Name: Producción de la plataforma de entrega de vacunas Core-Shell, sensible al infrarrojo cercano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprende a fabricar poliburbujas con PLGA y PCL para mejorar la estabilidad de vacunas mediante liberación retardada activada por infrarrojo cercano. Este método optimiza la distribución en países en desarrollo.

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Nos gustaría dar las gracias al Dr. Bryan E. Tomlin afiliado al laboratorio de análisis elemental dentro del departamento de química de TAMU que ayudó con el análisis de activación de neutrones (NAA).

1. Síntesis de triacrilato de policaprolacilana (PCLTA)
<ol><li>Secar 3,2 ml de triol de policaprolacyona (PCL) de 400 Da durante la noche a 50oC en un matraz inferior redondo abierto de 200 ml y K2CO3 en un vial de vidrio a 90oC.</li>
	<li>Mezclar el triol con 6,4 ml de diclorometano (DCM) y 4,246 g de carbonato de potasio (K2CO3)bajo argón.</li>
	<li>Mezclar 2,72 ml de cloruro de acriloilo en 27,2 ml de DCM y añadir gota a la mezcla de reacción en el matraz durante 5 min.</li>
	<li>Cubra la mezcla de reacción con papel de aluminio y déjela intacta a temperatura ambiente durante 24 horas bajo argón.</li>
	<li>Después de 24 h, filtre la mezcla de reacción con un papel de filtro en un embudo Buchner al vacío para descartar el exceso de reactivos.</li>
	<li>Prefría el filtrado del paso 1.5 que contiene el polímero endcapped en éter dietílico en un 1:3 (vol/vol) y rotovape a 30oC para eliminar el éter dietílico.</li>
</ol>2. Formación de la poliburbuja
NOTA: La inyección de polímero en el agua desionizada (DI) haría que las poliburbujas migraran a la parte inferior del vial, lo que resultaría en un fondo aplanado. Utilice 10% (wt/vol) carboximetilcelulosa (CMC) llenar el vial de vidrio en su lugar para evitar el aplanamiento de la poliburbuja.
<ol><li>Preparar una solución de CMC al 10% (wt/vol) en agua DI.</li>
	<li>Llene un vial de vidrio de 0,92 ml con 0,8 ml de 10% CMC utilizando una pipeta de transferencia de 1 ml.</li>
	<li>Mezclar 1000 mg/ml de 14 kDa PCL en DCM y sintetizar PCLTA en un 1:3 (vol/vol) para un volumen total de 200 l o preparar 200 l de 1000 mg/ml de 5 kDa de poli (ácido láctico-co-glicólico) diacrilato (PLGADA) en cloroformo.</li>
	<li>Mezclar la 2-hidroxi-4o-(2-hidroxitoxi)-2-metilpropiofenona (fotoiniciador) con la mezcla de polímero (PLGADA o PCL/PCLTA) en 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Cargue 200 l de mezcla de polímeros en una jeringa de vidrio de 1 ml montada en una bomba de jeringa que esté conectada a un tubo de acero inoxidable dispensador con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.</li>
	<li>Utilice un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero para inyectar polímero en el 10% CMC en el vial de vidrio para formar la poliburbuja.</li>
	<li>Curar las poliburbujas bajo ultravioleta (UV) a 254 nm longitud de onda durante 60 s a 2 W/cm2.</li>
	<li>Congelar flash las poliburbujas en nitrógeno líquido y liofilizar durante la noche a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.</li>
	<li>Separe las poliburbujas del CMC seco usando fórceps y lave las poliburbujas con agua DI para eliminar cualquier CMC residual. Tenga en cuenta que es probable que se utilicen otros polímeros con modificaciones para alterar la cinética de liberación.</li>
