Name: Uso del análogo de pirimidina, 5-yodo-2′-desoxiuridina (IdU) con marcadores de ciclo celular para establecer fases del ciclo celular en una plataforma de citometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a analizar el ciclo celular a nivel de célula única mediante citometría de masas con IdU. Este método sencillo permite estudiar células madre y progenitoras en leucemia mieloide aguda.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer los esfuerzos de Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang y Justin Lyeberger por su apoyo experimental. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas Pelotonia. Todas las opiniones, hallazgos y conclusiones expresadas en este material son las del autor (s) y no reflejan necesariamente las del Programa de Becas Pelotonia.

<ol><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li>
<li>Ornatsky, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+cell+antigens+and+intracellular+DNA+by+identification+of+element-containing+labels+and+metallointercalators+using+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Raval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+Defective+Hematopoiesis+Caused+by+Telomere+Shortening+in+Telomerase+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice.</a> PLoS One. 10 (7), 0131722(2015).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometric+Functional+Profiling+of+Acute+Myeloid+Leukemia+Defines+Cell-Cycle+and+Immunophenotypic+Properties+That+Correlate+with+Known+Responses+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).</li>
<li>Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+tri-molecular+biosynthesis+with+cell+identity+and+function+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1185(2019).</li>
<li>Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-Hoechst+flow+cytometry%3A+a+unique+tool+for+quantitative+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis.</a> Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).</li>
<li>Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+reduces+nonspecific+eosinophil+staining+artifacts+in+mass+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments.</a> Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e54394(2017).</li>
<li>Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by Mass Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).</li>
<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4398(2012).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 10, Unit10 17(2010).</li>
<li>Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+time+and+temperature+on+cell+cycle+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry.</a> Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).</li>
<li>Campos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunological+markers+on+leukemic+cells+before+and+after+cryopreservation+and+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing.</a> Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).</li>
<li>Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+delineation+of+immune+cell+subpopulations+in+tumor+specimens+as+determinated+by+multiparametric+single+cell+mass+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis.</a> BMC Immunology. 18 (1), 6(2017).</li>
<li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+procurement%2C+storage%2C+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology%2C+biorepository%2C+and+biobank+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li>
</ol>

El Dr. Behbehani recibe apoyo de viaje de Fluidigm. Fluidigm también ha comprado reactivos y materiales para uso en laboratorio.

Los ejemplos presentados aquí demuestran cómo utilizar una plataforma MCM para analizar la distribución del ciclo celular. También se ha demostrado que el análisis del ciclo celular es sensible a condiciones experimentales como el tiempo y la temperatura, lo cual es una consideración importante que los investigadores deben tener al considerar MCM para su análisis del ciclo celular14. Las muestras almacenadas durante un corto período de tiempo, no más de una hora, tendrán una incorporación de IdU c...

