		<li>Determinar empíricamente la ganancia de tal manera que la señal se obtiene sin saturar o recortar artificialmente los valores de píxel.</li>
		<li>Recopile datos de la pila Z, de modo que las imágenes sean tridimensionales, cubriendo un rango de 20 a 60 m con un tamaño de paso de 500 m. NOTA: Las imágenes mostradas en los datos representativos fueron adquiridas por confocal(Figura 2B),Airyscan(Figura 2C)o microscopía de iluminación estructurada(Figura 2D). Cada célula es un heterokaryon de buena fe si contiene colorantes violetas y rojos lejanos que se superponen en el citoplasma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li>
<li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li>
<li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li>
<li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells%3A+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Demostramos un protocolo fácil y rentable para fusionar células y visualizar la arquitectura posterior de los híbridos celulares con microscopía, tardando aproximadamente dos días de principio a fin. Las partes críticas de este protocolo son el enriquecimiento de células fusionadas por clasificación celular (sección 3 del protocolo), y la validación cuidadosa de las células fusionadas por microscopía (sección 4 del protocolo). Estas secciones aseguran que las células fusionadas se obtengan fácilmente y sean heterocaryone...

El mantenimiento homeostático de la estructura celular es fundamental para la vida. Las células tienen morfologías características, números de orgánulos subcelulares y composición bioquímica interna. Entender cómo se generan estas propiedades fundamentales y cómo van mal durante la enfermedad requiere herramientas de laboratorio para perturbarlas.
La fusión celular es la fusión de dos o más celdas separadas. La fusión celular puede haber sido crítica para la aparición de la vida eucariota1. En el cuerpo humano, la fusión celular es relativamente rara, que ocurre durante circunstancias de desarrollo restringidas y tipos de tejido, como durante la fertilización o la formación de músculo, hueso y la placenta2. Este protocolo describe la inducción de la fusión célula-célula en líneas celulares de cultivo de tejido con orgánulos etiquetados fluorescentemente diferencialmente, como una herramienta para entender los mecanismos que controlan la estructura y la función celular.
La fusión in vitro de células celulares es fundamental para la producción de anticuerpos monoclonales3, una herramienta importante para la investigación biológica y el tratamiento de enfermedades. La fusión celular también se ha utilizado para hacer muchas preguntas biológicas fundamentales fundamentales sobre la dominancia del ciclo celular4, aneuploidía5,6, reprogramación celular7,8, la reparación de las neuronas dañadas9, proliferación viral10, apoptosis11, tumorigénesis12, dinámica citoesquelética13, y membrana de fusión14,15. Los métodos basados en laboratorio para inducir la fusión célula-célula16,17,18,19 inducen la carbonescencia de la membrana lipídica a través de la fusión física de dos bicapas en una. La fusión celular puede ser inducida por electricidad18, métodos virales basados17, calentamiento termoplasmónico20, expresión transgénica19, y productos químicos incluyendo polietilenglicol (PEG)16,21,22.
Los centros son centros organizadores de microtúbulos que controlan la forma celular, la motilidad, la polarización y la división23. Las raíces centrosómicas son estructuras fibrosas que se extienden a partir de centrosomas que contienen la proteína rootletina24 (codificada por el gen CROCC). Recientemente usamos la fusión de células celulares para entender cómo la posición y el número de centrosomas varían dentro de heterocaryons en relación con las células parentales24. La razón de ser de este método es rastrear la célula de origen de las raíces dentro de un heterokaryon después de la fusión de células parentales etiquetadas diferencialmente fluorescentes, y así imaginar la fusión y físsion de los orgánulos. Las proteínas etiquetadas fluorescentes rootletin-meGFP o rootletin-mScarlet-I se crean mediante la edición del genoma en líneas celulares separadas que luego se fusionan mediante la fusión celular mediada por PEG. Describimos el uso de tintes celulares(Tabla de Materiales)para identificar células fusionadas por citometría de flujo y posterior identificación microscópica de fluorescencia de células centrosomasdes de origen y morfología (Figura 1). Este enfoque es un método robusto y único para estudiar cómo los cambios importantes en el estado celular incluyendo el número de organélilos afectan a la homeostasis celular.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>solución de formaldehído al 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8875</td><td></td></tr><tr><td>880 Microscopio Airyscan confocal de barrido</td> láser <td>Carl Zeiss</td> Placas de imagen de <td></td><td></td></tr><tr><td>8 pocillos</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Alpaca Anti-GFP Booster GFP nanobody</td><td>Chromotek</td><td>gba-488</td><td></td></tr><tr><td>BD Influx Clasificador de células</td><td>BD Biosciences</td> Albúmina sérica bovina <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Filtros celulares (70 &mu; m)</td><td>Biofil</td><td>CSS010070</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Rojo lejano</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violeta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido de glucosa, GlutaMAX, piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td><td>NanoTag Biotechnologies</td><td>N1302-At565</td><td></td></tr><tr><td>L15 CO2 medio de imagen independiente</td><td>Sigma-Aldrich 21083027</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin rojo fenol, alta glucosa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (1x PBS)</td><td></td><td></td><td>8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2HPO4, dH2O hasta 1 L</td></tr><tr><td>Polietilenglicol Hybri-Max 1450</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReactivos</td><td>BP151</td><td>tensioactivo no iónico</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337</td><td>detergente no iónico</td></tr></tbody></table>