</ol>3. Modulación del diámetro de la poliburbuja
<ol><li>Llene un vial de vidrio de 0,92 ml con 10% CMC utilizando una pipeta de transferencia de 1 ml.</li>
	<li>Mezclar PCL/PCLTA en un 1:3 (vol/vol) con 1000mg/mL 14kDa PCL y sintetizar PCLTA. Mezclar el fotoiniciador con la mezcla de polímeros en un 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Cargue la mezcla de polímeros en una jeringa de vidrio de 1 ml montada en una bomba de jeringa que esté conectada a un tubo de acero inoxidable dispensador con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.</li>
	<li>Utilice un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero para inyectar polímero en el 10% CMC en el vial de vidrio para formar la poliburbuja.</li>
	<li>Para obtener poliburbujas con varios diámetros, varíe la tasa de dosificación de 0.0005 a 1 l/s.</li>
	<li>Tome imágenes del vial con las poliburbujas con diámetro variable.</li>
	<li>Utilice ImageJ para cuantificar el diámetro de las poliburbujas y utilizar el tamaño del vial como escala.</li>
</ol>4. Centrar la carga dentro de la poliburbuja
<ol><li>
Modulación de la viscosidad PCL/PCLTA utilizando K2CO3: NOTA: La viscosidad de PLGADA no tiene que modificarse utilizando K2CO3 porque la viscosidad de 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/ml es suficiente para centrar la carga.<ol>
<li>Añadir K2CO3 (que se aisló después de la reacción PCLTA) a la PCLTA en diferentes concentraciones, incluyendo 0 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml y 60 mg/ml.</li>
		<li>Mida las viscosidades dinámicas de las soluciones cambiando la velocidad de cizallamiento de 0 a 1000 1/s utilizando la reometría.</li>
		<li>Inyectar manualmente la carga en el medio (consulte el paso 4.2 para preparar la mezcla de carga) de las poliburbujas que se formaron utilizando las soluciones PCL/PCLTA con diferentes concentraciones de K2CO3 (paso 4.1.1). Determinar la concentración óptima de K2CO3 observando qué solución del paso 4.1.1 puede resultar en la retención de la carga en el medio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Centrado de la carga (ya se muestra viabilidad con moléculas pequeñas) con CMC
	<ol>
<li>Mezclar la carga con 5% (wt/vol) CMC en un rotador durante la noche para aumentar la viscosidad de la carga.</li>
		<li>Inyectar manualmente 2 l de mezcla de carga en la poliburbuja y proceder con el curado UV a 254 nm de longitud de onda durante 60 s a 2 W/cm2.</li>
		<li>Congelar flash las poliburbujas en nitrógeno líquido durante 30 s y liofilizar durante la noche a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.</li>
		<li>Separe las poliburbujas del CMC seco usando fórceps y lave con agua DI para eliminar cualquier CMC residual.</li>
		<li>Corte la poliburbuja por la mitad e imagine las mitades usando microscopía confocal para asegurarse de que la carga está centrada (consulte el paso 6 para las longitudes de onda de excitación y emisión utilizadas).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Formulación de carga
NOTA: La formulación de poliburbujas puede albergar varios tipos de carga, incluyendo moléculas pequeñas, proteínas y ácidos nucleicos.
