Name: Purificación de Prominin-1+ Células Madre del Cerebelo de Ratón Postnatal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende a purificar células madre Prominin-1+ del cerebelo postnatal de ratón mediante un protocolo sencillo y económico. Este método permite estudiar el desarrollo cerebeloso y enfermedades como la ataxia espinocerebelosa.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Opal por sus sugerencias. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH 1RO1 NS062051 y 1RO1NS08251 (Opal P)

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio (2011) y fueron aprobados por la Universidad Northwestern IACUC (Protocolo IS00011368).
1. Preparación de soluciones
<ol><li>Preparar la solución de disociación tisular hecha de solución salina tamponada de fosfato de fenol estéril que contiene el fenol (DPBS) con papaína (100 U/ml), cisteína (0,2 mg/ml) y DNase (250 U/ml).</li>
	<li>Para preparar la solución de DNase diluir 100 mg del polvo liofilizado de DNase I (una botella) en 50 ml de H2O. Mezclar bien y filtrar la solución en stock. Prepare alícuotas de stock de 10 ml. Divida un tubo de material en alícuotas de un solo uso de 0,5 ml. Almacene estas alícuotas de un solo uso a -80 oC.</li>
	<li>Preparar reactivos de separación magnética mediante la preparación del búfer magnético de columna X: 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y solución EDTA de 2 mM.</li>
	<li>Para preparar los medios de neurosfera, utilice un medio neurobasal que contenga penicilina/estreptomicina con L-glutamina y suplemento con 2% B27, 20 ng/ml factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF), y 20 ng/ml factor de crecimiento básico de fibroblastos humano recombinante (bFGF).</li>
	<li>Para preparar medios de diferenciación, utilice el medio neurobasal y suplemente con factor diferenciado de 10 ng/ml factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA) o factor inhibitorio de leucemia de 10 ng/ml (LIF) y 2% B27.</li>
	<li>Utilice placas de cultivo de unión ultrabaja de 12 pocillos (3,5 cm2)y 6 placas de cultivo (9,6 cm2).</li>
</ol>2. Disección de Cerebellum
<ol><li>Anestetizar cachorros de ratón (P3-P7) con isoflurano y decapitar usando tijeras quirúrgicas.</li>
	<li>Rocíe la cabeza separada de los cachorros con 70% de etanol.</li>
	<li>Transfiera cada cabeza a un plato de cultivo estéril vacío de 10 cm. Separe la piel usando las tijeras de microdisección, luego retire el cráneo ejecutando las tijeras sagital a lo largo de la línea media.</li>
	<li>Usando #7 fórceps, despegue los huesos del cráneo comenzando caudalmente desde el tronco encefálico. Levante cuidadosamente el cerebro con una espátula, manteniendo el cerebelo intacto, y transfiera el cerebro a un plato fresco estéril de 10,0 cm que contiene 15 ml de solución de solución de sal equilibrada (HBSS) de Hanks helada.</li>
	<li>Coloque el plato que contiene el cerebro bajo un microscopio de disección. Usando #5 fórceps finos, retire las meninges y los vasos sanguíneos grandes del cerebelo y separe el cerebelo del tronco encefálico usando la espátula.</li>
	<li>Transfiera el cerebelo a un tubo centrífugo de 15 ml que contenga 5,0 ml de solución HBSS helada. Lavar el cerebelo enrredado y decantar 3 veces con 5,0 ml de HBSS. NOTA: Cada cerebelo debe colocarse en su propio tubo para su posterior procesamiento.</li>
</ol>3. Preparación de la suspensión celular
<ol><li>Después del último enjuague, añadir 5 ml de solución de disociación de tejido a base de papaína (basada en trabajos anteriores13,,18) que se haya precalentado a 37 oC. Incubar el tejido durante 15 min a 37 oC en un baño de agua. Mezcle lentamente el contenido invirtiendo el tubo hacia arriba y hacia abajo 3 veces cada 3 minutos, ya sea utilizando un mezclador de nueces o a mano.</li>
	<li>Prepare una pipeta Pasteur de diámetro ancho (pipeta de vidrio regular) y de diámetro estrecho (pulida al fuego calentando sobre un quemador Bunsen) como se describió anteriormente19.</li>
	<li>Lavar el tejido 3x con 5 ml de solución de HBSS, evitando la pérdida del tejido mientras se decanta a mano.</li>
	<li>Retire el último lavado de HBSS y agregue 5 ml de solución DPBS que contenga 250 ml de solución de DNase al tejido. Disociar el tejido triturando 10x–15x usando la pipeta Pasteur de diámetro ancho. Realice este paso suavemente para evitar la formación de burbujas.</li>
	<li>A continuación, incubar la suspensión durante 10 minutos adicionales a 37 oC en el baño de agua, mezclando invirtiendo y enderezando el tubo.</li>
	<li>Utilice la pipeta Pasteur de diámetro reducido para triturar aún más la suspensión de tejido 10x. Si quedan trozos grandes de tejido, presione las piezas de tejido contra la parte inferior del tubo con la punta de la pipeta suavemente y continúe pipeteando hasta que las células alcancen una suspensión fina.</li>
	<li>Incubar el tejido a 37oC durante 10 min adicionales, repitiendo los pasos de mezcla anteriores.</li>
</ol>4. Inmunoetiquetado de células madre
<ol><li>Coloque los tubos centrífugos sobre hielo y utilice soluciones heladas para los siguientes pasos. Colar las células disociadas a través de un colador de células de 40 m en un tubo centrífugo de 50 ml. Cubra el filtro con 10,0 ml de solución HBSS para asegurarse de que las celdas pasan a través de la malla en esta solución adicional.</li>