célula-célula fusión de líneas celulares editadas genoma para la perturbación de la estructura celular y la función

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

La vida se divide espacialmente dentro de las membranas lipídicas para permitir la formación aislada de estados moleculares distintos dentro de las células y orgánulos. La fusión celular es la fusión de dos o más celdas para formar una sola celda. Aquí proporcionamos un protocolo para la fusión celular de dos tipos de células diferentes. Las células híbridas fusionadas se enriquecen mediante la clasificación basada en citometría de flujo, seguida de la microscopía de fluorescencia de la estructura y función de las células híbridas. Las proteínas etiquetadas fluorescentes generadas por la edición del genoma se utilizan en el interior de las células fusionadas, lo que permite identificar las estructuras celulares en función de la emisión de fluorescencia y hacer referencia al tipo de origen de la célula. Este método robusto y general se puede aplicar a diferentes tipos de células u orgánulos de interés, para entender la estructura celular y la función a través de una gama de cuestiones biológicas fundamentales.

Las células etiquetadas adecuadamente son visibles durante la citometría de flujo por señal de fluorescencia superior a las células de control no etiquetadas(Figura 2A). Las puertas están configuradas para la clasificación de células dobles positivas, enriqueciendo a esta población directamente en platos de imágenes para análisis microscópicos adicionales. Las células fundidas son detectables como células dobles fluorescentes positivas distin...

El propósito de este protocolo es fusionar dos tipos de células diferentes para crear células híbridas. El análisis de microscopía de fluorescencia de células fusionadas se utiliza para rastrear la célula de origen de los orgánulos celulares. Este ensayo se puede utilizar para explorar cómo la estructura celular y la función responden a la perturbación por fusión celular.

Célula-célula Fusión de Líneas Celulares Editadas genoma para la Perturbación de la Estructura Celular y la Función