<ol><li>Sobre la base de estudios anteriores, en el caso de la carga proteica, utilizar excipientes incluyendo polietilenglicol (PEG)6,polivinilpirrolidona (PVP), y glucopolímeros6 para mejorar la estabilidad de la proteína durante la formulación de poliburbuja.</li>
	<li>Forme poliburbujas basadas en el protocolo del paso 2.</li>
	<li>Preparar la solución de antígeno añadiendo 17,11 g de trehalosa a 625 l de antígeno VIH gp120/41.</li>
	<li>Inyecte manualmente 1 ml de solución de antígeno en el centro de la poliburbuja.</li>
	<li>Abra las poliburbujas en los días 0, 7, 14 y 21, y registre la fluorescencia del antígeno con longitudes de onda de excitación y emisión 497 nm y 520 nm, respectivamente.</li>
	<li>Determinar la funcionalidad del antígeno mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y utilizar 5% de leche sin grasa como tampón de bloqueo.</li>
</ol>6. Liberación de carga
NOTA: La molécula o antígeno pequeño se puede utilizar como tipo de carga
<ol><li>
Molécula pequeña
	<ol>
<li>Incubar poliburbujas con acriflavina centrada en 400 l de solución salina tampón de fosfato (PBS) a 37 oC, 50 oC para poliburbujas PLGADA y a 37 oC, 50 oC, 70 oC para poliburbujas PCL/PCLTA. NOTA: La razón por la que recomendamos probar las temperaturas por encima del cuerpo es a) simular la temperatura (50 oC) a la que alcanza la poliburbuja mientras se láser de las nanorods de oro (AuNRs) dentro de PCL y PLGA; y b) acelerar el proceso de degradación de LA PCL (50oC, 70oC).</li>
		<li>En cada momento, recoja los sobrenadantes y sustitúyalo con 400 l de PBS fresco.</li>
		<li>Utilice un lector de placas para cuantificar las intensidades de fluorescencia en los sobrenadantes recogidos. NOTA: Utilice ex/em de 416 nm/514 nm para acriflavine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antígeno
	<ol>
<li>Incubar poliburbujas con suero de albúmina bovina centrada (BSA)-488 en 400 l de PBS a 37 oC, 50 oC para poliburbujas PLGADA y a 37 oC, 50 oC para las poliburbujas PCL/PCLTA.</li>
		<li>En cada momento, recoja los sobrenadantes y sustitúyalo con 400 l de PBS fresco.</li>
		<li>Utilice un lector de placas para cuantificar las intensidades de fluorescencia en los sobrenadantes recogidos. Utilice ex/em de 497 nm/520 nm para BSA-488. NOTA: No se debe realizar un estudio de liberación a 70 oC para las poliburbujas PCL/PCLTA para evitar exponer el antígeno a temperaturas extremas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Toxicidad
<ol><li>
Cuantificación del contenido de cloro en poliburbujas mediante el análisis de activación de neutrones (NAA)
	<ol>
<li>Utilice poliburbujas que fueron liofilizadas durante 2, 4, 6, 20 y 24 h para este estudio a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.</li>
		<li>Mida 5-9 mg de poliburbujas y colóquelos en viales de irradiación LDPE.</li>
		<li>Prepare 1000 g/ml de solución de calibración de cloro de la solución de calibración rastreable del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST).</li>
		<li>Utilice el reactor Triga de 1 megavatios para llevar a cabo irradiaciones de neutrones en cada muestra a una velocidad de fluencia de neutrones de 9,1 ×10 12 /cm2s para 600 s.</li>
		<li>Transfiera las poliburbujas a viales sin racionados.</li>
		<li>Utilice el detector HPGe para obtener espectros de rayos gamma durante 500 s después de intervalos de descomposición de 360 s.</li>
		<li>Utilice el software NAA de Canberra Industries para analizar los datos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cuantificar el contenido de cloro liberado de las poliburbujas utilizando NAA
	<ol>
<li>Incubar poliburbujas que fueron liofilizadas durante la noche (a 0,010 mBar de vacío y a -85 oC) en 400 oC de PBS a 37 oC.</li>
		<li>Recoger los sobrenadantes en las semanas 1, 2 y 3 después de la incubación.</li>
		<li>Analice los sobrenadantes para el contenido de cloro utilizando NAA utilizando el mismo método descrito anteriormente en el paso 7.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. AuNR Synthesis de Kittler, S., et al.8
<ol><li>Preparar la solución de siembra de AuNR mezclando 250 l de ácido cloroáurico de 10 mM (HAuCl4), 7,5 ml de bromuro de cetrimonio de 100 mM (CTAB), y 600 l de 10 mM de borohidruro de sodio frío en hielo (NaBH4).</li>
	<li>Preparar la solución de crecimiento mezclando 40 ml de CTAB de 100 mM, 1,7 ml de 10 mM HAuCl4,250 ml de nitrato de plata (AgNO3)y 270 l de ácido ascórbico de 17,6 mg/ml a un tubo.</li>
	<li>Mezcle vigorosamente 420 ml de solución de semillas con la solución de crecimiento a 1200 rpm durante 1 min. A continuación, deje la mezcla intacta para reaccionar durante 16 h.</li>
	<li>Retire el exceso de reactivos de la mezcla centrifugando a 8000 × g durante 10 min y deseche el sobrenadante.</li>
</ol>9. Hidrofobicización de AuNRs por Soliman, M.G., et al.9.
