Cultivo de microalgas y cuantificación de biomasa en un fotobiorreactor a escala de banco con gases de combustión corrosivos

Este protocolo detalla las adaptaciones de los equipos fotobiorreactores necesarias para cultivar microalgas con gases corrosivos y analiza el funcionamiento seguro y el muestreo del fotobiorreactor. Los fotobiorreactores proporcionan el control necesario para experimentos microalgas fiables y reproducibles. Este sistema de báscula de sobremesa se puede utilizar para estudiar las características y la productividad de las microalgas cultivadas con emisiones de combustión simuladas.

Este método se puede utilizar con otros biorreactores cuidadosamente adaptados o para cultivar otros microorganismos fotoautotróficos. La demostración visual de este método es fundamental porque es un protocolo complejo que evita la exposición humana a las emisiones de combustión simuladas tóxicas utilizadas para el cultivo de microalgas. Para empezar, modele la posible concentración acumulada de gases tóxicos en la habitación si la campana de humo fallara.

Utilice la hoja de cálculo de modelado matemático IH Mod de la Asociación Americana de Higiene Industrial para cada gas. Desde el personal de mantenimiento de HVAC del edificio o el técnico de HVAC, obtenga Q, el suministro de la habitación o la tarifa de aire de escape en metros cúbicos por minuto. Calcular el volumen, V, del laboratorio en metros cúbicos.

Calcular la tasa de emisión de contaminantes, G, de cada tipo de gas tóxico en miligramos por minuto utilizando la ecuación adaptada de la Ley De Gas Ideal donde P es la fracción de presión ejercida por el gas tóxico en un ATM, el gas Q es el caudal del gas en litros por minuto, R es la constante de gas universal, T es la temperatura en Kelvin , y MW es el gas'peso molecular en gramos por lunar. Utilice los valores de V, Q y G para cada gas en el modelo de habitación bien mezclado con la opción de cesar la generación y modelar el algoritmo de purga de sala en la hoja de cálculo IH Mod para calcular las concentraciones de gas de habitación acumuladas para cada gas durante un período de simulación de 24 horas. Compare estos valores con los límites de exposición.

Configurar un sistema de monitoreo de gases tóxicos con sensores para cada uno de los gases tóxicos en uso. Calibre los sensores de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prueba de golpes con frecuencia.

Localice el monitor de gas justo fuera de la campana de humos. Antes del experimento, asegúrese de que todo el personal sea instruido sobre las respuestas apropiadas a una alarma de gas tóxico. Ahora, prepare 100 mililitros cada uno de un hidróxido de sodio normal y un ácido clorhídrico normal en dos botellas de solución de entrada de 250 mililitros.

Almacene las soluciones de entrada medidas en botellas tapadas autoclaveables equipadas con tubos de inmersión y un tubo de ventilación con un filtro de aire estéril en línea. Conecte los tubos de inmersión a dos de los cuatro puertos de entrada del fotobiorreactor mediante tubos autoclaveables. Inserte y atornille el dedo frío y el condensador de escape en la placa de cabeza del fotobiorreactor.

Inserte el puerto de inoculación y atornille firmemente en su lugar. Añada una longitud de tubo autoclaveable a la sección del puerto de inoculación por encima de la placa de cabeza del fotobiorreactor. Antes de autoclaver el biorreactor, sujete el tubo cerrado con una abrazadera de host autoclaveable.

Conecte el tubo tapado con filtros estériles a cualquier puerto de fotobiorreactor no utilizado. Añadir 1,5 litros de medio de cultivo. Autoclave el reactor y las soluciones de entrada asociadas durante 30 a 45 minutos a 121 grados Centígrados.

Pase el tubo autoclaveable de 1,6 milímetros de diámetro interior entre las soluciones de entrada y sus puertos a través de bombas peristálticas separadas. Fije el motor del impulsor al eje del impulsor y apriete el accesorio. Organice los paneles de luz LED simétricamente fuera del biorreactor de acuerdo con los requisitos de iluminación.