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Este método permite que la estructura celular y la función se perturen a través de la fusión de dos tipos de células diferentes para abordar preguntas tales como cómo responden las células a los cambios en el número de orgánulo. Mediante la toma de imágenes de proteínas etiquetadas fluorescentmente dentro de las células fusionadas, las estructuras celulares se pueden hacer referencia de nuevo a su tipo de célula de origen para estudiar los mecanismos de la homeostasis y la función del orgánulo. Para el etiquetado de tintes fluorescentes, vea las poblaciones de células cancerosas humanas de interés de tal manera que cada cultivo se habrá expandido a por lo menos seis veces 10 a las sextas células en una confluencia de 70 a 90% para la mañana siguiente.El día del etiquetado, lave dos veces las células de rootletina eGFP y rootletin-mScarlet con 10 mililitros de PBS por lavado. Diluir el tinte celular violeta a 500 nanomolares en PBS y teñido de células rojas lejanas a 200 nanomolares en PBS. Etiquete las células de rootletin eGFP con el tinte celular violeta diluido y las células de rootletin-mScarlet con el tinte de células rojos lejanos diluido durante un minuto a temperatura ambiente.Al final de las incubaciones, detenga las reacciones con 10 mililitros de DMEM durante cinco minutos. Lave tanto cultivos celulares etiquetados como un cultivo celular parental sin etiquetar con 10 mililitros de PBS fresco antes de incubar todos los cultivos con un mililitro de trippsina precalentada. Al final de la incubación, transfiera las soluciones celulares separadas a tubos cónicos individuales de 15 mililitros para centrifugación y resuspende suavemente los pellets etiquetados con tinte en un mililitro de PBS y las células sin etiquetar en un mililitro de DMEM.A continuación, devuelva todas las muestras de celda a la incubadora de cultivo celular. Para el experimento de fusión celular, mezcle 500 microlitros de células etiquetadas con tinte violeta con 500 microlitros de células etiquetadas con tinte Rojo Lejano en un nuevo tubo de 15 mililitros y sedimente las células etiquetadas no mezcladas restantes por centrifugación. Resuspender los pellets en un mililitro de DMEM fresco y colocar las células de nuevo en la incubadora.Recoger las células mixtas por centrifugación y añadir 700 microlitros de 50%1450 PEG de una manera gota a la bola durante un período de 30 segundos. Después de 3,5 minutos a temperatura ambiente, agregue 10 mililitros de DMEM sin suero en un período de 30 segundos y coloque los tubos en la incubadora durante 10 minutos. Al final de la incubación, sedimentar las células mixtas por centrifugación y resuspend suavemente el pellet en un mililitro de medio completo.Para enriquecer para la población de células fusionadas por FACS, filtre suavemente todas las células en tubos FACS individuales a través de un colador de 70 micrómetros y cree tramas de dispersión hacia adelante frente frente a dispersión lateral y discriminación de doblete en el software del citometro. Ejecute las celdas sin etiquetar para registrar su intensidad de fluorescencia y crear puertas para identificar las celdas fusionadas. A continuación, ejecute el único tinte Violet positivo etiquetado con las células para confirmar que no hay derrame de señal violeta en el canal Rojo Lejano y el único tinte rojo Lejano positivo etiquetado células para confirmar que no hay señal de rojo lejano en el canal Violeta.Luego ejecute brevemente la muestra de fusión para confirmar que las células fusionadas son visibles con estas puertas. Cuando se hayan establecido los parámetros de clasificación, alinee el flujo de clasificación de forma centralizada en una placa de imágenes de ocho pozos que contenga 100 microlitros de medio de crecimiento y clasif sino las células fusionadas positivas dobles directamente en el plato. Cuando todas las células hayan sido ordenadas, coloque inmediatamente el plato en la incubadora de cultivo celular durante dos a 16 horas.Para la tinción inmunofluorescente, primero reemplace el sobrenadante de cultivo celular por 200 microlitros de 4%paraformaldehído para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la fijación, lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS por lavado antes de permeabilizar las células en 200 microlitros de 0.1%surfactante no iónico durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, bloquee la unión inespecífico con 200 microlitros de albúmina sérica bovina al 3% bovina en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de un etiquetado con los anticuerpos de interés en 150 microlitros de tampón de tinción.Después de una hora a temperatura ambiente, lave las células dos veces en 300 microlitros de PBS durante cinco minutos por lavado. Después del último lavado, sustituya el lavado por 200 microlitros de PBS fresco. Para adquirir imágenes de las células fusionadas, utilice un microscopio de fluorescencia adecuado capaz de imágenes de cuatro colores y recopile imágenes tridimensionales.Las células debidamente etiquetadas son visibles durante la citometría de flujo por señal fluorescente a un nivel más alto que las células de control sin etiquetar. Las puertas se pueden configurar para la clasificación para enriquecer para la población de células dobles positivas directamente en platos de imagen para un análisis microscópico adicional. La fusión induce una reorganización importante de la arquitectura celular a través de la mezcla de dos células en una.Los heterokaryons se identifican como células que contienen ambas señales de tinte fluorescente mezcladas dentro de una sola célula sin intervenir membranas plasmáticas. Además, dos núcleos también pueden ser visibles en las células fusionadas por imágenes de Brightfield. La estructura y la función celulares pueden investigarse más a través de la fusión de células que contienen proteínas etiquetadas con meGFP y mScarlet.La fusión da como resultado una duplicación del número centrosome dentro de los heterokaryons visibles como al menos cuatro focos de material pericentriolar cuando el componente pericentriolar centrosome NEDD1 está etiquetado fluorescentemente. La fusión de células con rootletina endógenamente etiquetada fluorescentemente permite identificar la célula de origen de cada centroomante en un heterokaryon. Este protocolo demuestra cómo fusionar líneas celulares etiquetadas diferencialmente y cómo crear imágenes de sus orgánulos para comprender su estructura y función.Este protocolo robusto es relativamente fácil y relativamente barato de realizar en comparación con métodos similares. Esta técnica se puede utilizar para hacer una serie de preguntas tales como cómo se regula la fusión de organelos y cómo las células responden a los cambios en el número de orgánulo subcelular.