<ol><li>Ajuste el pH de 1,5 ml de auNR sintetizados estabilizados por CTAB a 10 utilizando hidróxido de sodio de 1 mM (NaOH).</li>
	<li>Revuelva la solución con 0,1 ml de tiol PEG metilado de 0,3 mM (mPEG) a 400 rpm durante la noche.</li>
	<li>Mezclar LOS AUNR peginados con 0,4 M de dodecilamina (DDA) en cloroformo a 500 rpm durante 4 días.</li>
	<li>Pipetear la capa orgánica superior que contiene AuNRs hidrofbicizados y almacenar a 4 oC hasta su uso futuro.</li>
</ol>10. Activación NIR de poliburbujas
<ol><li>Mezclar la solución de polímero (PLGADA o PCL/PCLTA) con AuNRs hidrofbicizados en un 1:9 (vol/vol).</li>
	<li>Añadir fotoiniciador a la mezcla polímero-AuNR en un 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Forme poliburbujas inyectando la mezcla polímero-AuNR en un vial de vidrio de 0,92 ml con 10% cmC (wt/vol) (consulte el paso 2).</li>
	<li>Curar las poliburbujas a 254 nm longitud de onda durante 60 s a 2 W/cm2.</li>
	<li>Congelación repentina de nitrógeno líquido durante 30 s y liofilizar durante la noche a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.</li>
	<li>Separe las poliburbujas secas con fórceps y lave con agua DI para eliminar cualquier CMC residual.</li>
	<li>Incubar las poliburbujas en 400 oL de PBS a 37 oC.</li>
	<li>Active las poliburbujas usando láser NIR de 801 nm a 8A durante 5 minutos cada lunes, miércoles y viernes.</li>
	<li>Tome imágenes infrarrojas (FLIR) con visión de futuro de la poliburbuja antes y después de la activación láser para obtener valores de temperatura.</li>
	<li>Calcule las diferencias de temperatura entre antes y después de la activación láser en función de los valores de temperatura de las imágenes FLIR.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).</li>
<li>Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Hydroxycinnamate+for+sequential+photouncaging+of+two+different+functional+groups+and+its+application+in+releasing+cosmeceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).</li>
<li>Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).</li>
<li>Dai, C., Wang, B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulation+peptide+and+protein+drugs+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).</li>
<li>Souery, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+and+quantifying+the+stability+of+amino+acid-based+cargo+within+polymeric+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems.</a> Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Advanced protein formulations.</a> Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultraviolet-curable%2C+core-shell+vaccine+formed+via+phase+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).</li>
<li>Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+and+Fast+Phase+Transfer+of+CTAB+Stabilised+Gold+Nanoparticles+from+Water+to+Organic+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Physikalische+Chemie%22%5BJournal%5D)">Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase.</a> Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235(2015).</li>
<li>Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Transfer+and+Polymer+Coating+Methods+toward+Improving+the+Stability+of+Metallic+Nanoparticles+for+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications.</a> Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).</li>
<li>Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoengineered+Light-Activatable+Polybubbles+for+On%3FDemand+Therapeutic+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery.</a> Adv. Funct. Mater. , 2003579(2020).</li>
<li>Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatile+and+delayed+release+of+lysozyme+from+ointment-like+poly%28ortho+esters%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters).</a> Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability%2C+stabilization%2C+and+formulation+of+liquid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals.</a> International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).</li>
<li>Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28epsilon-caprolactone%29+and+poly+%28L-lactic-co-glycolic+acid%29+degradable+polymer+sponges+attenuate+astrocyte+response+and+lesion+growth+in+acute+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury.</a> Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).</li>