	<li>Transfiera las células filtradas a un tubo de centrífuga fresco de 15 ml y centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 10 min a 4 oC. Aspirar y desechar el sobrenadante completamente usando cuidadosamente un aspirador de vacío.</li>
	<li>Resuspenda el pellet en 160 ml de búfer de columna magnética. Para obtener la suspensión de una sola célula antes del etiquetado magnético, pase las células a través de una malla de nylon de 30 m para eliminar los grumos celulares, que de lo contrario pueden obstruir la columna.</li>
	<li>Añadir 40 ml de microperlas antiprominina-1 a cada tubo de 15 ml, mezclar e incubar en un refrigerador durante 15 minutos para que el anticuerpo se una a las células que expresan prominina-1.</li>
	<li>Lave las células agregando 1.0–2.0 mL de tampón de columna X y centrífuga a 300 x g durante 10 min. Apiratee completamente el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda el pellet en 1,0 ml del búfer de columna X. NOTA: Si se observan pequeños grumos después de la resuspensión de pellets con 1,0 ml de búfer de columna X, deben retirarse cuidadosamente utilizando una punta de la pipeta Pasteur, de lo contrario estos grumos pueden bloquear la columna magnética durante la clasificación celular.</li>
</ol>5. Preparación de columnas magnéticas, clasificación de celdas y chapado
NOTA: La separación magnética de diferentes condiciones de genotipo (enfermedad frente a control) debe realizarse al mismo tiempo, ya que cualquier retraso puede afectar a la morfología de la neuroesfera.
<ol><li>Prepare las columnas magnéticas colocándolas en el soporte magnético expuesto al campo magnético. Enjuague la columna una vez con 500 ml de tampón X aplicando el tampón que gotea en un tubo de centrífuga que se va a desechar. NOTA: Preparar nuevo búfer de columna magnética X para cada experimento; si no, entonces el rendimiento de las células madre será bajo.</li>
	<li>Aplique la suspensión de celda etiquetada en la columna. Recoger el flujo que contiene células no etiquetadas que consisten principalmente en células mixtas neuronales/gliales cerebelosas en tubos frescos de 15 ml(Figura 1A).</li>
	<li>Lavar la columna 3x con 500 l de tampón X (cada lavado tarda alrededor de 2-4 min). NOTA: El cultivo mixto neuronal/glial cerebeloso enriquecido con neuronas granulares cerebelosas puede servir como un subproducto útil de este paso de purificación.</li>
	<li>Retire la columna del campo magnético y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Añadir 1,0 ml de medio de cultivo (medio de la neurosfera) a la columna y empujar el émbolo en la columna para eliminar las células etiquetadas con cuentas prominina-1 en un tubo de halcón fresco de 1,5 ml.</li>
	<li>Para mejorar la pureza de las células etiquetadas con prominina-1, pase las células eluidas sobre una segunda columna siguiendo los pasos 5.1–5.4.</li>
	<li>Cuente las células con un hemocaquímetro. El rendimiento típico es de 107 células por cerebelo. Placar las células en placas de unión ultrabajas (6 o 12 pozos, basado en la densidad requerida para los experimentos aguas abajo).</li>
</ol>6. Passaging de las neuroesferas y la diferenciación
<ol><li>Placar las células madre con etiqueta prominina-1 en placas de unión ultrabaja 12 pocillos en medio de la neurosfera (5.000 células/pozo).</li>
	<li>Después de 7-10 días, las células se dividen para producir neuroesferas flotantes en forma de bola (nósferas primarias). NOTA: En este experimento, se generan neuroesferas secundarias que se expanden en números para su uso posterior. Las poblaciones de neuroesfera primaria no se utilizan para estos experimentos, ya que pueden contener células contaminantes que no tienen propiedades de células madre y pueden agruparse junto con las neuroesferas.</li>
	<li>Para el passaging, transfiera las neuroesferas primarias junto con los medios de cultivo utilizando puntas de pipeta de 1,0 ml a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml. Pellet las neuroesferas por centrifugación a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda el pellet en 5 ml de medios de disociación tisular que contenga papaína o solución de trippsina al 0,05%. Incubar a 37oC durante 10 min.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min. Resuspender las células en 5 ml de medio de la neurosfera y disociar las células mecánicamente utilizando una pipeta Pasteur de plástico y pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo 10x.</li>
	<li>Placa las células (de nuevo) en los medios de la neuroesfera como se describió anteriormente. Después de 7-10 días en el cultivo, la placa debe enriquecerse con neuroesferas secundarias. NOTA: Estos cultivos se pueden pasar hasta 8 veces con buena eficiencia, después de lo cual el tamaño de la neuroesfera tiende a ser más pequeño y sugiere una disminución en la proliferación.</li>
	<li>Cuente las células en el hemocitómetro y placa el número óptimo para futuros experimentos en placas recubiertas de poli-D-lisina (6 o 12 pozos).</li>
	<li>Para diferenciar las células madre, recoger las neuroesferas del segundo al octavo pasaje por centrifugación como se describió anteriormente, excepto añadir medio de diferenciación al pellet. NOTA: Después de 7 días in vitro, las células madre se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, como se demuestra mediante la tinción con el marcador neuronal de la tubulina,III marcador astrocítico GFAP y el fabricante de oligodendrocitos O4.</li>
</ol>