La citometría de masas permite la detección de aproximadamente 40 parámetros aprovechando la alta resolución y la naturaleza cuantitativa de la espectroscopia de masas. Se utilizan anticuerpos marcados con metales en lugar de anticuerpos conjugados fluoróforos que permiten un mayor número de canales y producen un derrame mínimo 1,2. MCM tiene ventajas y desventajas con respecto al análisis del ciclo celular en comparación con la citometría de flujo. Una ventaja importante de MCM es que el gran número de parámetros permite la medición simultánea del estado del ciclo celular a través de un gran número de tipos de células T inmunofenotípicamente distintos en muestras altamente heterogéneas. MCM se ha utilizado con éxito para medir el estado del ciclo celular durante la hematopoyesis normal en médula ósea humana3 y modelos murinos transgénicos de deficiencia de telomerasa4. El análisis del estado del ciclo celular en la leucemia mieloide aguda (LMA) mostró que el ciclo celular se correlacionó con respuestas conocidas a terapias clínicas, proporcionando una visión in vivo de las características funcionales que pueden informar las selecciones de terapia5. Una segunda ventaja del análisis del ciclo celular citométrico masivo es la capacidad de medir un gran número de otros marcadores funcionales que pueden estar correlacionados con el estado del ciclo celular. Trabajos recientes han podido correlacionar la síntesis de proteínas y ARN con el estado del ciclo celular mediante el uso de IdU y anticuerpos marcados con metales contra BRU y rRNA6. Este tipo de análisis altamente paramétrico que mide el estado del ciclo celular en numerosas poblaciones en un continuo de diferenciación sería casi imposible con la tecnología actual de citometría de flujo. La principal desventaja de MCM es la falta de tinciones de ADN o ARN comparables a las utilizadas en la citometría de flujo fluorescente (por ejemplo, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Los colorantes fluorescentes pueden dar mediciones relativamente precisas del contenido de ADN y ARN, pero esta precisión solo es posible debido a los cambios en las propiedades fluorescentes de estos colorantes que ocurren al intercalar entre las bases de nucleótidos. Por lo tanto, el análisis MCM no puede medir el contenido de ADN o ARN con una precisión similar. En cambio, el análisis del ciclo celular citométrico masivo se basa en mediciones de proteínas relacionadas con el estado del ciclo celular, como la ciclina B1, la proteína de retinoblastoma fosforilada (pRb) y la histona fosforilada H3 (pHH3) combinada con la medición directa del átomo de yodo a partir de la incorporación de IdU en células de fase S. Estos dos enfoques de medición producen resultados muy similares durante la proliferación celular normal, pero pueden ser potencialmente discordantes cuando se interrumpe la progresión del ciclo celular.
La medición del número de células en cada fase del ciclo celular es importante para comprender el desarrollo normal del ciclo celular, así como la interrupción del ciclo celular, que se observa comúnmente en cánceres y enfermedades inmunológicas. MCM proporciona una medición confiable de factores extracelulares e intracelulares utilizando anticuerpos marcados con metales; sin embargo, la medición de la fase S fue limitada ya que el intercalador de ADN basado en iridio no pudo diferenciar entre el ADN 2N y 4N. Para definir las fases del ciclo celular, Behbehani desarrolló un método que utiliza IdU con una masa de 127, que cae dentro del rango del citómetro de masas y permite la medición directa de células en la fase S3. Esta medición directa evita la necesidad de anticuerpos secundarios o el uso de agentes desnaturalizantes del ADN como ácido o DNasa. Junto con marcadores de ciclo intracelular, permite una alta resolución de la distribución del ciclo celular en modelos experimentales.
Este protocolo adapta las mediciones del ciclo celular de los protocolos comunes de citometría de flujo para MCM. Nuestros métodos proporcionan una manera conveniente y sencilla de incluir parámetros del ciclo celular. La incorporación de IdU de muestras in vitro requiere solo de 10 a 15 minutos de incubación a 37 °C, que es más corto que la mayoría de los protocolos de tinción BrdU que recomiendan tiempos de incubación de varias horas 3,7. Las muestras incorporadas a IdU y BrdU pueden fijarse utilizando un estabilizador proteómico y luego almacenarse durante algún tiempo en un congelador de -80 °C. Esto permite archivar un gran número de muestras teñidas con IdU para el análisis por lotes sin reducir la calidad de la muestra.