<li>Davoodi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+systems+for+programmed+and+on-demand+release%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug delivery systems for programmed and on-demand release.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).</li>
<li>Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+laser+intensity+activated+plasmonic+gold+nanoparticle-generated+photothermal+effects+on+cellular+morphology+and+viability%3A+a+real-time%2C+long-term+tracking+and+monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+and+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).</li>
<li>Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Induced+Shape+Changes+of+Colloidal+Gold+Nanorods+Using+Femtosecond+and+Nanosecond+Laser+Pulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Tecnologías y desafíos actuales Las micropartículas y nanopartículas a base de emulsión se han utilizado comúnmente como portadores de administración de fármacos. Aunque la cinética de liberación de la carga de estos dispositivos ha sido ampliamente estudiada, el control de la cinética de liberación de ráfagas ha sido un desafío importante11. La versatilidad y funcionalidad de la carga también está limitada en sistemas basados en emulsiones debido a la exposición de la carga a ...

La cobertura limitada de inmunización da lugar a la muerte de 3 millones de personas causadas específicamente por enfermedades prevenibles mediantevacunas 1. Las condiciones inadecuadas de almacenamiento y transporte conducen al desperdicio de vacunas funcionales y, por lo tanto, contribuyen a reducir la inmunización mundial. Además, la vacunación incompleta debida a no adherirse a los calendarios de vacunas requeridos también provoca una cobertura vacunada limitada, específicamente en los países en desarrollo2. Se requieren varias visitas al personal médico dentro del período recomendado para recibir inyecciones de refuerzo, limitando así el porcentaje de población con vacunación completa. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas estrategias para la administración controlada de vacunas a fin de eludir estos desafíos.
Los esfuerzos actuales para desarrollar tecnologías de administración de vacunas incluyen sistemas poliméricos basados en emulsiones3,,4. Sin embargo, la carga a menudo está expuesta a una mayor cantidad de disolvente orgánico que puede causar potencialmente agregación y desnaturalización, específicamente en el contexto de la carga basada enproteínas 5,,6. Hemos desarrollado una nueva plataforma de entrega de vacunas, "poliburbujas", que potencialmente puede albergar múltiples compartimentos de carga mientras minimiza el volumen de carga que está expuesto al disolvente7. Por ejemplo, en nuestra plataforma de poliburbujas de núcleo-shell, se inyecta un bolsillo de carga de diámetro 0,38 mm (SEM) en el centro de una poliburbuja de 1 mm. En este caso, la superficie de la carga expuesta al disolvente orgánico sería de aproximadamente 0,453 mm2. Después de considerar la densidad de embalaje de las esferas (micropartículas) dentro de una esfera (depósito de carga), el volumen real de micropartículas (10 m de diámetro) que podría caber en el depósito es de 0,17 mm3. El volumen de una micropartícula es de 5,24x10-8 mm3 y, por lo tanto, el número de micropartículas de partículas que pueden ajustarse al depósito es de 3,2x106 partículas. Si cada micropartícula tiene 20 bolsillos de carga (como resultado de la doble emulsión) de 0,25 m de diámetro, entonces la superficie de carga expuesta al disolvente orgánico es de 1274 mm2. Por lo tanto, el depósito de carga dentro de la poliburbuja tendría una superficie menos expuesta al disolvente orgánico en comparación con la de la carga orgánica expuesta a disolventes en micropartículas. Por lo tanto, nuestra plataforma a base de poliéster puede reducir potencialmente la cantidad de carga expuesta a disolvente orgánico que, de lo contrario, puede causar agregación de carga e inestabilidad.