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</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Las células madre cerebelosas promininas-1 que expresan residen en la materia blanca prospectiva durante las primeras 3 semanas de vida postnatal. Su proliferación está estrechamente controlada por la vía sónica del erizo apoyada por las células de Purkinje17. Estas células madre / progenitores contribuyen a las interneuronas GABAérgicas de nacimiento posterior llamadas células de la cesta y células estelares. Estas interneuronas residen en la capa molecular, donde sinapsis en las células de Purki...

El cerebelo ha sido reconocido durante mucho tiempo como un circuito neuronal importante que coordina el movimiento voluntario1. Recibe la entrada de las amplias franjas de la neuroeje, que incluye información proprioceptiva de la periferia, con el fin de afinar la salida del motor y coordinar el movimiento. Más recientemente, también se ha implicado en la regulación de la cognición y las emociones mediante el uso potencial de redes de procesamiento de información similares2,3,4.
El cerebelo adulto se compone de una corteza cerebelosa externa y materia blanca interna. Intercalados dentro de estas estructuras son núcleos intracentesis retorcedos profundos. Al igual que el resto del sistema nervioso, el desarrollo del cerebelo es impulsado por la proliferación de células progenitoras multipotentes (células madre) que migran y se diferencian para producir esta estructura bien organizada. En desarrollo temprano (E10.5–E13.5), un nicho de tallo ventricular alrededor del cuarto ventrículo en desarrollo genera neuronas GABAérgicas (es decir, células Purkinje, células Lugaro, células Golgi) junto con Bergmann glia5,,6,7,8.
Más tarde en desarrollo (semana postnatal uno), un segundo nicho de células madre en el labio rombico genera progenitores QUE expresan MATH1- y Nestin que dan lugar a neuronas de gránulos excitatorios99,10,,11,,12. Recientemente se ha descrito un tercer nicho de células madre13. Estas células expresan prominina-1 (también conocida como CD133), una glicoproteína que abarca membranas y define un subconjunto de células madre en el intestino y los sistemas hematopoyéticos14,,15,,16. El mapeo del destino in vivo muestra que estas células madre generan interneuronas clave de capa molecular (es decir, células de cesta y células estelares), junto con astrocitos, durante las tres primeras semanas postnatales. En el pasado, ha sido difícil estudiar estas células in vitro porque los métodos anteriores han requerido técnicas costosas y que consumen mucho tiempo (es decir, clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]) que dependen de la tinción de prominina-112,13,17. Este protocolo describe un método basado en inmunomagnética para el aislamiento de estas células madre que luego se puede cultivar y diferenciar fácilmente.