<table><tbody><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td>Componente de la</td></tr><tr><td>centrífuga</td> CSM <td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>Centrifugación</td></tr><tr><td>de muestras Cleftd-PARP (D214)</td><td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>Identificación de células apoptóticas</td></tr><tr><td>Ciclina B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 Resolución</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Cryopconservtive</td></tr><tr><td>EQ Cuentas de calibración de cuatro elementos</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Estándar de metal interno para el rendimiento de CyTOF</td></tr><tr><td>Tubo FACS con filtro de malla</td><td>Corning</td><td>08-771-23</td><td>Colador de células para eliminar grumos/residuos antes de la ejecución de CyTOF</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085 Suplemento de crecimiento de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Sistema/Plataforma CyTOF</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Aditivo de tinción para prevenir tinciones inespecíficas</td></tr><tr><td>IdU (5-Iodo-2&prime;-desoxiuridina)</td><td>Sigma</td><td>I7125</td><td>Incorpora en fase S</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences</td><td>SolA15</td><td>Confirmación de G0/G1</td></tr><tr><td>MaxPar Multi Label Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>Kit de etiquetado de metales, fija metales a los anticuerpos</td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>Mezcla de muestras durante la tinción</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Servicios de Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td>Fijador</td></tr><tr><td>pentametilciclopentadienil-Ir(III)-dipiridofenazina</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>Identificación de células durante la adquisición de CyTOF</td></tr><tr><td>p-H2AX (S139)</td><td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>Detección de daños en el ADN</td></tr><tr><td>p-HH3 (S28)</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td><td>Resolución de fase M</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada de fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Solución de lavado para cultivo celular y componente de solución fijadora</td></tr><tr><td>p-Rb (S807/811)</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td> Estabilizador proteómico de <td>resolución G0/G1</td></tr><tr><td></td><td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>Fijador de muestras</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076 Medio de</td><td>crecimiento para cultivos</td></tr><tr><td>celulares Azida de sodio</td><td>Acros Organics</td><td>AC447810250</td><td>componente de CSM/Tampón de anticuerpos, biocida</td></tr></tbody></table>

uso del análogo de pirimidina, 5-yodo-2′-desoxiuridina (idu) con marcadores de ciclo celular para establecer fases del ciclo celular en una plataforma de citometría de masas

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

La regulación de la fase del ciclo celular es un aspecto importante de la proliferación celular y la homeostasis. La interrupción de los mecanismos reguladores que rigen el ciclo celular es una característica de una serie de enfermedades, incluido el cáncer. El estudio del ciclo celular requiere la capacidad de definir el número de células en cada porción de la progresión del ciclo celular, así como de delinear claramente entre cada fase del ciclo celular. El advenimiento de la citometría de masas (MCM) proporciona un enorme potencial para el análisis de células individuales de alto rendimiento a través de mediciones directas de isótopos elementales, y el desarrollo de un método para medir el estado del ciclo celular por MCM amplía aún más la utilidad de MCM. Aquí describimos un método que mide directamente la 5-yodo-2′-desoxiuridina (IdU), similar a la 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), en un sistema MCM. El uso de este MCM basado en IdU proporciona varias ventajas. En primer lugar, IdU se incorpora rápidamente en el ADN durante su síntesis, lo que permite una medición fiable de las células en la fase S con incubaciones tan cortas como 10-15 minutos. En segundo lugar, IdU se mide sin la necesidad de anticuerpos secundarios o la necesidad de degradación del ADN. En tercer lugar, la tinción de IdU se puede combinar fácilmente con la medición de ciclina B1, proteína de retinoblastoma fosforilada (pRb) e histona fosforilada H3 (pHH3), que colectivamente proporciona una delineación clara de las cinco fases del ciclo celular. La combinación de estos marcadores de ciclo celular con el alto número de parámetros posibles con MCM permite la combinación con muchas otras métricas.

Utilizando células HL-60 y un aspirado de médula ósea humana, es posible mostrar cómo las condiciones experimentales pueden afectar la distribución y el análisis del ciclo celular. En primer lugar, se debe establecer la estrategia de compuerta para demostrar cómo se derivan las fases del ciclo celular. En la Figura 1 mostramos el establecimiento de la puerta singlete, que es importante para separar los desechos celulares y los dobletes, estableciendo una población unicelular. Para las líneas...

Este protocolo adapta las mediciones del ciclo celular para su uso en una plataforma de citometría de masas. Con las capacidades multiparamétricas de la citometría de masas, la medición directa de la incorporación de yodo permite la identificación de células en fase S, mientras que los marcadores de ciclo intracelular permiten la caracterización de cada estado del ciclo celular en una variedad de condiciones experimentales.