Las poliburbujas se forman sobre la base del principio de separación de fase donde el poliéster en fase orgánica se inyecta en una solución acuosa que resulta en una burbuja esférica. La carga en la fase acuosa se puede inyectar en el centro de la poliburbuja. Otro compartimiento de carga se puede lograr potencialmente dentro de la poliburbuja mezclando una carga diferente con la cáscara de polímero. La poliburbuja en esta etapa será maleable y luego se curará para dar lugar a una estructura de poliburbuja sólida con carga en el medio. Se eligieron poliburbujas esféricas sobre otras formas geométricas para aumentar la capacidad de carga dentro de la poliburbuja, minimizando al mismo tiempo el tamaño total de la poliburbuja. Las poliburbujas con carga en el centro fueron elegidas para demostrar la liberación de ráfaga retrasada. Las poliburbujas también se incorporaron con un agente sensible al infrarrojo cercano (NIR), es decir, habilitador de la teología, a saber, nanorods de oro (AuNR), para provocar un aumento de la temperatura de las poliburbujas. Este efecto podría facilitar potencialmente una degradación más rápida y podría utilizarse para controlar la cinética en futuras aplicaciones. En este documento, describimos nuestro enfoque para formar y caracterizar poliburbujas, para lograr la liberación de ráfagas retrasadas de las poliburbujas, e incorporar AuNR dentro de las poliburbujas para causar la activación de NIR.

<table><tbody><tr><td>Ultra tetrametilbezidina (TMB) de 1 paso Ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) Solución de sustrato</td><td>Thermo scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2-hidroxi-2-metilpropiofenona</td><td>TCI AMERICA</td><td>H0991</td><td></td></tr><tr><td>450 nm Solución de parada para sustrato TMB</td><td>Abcam</td><td>ab17152</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de acriloilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A24109-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acriflavina</td><td>Chem-Impex International</td><td>22916</td><td></td></tr><tr><td>Éter etílico anhidro Fisher</td><td>Chemical</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VIH1 anticuerpo gp120 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>conjugados de colorante BSA-CF488</td><td>Invitrogen</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bromosalicílico</td><td>Acros Organics</td><td>AC162142500</td><td></td></tr><tr><td>Carboximetilcelulosa (CMC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>80502-040</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de centimonio (CTAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19400480</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Chemical</td><td>C2984</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de recubrimiento</td><td>Abcam</td><td>ab210899</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Fisher Chemical</td><td>E1384</td><td></td></tr><tr><td>Dodeacyl Amine</td><td>Acros Organics</td><td>AC117665000</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de doxorrubicina</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP251610</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Acros Organics</td><td>A61 100</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Bomba de jeringa</td><td>KD Scientific</td><td>14 831 212</td><td></td></tr><tr><td>mPEG tiol</td><td>Laysan Bio NC0702454</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada</td><td>Andwin Scientific</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de potasio</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Tampón salino de fosfato</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr> <tr><td>(Poli(caprolactona)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-250G</td><td></td></tr> <tr><td>(Poly(caprolactona) triol</td><td>Acros Organics</td><td>AC190730250</td><td></td></tr><tr><td>Poli (ácido láctico-co-glicólico) diacrilato</td><td>CMTec</td><td>280050</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato</td><td>de potasio Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>recombinante HIV1 gp120 + proteína gp41</td><td>Abcam</td><td>ab49054</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de plata</td><td>Acros Organics</td><td>S181 25</td><td></td></tr><tr><td>Sodio borohidruro</td><td>Fisher Chemical</td><td>S678 10</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tetracloroáurico</td><td>Fisher Chemical</td><td>G54 1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalosa</td><td>Acros Organics</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Acros Organics AC157910010</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