<table><tbody><tr><td>0,05%Tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific 25300054</td><td></td><td>0,05%</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>solución de EDTA de 2</td><td>mM Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas anti-Prominina-1</td><td>Miltenyi Biote</td><td>130-092-333</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Columna MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo ultra - low attachment</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>DNasa</td><td>Sigma</td><td>D4513-1VL</td><td>250 U/ml</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Tampón de fosfato solución salina</td><td>Fisher Scientific</td><td>14040141</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank-HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano</td><td>Promega</td><td>G507A</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico recombinante humano</td><td>Promega</td><td>G502A</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>Factor inhibidor de la leucemia</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td></td></tr><tr><td>l-glutamina</td><td>Gibco</td><td>Microscopía 25030081</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía</td> confocal <td></td><td></td><td>Lieca TCS SP5</td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1 para ratones</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-1331</td><td>1 en 100</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Abcam</td><td>ab27952</td><td>1 en 200</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>O4</td><td>Millopore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento derivado de plaquetas</td><td>Sigma</td><td>H8291</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubulina de conejo, b-III</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>1 en 500</td></tr><tr><td>Rabit anti-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1 en 500</td></tr><tr><td>Columnas de separación-Columnas MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>40 &mu; m</td></tr></tbody></table>

purificación de prominin-1+ células madre del cerebelo de ratón postnatal

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

La mayoría de las neuronas cerebelosas surgen de dos nichos de tallo embrionario: un nicho de labio rombio, que genera todas las neuronas glutamatérgicas excitatorias cerebelosas, y un nicho de zona ventricular, que genera las células purines gecolégicas inhibitorias, que son neuronas que constituyen los núcleos cerebelosares profundos y Bergman glia. Recientemente, se ha descrito un tercer nicho de células madre que surge como una zona germinal secundaria del nicho de la zona ventricular. Las células de este nicho se definen por el marcador de superficie celular prominina-1 y se localizan a la materia blanca en desarrollo del cerebelo postnatal. Este nicho representa la capa molecular de nacimiento tardío interneuronas GABAérgicas junto con astrocitos cerebelos generados posnatalmente. Además de su papel de desarrollo, este nicho está ganando importancia traslacional en cuanto a su participación en la neurodegeneración y la tumorigenesis. La biología de estas células ha sido difícil de descifrar debido a la falta de técnicas eficientes para su purificación. Aquí se muestran métodos eficientes para purificar, cultivar y diferenciar estas células madre cerebelosas posnatales.

Las células madre cerebelosas posnatales promininas-1 positivas formaron neuroesferas en neuroesferas medianas ricas en factores de crecimiento (EGF y bFGF). Estas neuroesferas fueron positivas para la prominina-1-tinción, el marcador utilizado para el aislamiento, y también como una mancha para otros marcadores de células madre como Nestin y GFAP13 (Figura 1). La expresión del marcador de células madre se mantuvo durante todo el cultivo y hasta por lo menos ocho pasa...

Aquí se muestra un método eficiente y rentable para purificar, cultivar y diferenciar las células madre de la materia blanca del cerebelo del ratón postnatal.