Uso del análogo de pirimidina, 5-yodo-2′-desoxiuridina (IdU) con marcadores de ciclo celular para establecer fases del ciclo celular en una plataforma de citometría de masas

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Este protocolo nos permite examinar el ciclo celular a nivel de célula única utilizando el citómetro de masas, y esto permite realizar varias investigaciones y estudios clínicos novedosos. La principal ventaja de esta técnica es su simplicidad. IdU se agrega directamente a las células y no hay necesidad de tratamiento adicional o anticuerpos.Hemos utilizado esta técnica para investigar el estado del ciclo celular en pacientes con leucemia mieloide aguda dentro de los compartimentos de células madre y progenitoras. Y esto demostró que las propiedades del ciclo celular de estos tipos específicos de células pueden correlacionarse con el resultado clínico de los pacientes con estas enfermedades. Esta técnica puede ser útil para comprender las propiedades de crecimiento de las células cancerosas raras y comprender la proliferación de subconjuntos de células inmunes.Antes y después de agregar IdU a las muestras celulares, mantenga las células en las condiciones de crecimiento de interés. En este caso, una incubadora humidificada de 37 grados centígrados al 5% de CO2 para etiquetar las células con IdU, diluye la solución madre concentrada de IdU de uno a 50 en los medios de crecimiento de las células. Luego transfiera las muestras a una campana de bioseguridad y agregue 10 microlitros de un IdU milimolar a cada mililitro de células.Devuelva las células a la incubadora durante 10 a 15 minutos antes de transferir las muestras a tubos cónicos individuales. Recoger las células por centrifugación en tubos cónicos de 15 mililitros y resuspender los pellets en 200 microlitros de PBS por tubo. Si es necesario, etiquete las células con una tinción viva / muerta apropiada para marcar las células muertas.Después de la tinción viva / muerta, apagar las células con medios lavados con CSM antes de fijar las células con 25 microlitros de paraformaldehído al 16%. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, recoger las células por centrifugación. Agregue de cinco a 15 mililitros de CSM y centrifugar nuevamente.Resuspender los pellets en 500 microlitros de medio de tinción celular suplementado con 10% de sulfóxido de dimetilo. Luego transfiera las células a tubos más pequeños para almacenarlas en 80 grados centígrados negativos. Para normalizar el análisis del ciclo celular, importe los archivos en un programa de software de análisis de citometría de flujo apropiado y cree una gráfica biaxial de la duración del evento frente al iridio 191.Las células formarán una población distinta de iridio brillante alto. Cambie la escala de longitud de eventos para que las celdas aparezcan más prominentes. Luego cree una puerta singlete para excluir del 50 al 60% de los dobletes y escombros y establezca los parámetros gaussianos residuales y compensados para eliminar cualquier doblete y escombro restante.Para establecer la puerta de fase S, cree una gráfica biaxial de IdU frente a un marcador de proliferación. Las células positivas para IdU en fase S formarán una población distinta. Para G0/G1 y G2/M, establezca las puertas en una gráfica IdU versus ciclina B1.La fase G0/G1 será ciclina B1 baja, IdU negativa, y la fase G2/M será ciclina B1 alta, IdU negativa. Para establecer la puerta de entrada para tipos de células específicos, trace solo las celdas de fase S en el gráfico de ciclina B1 versus IdU para ayudar a establecer la separación entre las células de fase G0 / G1 y las células de fase G2 / M. Dibuje una puerta alrededor de la alta población de ciclina B1.En algunos casos, esto puede ser difícil de discernir, pero el nivel de ciclina B1 de aproximadamente el 5% superior de la población de la fase S es típicamente el punto de ruptura entre las puertas de fase G0 / G1 y G2 / M. Las celdas que residen dentro de la puerta anterior serán la