producción de la plataforma de entrega de vacunas core-shell, sensible al infrarrojo cercano

Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

Las estrategias de administración de vacunas que pueden limitar la exposición de la carga a disolventes orgánicos al tiempo que permiten nuevos perfiles de liberación son cruciales para mejorar la cobertura de inmunización en todo el mundo. Aquí, se introduce una nueva plataforma inyectable, curable y retardada de liberación por ráfaga, que permite la administración de vacunas llamada polybubbles. La carga se inyectó en poliburbujas a base de poliéster que se formaron en una solución acuosa basada en carboximetilululosa al 10%. Este documento incluye protocolos para mantener la forma esférica de las poliburbujas y optimizar la colocación y retención de la carga para maximizar la cantidad de carga dentro de las poliburbujas. Para garantizar la seguridad, se analizó el contenido de disolvente clorado dentro de las poliburbujas mediante el análisis de activación de neutrones. Se realizaron estudios de liberación con moléculas pequeñas como carga dentro de la poliburbuja para confirmar la liberación tardía de ráfagas. Para mostrar aún más el potencial de entrega bajo demanda de la carga, los nanorods de oro se mezclaron dentro de la carcasa de polímero para permitir la activación del láser infrarrojo cercano.

Las poliburbujas se caracterizaron ampliamente utilizando SEM y NAA. La carga se centró con éxito para dar lugar a una liberación de ráfaga retrasada. Las poliburbujas también se activaron con éxito con láser debido a la presencia de AuNRs dentro de las poliburbujas.
Caracterización de la poliburbuja Las burbujas inyectadas en una solución acuosa sin CMC dieron lugar a una poliburbuja aplanada debido a su con...

En este artículo se describen los protocolos utilizados para producir una nueva plataforma de administración de vacunas, "polybubbles", para permitir la liberación de ráfagas retrasadas. Se utilizaron poliésteres como poli(ácido láctico-co-glicólico) y policaprolactona para formar las poliburbujas y pequeñas moléculas y antígenos como carga.

Producción de la plataforma de entrega de vacunas Core-Shell, sensible al infrarrojo cercano

Vaccine delivery strategies that can limit the exposure of cargo to organic solvent while enabling novel release profiles are crucial for improving ...

Este protocolo puede ayudar a mantener la estabilidad de la carga, que puede ser tanto pequeñas moléculas como proteínas, a través del uso de la poliburbuja, que a su vez puede reducir las interacciones de carbono con el disolvente. Esta novedosa técnica se puede utilizar para mejorar la cobertura de las vacunas en los países en desarrollo, ya que las funcionalidades de las vacunas a menudo pueden verse comprometidas debido a las instalaciones de transporte y almacenamiento ineficientes. Para fabricar las poliburbujas, utilice primero una pipeta de transferencia de un mililitro para añadir 800 microlitros de 10%CMC en un vial de vidrio de 0,92 mililitros.Para sintetizar PCLTA, mezcle 1.000 gramos por mililitro de 14 kilodalton PCL en 200 microlitros de DCM. Para sintetizar PLGADA, mezcle 1.000 gramos por mililitro de cinco kilodalton PLGADA en 200 microlitros de cloroformo. Mezclar el fotoiniciador con la mezcla de polímeros de interés en una relación de 0,005 a 1 y cargar 200 microlitros de la solución resultante en una jeringa de vidrio de un mililitro montada en una bomba de jeringa conectada a un tubo de acero inoxidable dispensador con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.Usando un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero, inyectar el polímero en el 10%CMC en el vial de vidrio para formar las poliburbujas y curar las poliburbujas