Conecte los reguladores adecuados capaces de 20 PSI de presión de salida a los cilindros de gas. Fije el tubo resistente a la presión de seis milímetros de diámetro interior a la barra de la manguera de salida del regulador y asegúrelo con una abrazadera de manguera. Fije el otro extremo del tubo resistente a la presión a la entrada de gas de la torre reguladora de gas utilizando una púa de manguera a un accesorio de conexión rápida de seis milímetros asegurado con una abrazadera de manguera.

Conecte el tubo de 3,2 milímetros de diámetro interior a la salida de gas de la torre de regulación de gas mediante el accesorio de conexión rápida de seis milímetros y conecte el otro extremo del tubo de salida al puerto del anillo de esparcimiento en la placa de cabezal del fotobiorreactor. Ajuste la presión de salida a 20 PSI en cada regulador de gas. En la interfaz del biorreactor, establezca los caudales de gas experimentales.

Utilice la función STIRR para establecer una velocidad de rotación del impulsor lo suficientemente rápida como para que el medio de cultivo asimile las burbujas de gas espáginas. Después del autoclavado, monte el fotobiorreactor y los cilindros de gas dentro de una campana de humos. Coloque el fotobiorreactor sobre una mesa dentro de un recipiente secundario y coloque los cilindros de gas en córqueles de cilindros independientes o en un estante de cilindros.

Después de iniciar el flujo de gas, utilice una botella de lavado llena con una dilución 1:100 de jabón para platos al agua para cubrir las conexiones entre los cilindros de gas y el biorreactor con una pequeña corriente de solución de jabón. Compruebe si hay fugas de gas indicadas por burbujeo. Al iniciar los experimentos de microalgas, comience a escupir el gas y luego ajuste el pH antes de la inoculación.

Inocular el fotobiorreactor aspirando el inóculo microalgal preparado en una jeringa estéril, colocando la jeringa al tubo unido al puerto de inoculación, abriendo la abrazadera del tubo de inoculación y presionando la jeringa. Compruebe el monitor de gas, las presiones de los cilindros de gas y el fotobiorreactor dos veces al día para conocer los niveles elevados de gas tóxico o la indicación de fugas. Limite la abertura de la faja de la campana de humo a una anchura que permita alcanzar los reguladores del biorreactor y del cilindro de gas.

Al tomar el muestreo, gire los reguladores del cilindro de gas a la posición cerrada para dejar de fluir el gas al reactor. Cierre la faja de la campana de humo y deje cinco minutos para que la campana evacúe los gases corrosivos. Muestra dentro de la campana de humo, ya sea abriendo un puerto de placa de cabeza y utilizando una pipeta serológica estéril o dibujando cultivo en una jeringa a través de la inoculación o puerto de muestreo.

En este estudio, se estableció una curva de calibración para la microalga verde Scenedesmus obliquus cosechada en la fase exponencial con mediciones OD750 y concentraciones de biomasa seca. Las concentraciones de biomasa se calcularon a partir de la curva de calibración y luego se modelaron con una curva logística donde L es la concentración máxima de biomasa, k es la pendiente relativa de la fase exponencial, x0 es el tiempo del punto medio de la curva, y x es el tiempo. Un ensayo preliminar prometedor con un gas de combustión simulado logró una tasa máxima de productividad de biomasa microalgas en 690 miligramos por litro por día que fue mayor que la del 12% de dióxido de carbono y aire ultra-cero a 510 miligramos por litro por día.

El montaje correcto del sistema es lo más importante para el procedimiento para el cultivo de microalgas y para la seguridad humana. El sistema debe ser monitoreado constantemente con sensores de gas. Las líneas de transferencia deben estar herméticas a la gas y la campana de humo debe utilizarse adecuadamente.

Los cilindros presurizados que contienen gases tóxicos son peligrosos. Asegúrese siempre de que los cilindros estén asegurados y solo se utilicen dentro de una campana de humos después de establecer un sistema de monitoreo de gases tóxicos.