población de la fase G2/M, mientras que el resto será la población de la fase G0/G1. Para establecer la población de fase G0, cree una gráfica de proteína de retinoblastoma fosforilada versus IdU.La fase G0 estará representada por una proteína de retinoblastoma fosforilada baja en población IdU negativa. Como la población ciclista activa demostrará una proteína de retinoblastoma fosforilada alta y la incorporación de IdU, la puerta de fase G0 se puede dibujar en este límite, ya que normalmente se expresa en dos poblaciones distintas. Si la puerta G0 es difícil de definir, convierta la población de fase S en la población activa y dibuje una puerta que incorpore el 90 a 100% superior de la proteína de retinoblastoma fosforilada de alta población.La proteína de retinoblastoma fosforilada de baja población fuera de la puerta es típicamente la población G0, mientras que las células G0/G1 con niveles de pRb que caen en esta puerta son células G1. Para la activación en fase M, cree una IdU versus histona fosforilada H3 por gráfica axial. La fase M se observará como la fracción muy pequeña de células dentro de la población fosforilada de histonas H3.Las células en la población G2/M con niveles más bajos de pHH3 son las células G2. Si la incorporación de IdU falló o no fue posible, defina las fracciones celulares cíclicas y no cíclicas utilizando Ki67 y la proteína retinoblastoma fosforilada. La población doble positiva representará la población ciclista activa correlacionada con las fases G1, S, G2 y M.La población doble baja representará la población no ciclista correlativa a la fase G0. Una vez que se hayan establecido todas las puertas, exporte los valores numéricos de las puertas. Los porcentajes en cada ciclo se pueden lograr restando las poblaciones individuales de las poblaciones combinadas para generar valores numéricos para cada fase individual del ciclo celular para su posterior graficación y análisis estadístico.El establecimiento de la puerta singlete es importante para separar los desechos celulares y dobletes para permitir el aislamiento de la población unicelular. A continuación, se puede realizar el análisis del ciclo celular de las células individuales. El etiquetado de IdU y, por lo tanto, el análisis del ciclo celular posterior pueden verse afectados significativamente por el tiempo y la temperatura.Por ejemplo, las células que permanecen demasiado tiempo en recipientes cerrados o en transporte entre ubicaciones tendrán fracciones reducidas de fase S y eso no será preciso para el análisis del ciclo celular. Las muestras de células mantenidas durante períodos cortos de una hora o menos todavía demuestran una distribución normal del ciclo celular, lo que indica que un transporte rápido puede no afectar negativamente el análisis. Las células criopreservadas pueden requerir un largo período de equilibrio antes de que las células vuelvan al ciclo celular activo, lo que aún puede no reflejar el estado del ciclo celular previo a la criopreservación.Los diferentes tipos de células también pueden verse afectados diferencialmente por las condiciones de mantenimiento. Por ejemplo, en esta muestra de médula ósea humana, las células T demostraron una reducción en el número de células en comparación con los monoblastos de la misma muestra. Otro beneficio de la citometría de masas es la capacidad de discriminar células en la detención del ciclo celular o que tienen una distribución anormal del ciclo celular.Una ventaja importante de esta técnica es que es fácilmente compatible con otras mediciones de citometría de masas, como el fenotipado de superficie, la estructura de la cromatina, el estímulo de citoquinas intracelulares, que se puede correlacionar con el estado del ciclo celular. Hemos utilizado esta técnica para estudiar el agotamiento de las células inmunes, la senescencia y para demostrar que la respuesta a la quimioterapia en pacientes con leucemia aguda puede correlacionarse con las propiedades del ciclo celular de las células leucémicas.