Purificación de Prominin-1+ Células Madre del Cerebelo de Ratón Postnatal

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Este protocolo describe un método fácil y rentable para purificar las células madre del cerebelo postnatal. Estas células madre representan las interneuronas molecularmente incomprensibles que han nacido en el difunto, pero también representan astrocitos cerebelosos derivados postnatalmente. Por lo tanto, el estudio de estas células es claramente importante para entender el desarrollo del cerebelo.Usando este protocolo, el rendimiento de las células madre es comparable al de la estrategia basada en FACS que es típicamente 10 veces más caro. Este protocolo se puede generalizar para extraer prominin-1 expresando células madre de otros tejidos como el intestino y la médula ósea. Comience colocando el plato con el cerebro bajo un microscopio de disección.Utilice fórceps número cinco finos para extraer las meninges y los vasos sanguíneos grandes del cerebelo, luego separe el cerebelo del tronco encefálica usando la espátula. Transfiera el cerebelo a un tubo centrífugo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de solución HBSS helada. Enjuáguelo y decantar el HBSS.Repita el lavado dos veces más. Después del último enjuague, agregue cinco mililitros de solución de disociación de teji

purification-of-prominin-1-stem-cells-from-postnatal-mouse-cerebellum

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí presentamos un método para aislar y cultivar cerebelosa gránulo células progenitoras de neuronas y las neuronas del cerebelo gránulo de ratón postnatal.

Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas

Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para aggitation tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido nerual se explica.

Generación de un solo suspensiones de células de tejido de ratón Neural

Este video muestra el aislamiento y cultivo de células progenitoras neurales cerebelosas del cerebelo de un cachorro de ratón. Los progenitores de las neuronas granulosas cerebelosas se aíslan y purifican a través de la adhesión diferencial, eliminando eficazmente los astrocitos. Estos progenitores cultivados se diferencian posteriormente en neuronas granulosas cerebelosas.

Aislamiento y cultivo de progenitores granulares de neuronas cerebelosas murinas

Este video muestra un método para aislar células madre del cerebelo postnatal del ratón y diferenciarlas en células neuronales. Las células madre de la suspensión celular aislada se purifican utilizando perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos y se cultivan para formar neuroesferas. A continuación, las neuroesferas se mantienen en un medio de diferenciación para generar células neuronales.

Aislamiento de células madre del cerebelo postnatal de ratón y diferenciación en células neurales

El fibroblasto embrionario de ratón puede ser reprogramado en células madre pluripotentes inducidas con baja eficiencia mediante la expresión forzada de los factores de transcripción Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Los raros intermediarios de la reacción de reprogramación son los FACS aislados mediante marcaje con anticuerpos contra los fabricantes de superficie celular Thy-1.2, Ssea-1 y Epcam.

Marcador de superficie celular mediada Purificación de iPS intermedios célula de un modelo reprogramable Ratón

Progenitores nestina que expresan son una población recientemente identificado de progenitores neuronales en el cerebelo en desarrollo. Utilizando la técnica de microdisección se presenta aquí en combinación con la clasificación de células activadas por fluorescencia-, esta población de células puede purificarse sin contaminación de otras regiones del cerebelo y puede ser cultivado para estudios posteriores.

El aislamiento de las poblaciones celulares distinto del cerebelo en desarrollo por Microdissection

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Presentamos un protocolo para la extracción de pericitas cerebrales murinas. Basado en una extracción de pericita orientada al enriquecimiento libre de antibióticos, este protocolo es una herramienta valiosa para estudios in vitro que proporcionan alta pureza y alto rendimiento, disminuyendo así el número de animales experimentales utilizados.

Un método de alta salida para aislar los pericytes cerebrales del ratón

Este protocolo describe un sistema de cultivo dinámico para producir agregados de tamaño controlado de células madre pluripotentes humanas y estimular aún más la diferenciación en organoides cerebelosos en condiciones definidas químicamente y libres de alimentadores utilizando un biorreactor de un solo uso.

Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

Aquí, presentamos un protocolo de electroporación in vitro reproducible para la manipulación genética de precursores primarios de células granulares cerebelosas (GCP) que es rentable, eficiente y viable. Además, este protocolo también demuestra un método sencillo para el estudio molecular de las vías de señalización de Hedgehog dependientes del cilio primario en células GCP primarias.

Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares

Aprende a purificar células madre Prominin-1+ del cerebelo postnatal de ratón mediante un protocolo sencillo y económico. Este método permite estudiar el desarrollo cerebeloso y enfermedades como la ataxia espinocerebelosa.

Purificación de Prominin-1⁺ Células Madre del Cerebelo de Ratón Postnatal

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