cell-cell-fusion-genome-edited-cell-lines-for-perturbation-cellular

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video demuestra una técnica de edición del genoma basada en nucleasas de dedos de zinc en células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Dado que las hPSC pueden diferenciarse potencialmente en varios tipos de células, esta tecnología es útil para estudios patológicos y farmacológicos in vitro de manera específica para cada paciente.

Edición del genoma basada en nucleasa de dedos de zinc: una técnica para modificar el genoma en células madre pluripotentes humanas mediante un mecanismo de reparación dependiente de la homología de doble cadena

CRISPR/Cas9 es un sistema robusto para producir disrupción de genes y elementos genéticos. En este trabajo describimos un protocolo para la creación eficiente de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Describimos un método para experimentos de agotamiento-rescate que preserva la integridad celular y la homeostasis de las proteínas. La adenofección permite análisis funcionales de proteínas dentro de procesos biológicos que se basan en dinámicas basadas en actina finamente ajustadas, como la división celular mitótica y la miogénesis, a nivel de una sola célula.

Adenofection: Un método para estudiar el papel de las chaperonas moleculares en Morfodinámica celular mediante experimentos de reducción-Rescate

Protocolos para generar HPSC líneas mutantes que utilizan la plataforma iCRISPR y se diferencien en células hPSCs ß-como sensibles a glucosa se describen. La combinación de la tecnología de edición del genoma con la diferenciación dirigida HPSC proporciona una potente plataforma para el análisis sistemático de la función de los factores determinantes del linaje en el desarrollo humano y la progresión de la enfermedad.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Este protocolo describe el flujo de trabajo de un gen CRISPR/Cas9 basado en sistema para la reparación de las mutaciones de punto en células de mamíferos. Aquí, utilizamos un enfoque combinatorio gene edición con una detallado seguimiento estrategia experimental para medir la formación de indel en el sitio de destino, en esencia, analizar in situ la mutagénesis.

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

CRISPR-Cas es una tecnología de gran alcance para los complejos genomas de plantas y animales. Aquí detallamos un protocolo eficiente editar el genoma humano utilizando diferentes endonucleasas de Cas. Se destacan importantes consideraciones y parámetros de diseño para optimizar la eficiencia de la edición.

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

La entrega de editores genómicos como ARN es un medio particularmente potente para modificar los genomas de las células y líneas celulares primarias de mamíferos. El objetivo de este protocolo es entregar editores genómicos como ARNm a células y líneas celulares primarias de mamíferos, seguido de secuenciación y análisis dirigidos de Illumina para cuantificar los resultados de edición.

Edición genómica en células primarias de mamíferos mediante electroporación del ARN editor

Aprende la fusión de líneas celulares editadas genómicamente para estudiar la estructura y función celular mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite rastrear orgánulos y analizar su homeostasis.

Célula-célula Fusión de Líneas Celulares Editadas genoma para la Perturbación de la Estructura Celular y la Función

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