use-pyrimidine-analog-5-iodo-2-deoxyuridine-idu-with-cell-cycle

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Hemos derivado una estrategia para detectar la incorporación secuencial de los análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de ratones adultos para cuantificar dos rondas sucesivas de la división celular. Esta estrategia es útil para detectar la renovación celular de larga duración, los tejidos, la transformación oncogénica, o células de amplificación de tránsito.

Detección por inmunofluorescencia de dos análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de Primaria

Determinar la posición del ciclo celular de una población de células, o la comprensión de cómo afectan a la proliferación de señales, puede ser fácilmente medido por citometría de flujo utilizando este protocolo. Se presenta un enfoque simple experimental para la tinción de células y la cuantificación de su posición en el ciclo celular.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

Rastreo cambios sutiles en la progresión y la cinética de las fases del ciclo celular puede llevarse a cabo mediante el uso de una combinación de marcaje metabólico de los ácidos nucleicos con BrdU y tinción de ADN genómico total a través de yoduro de propidio. Este método evita la necesidad de sincronización química de ciclo de las células, impidiendo así la introducción de daño en el DNA no específico, que a su vez afecta a la progresión del ciclo celular.

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

Este vídeo describe el protocolo para la tinción de inmunofluorescencia BrdU. La técnica permite la identificación de células en diferentes fases del ciclo celular. La adición de colorantes de ADN y el marcaje de anticuerpos permite el análisis detallado del destino de las células de la fase S en momentos posteriores.

Tinción de inmunofluorescencia BrdU: una técnica para identificar células en diferentes fases del ciclo celular

El video demuestra un enfoque basado en inmunofluorescencia para cuantificar el estrés de replicación en células cancerosas. Las células tratadas con hidroxiurea producen ADN monocatenario, detectado a través de inmunofluorescencia. El recuento de focos de fluorescencia verde indica el nivel de estrés de replicación en las células cancerosas.

Un método basado en inmunofluorescencia para cuantificar el estrés de replicación en células cancerosas

Este protocolo describe el uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir la absorción de la seguimiento temporal de las células que estaban en fase S en un punto específico en el tiempo. La adición de colorantes de ADN y el etiquetado de anticuerpos facilita el análisis detallado del destino de las células en fase S en épocas posteriores.

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

Aquí, describimos cómo estudiar la localización mitocondrial de una quinasa (ciclo celular) y cómo determinar su ubicación submitocondrial, así como los posibles sustratos/objetivos mitocondriales. La expresión forzada de proteínas en las mitocondrias proporciona una herramienta útil para estudiar las consecuencias funcionales de la localización mitocondrial de una proteína de interés.

Los enfoques experimentales para estudiar mitocondrial localización y función de un ciclo celular quinasa nuclear, Cdk1

En el presente protocolo, demostramos cómo visualizar la resección final de doble cadena de ADN durante la fase S / G2 del ciclo celular utilizando un método basado en inmunofluorescencia.

Evaluación de la resección final global de DOBLE cadena de ADN utilizando el etiquetado brdU-DNA junto con imágenes de discriminación del ciclo celular

El análisis del ciclo celular con etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) y fosfo-histona H3 (pH3) es un procedimiento de varios pasos que puede requerir una optimización extensa. Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe todos los pasos para este procedimiento, incluido el análisis de imágenes y la cuantificación para distinguir las células en diferentes fases del ciclo celular.

Protocolo de doble marcado de 5-etinil-2'-desoxiuridina/fosfo-histona H3 para el análisis de progresión del ciclo celular en células madre neurales de Drosophila

Describimos dos protocolos complementarios para determinar con precisión la duración de la fase S en S. cerevisiae utilizando EdU, un análogo de la timidina, que se incorpora in vivo y se detecta mediante química Click por microscopía y citometría de flujo. Permite la fácil caracterización de la duración de la replicación del ADN y los defectos de replicación pasados por alto en los mutantes.

Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a analizar el ciclo celular a nivel de célula única mediante citometría de masas con IdU. Este método sencillo permite estudiar células madre y progenitoras en leucemia mieloide aguda.

Uso del análogo de pirimidina, 5-yodo-2′-desoxiuridina (IdU) con marcadores de ciclo celular para establecer fases del ciclo celular en una plataforma de citometría de masas (Video) | JoVE Journal

Uso del análogo de pirimidina, 5-yodo-2′-desoxiuridina (IdU) con marcadores de ciclo celular para establecer fases del ciclo celular en una plataforma de citometría de masas

Explorar más videos