bajo luz ultravioleta a una longitud de onda de 254 nanómetros durante 60 segundos a dos vatios por centímetro cuadrado, luego congelar las poliburbujas en nitrógeno líquido durante 30 segundos y liofilizar los portadores durante la noche a 0.01 miliares de vacío en menos 85 grados Celsius. Para centrar la carga de interés dentro de una poliburbuja, mezclar la carga con 5%CMC en un rotador durante la noche para aumentar la viscosidad de la carga antes de inyectar manualmente dos microlitros de la mezcla de carga en la poliburbuja. Cuando toda la carga ha sido inyectada, re-cure, congelación del flash, y liofilizar la poliburbuja inyectada como acaba de demostrar.A la mañana siguiente, utilice fórceps para separar la poliburbuja del CMC seco y lave la poliburbuja con agua desionizada para eliminar cualquier CMC residual. A continuación, corte la poliburbuja por la mitad e imagine las mitades por microscopía confocal para asegurarse de que la carga está centrada. Para la liberación de carga de moléculas pequeñas, incubar las poliburbujas con acriflavina centrada en 400 microlitros de PBS a 37 grados Celsius para la longitud de incubación adecuada.En cada punto de tiempo experimental, recoja el sobrenadante y añada 400 microlitros de PBS fresco al vial. A continuación, utilice un lector de placas para cuantificar la intensidad de fluorescencia del sobrenadante recogido. Para la activación de infrarrojo cercano, mezcle la solución de polímero con nanoras de oro hidrofbicizado en una proporción de uno a nueve y agregue el iniciador fotográfico a una proporción de 0,005 a 1.Inyectar la mezcla resultante en un vial de vidrio de 0,92 mililitros que contenga 800 microlitros de 10%CMC y curar las poliburbujas bajo la luz ultravioleta como se ha demostrado. Después de la congelación flash y la liofilización como se ha demostrado, lave las poliburbujas con agua desionizada e incubar los portadores en 400 microlitros de PBS a 37 grados celsius durante el período de incubación adecuado. Al final de la incubación, obtener una imagen infrarroja con visión de futuro de la poliburbuja antes y después de activar las poliburbujas con un láser infrarrojo cercano de 801 nanómetros a ocho amperios durante cinco minutos tres veces a la semana durante cuatro semanas para las poliburbujas PLGADA y 14 semanas para las poliburbujas PCL-PCLTA.En cada punto de tiempo experimental, recoja el sobrenadante y añada 400 microlitros de PBS fresco al vial. A continuación, calcule las diferencias de temperatura entre las poliburbujas antes y después de la activación láser en función de los valores de temperatura de las imágenes infrarrojas con visión de futuro. La adición de una solución acuosa basada en 10%CMC da como resultado una suspensión completa de poliburbujas para un mantenimiento exitoso de la esfericidad de poliburbujas.La inyección de carga en la poliburbuja en ausencia de CMC da lugar a fugas y una consecuente falta de retención de carga dentro de la poliburbuja. Para hacer frente a esta fuga, la viscosidad de la PCLTA se puede aumentar utilizando carbonato de potasio aislado después de end capping policaprolactona con triacrilato y la viscosidad de la carga se puede aumentar mezclando la carga con 5%CMC. La viscosidad de las poliburbujas PLGADA es suficiente para facilitar el centrado de la carga y no requiere modulación a través de carbonato de potasio.Tenga en cuenta que no se observa ninguna diferencia estadísticamente significativa en la eficiencia de unión del anticuerpo después de mezclar el antígeno VIH gp120/41 con y sin trehalosa antes de la inyección de poliburbuja. Las liberaciones de ráfagas retrasadas se observan en poliburbujas PLGADA con acriflavina a mediados del día 19 para las burburaciones incubadas a 37 grados centígrados y en el quinto día para las poliburbujas incubadas a 50 grados centígrados. Además, las poliburbujas PLGADA y las poliburbujas PCL y PCLTA que contienen nanorres de oro se pueden activar con éxito varias veces.Al formar las poliburbujas, tenga cuidado de proteger los reactivos de la luz y también utilizar las soluciones inmediatamente. Después de desarrollar esta tecnología, también queríamos explorar la automatización de este proceso para ampliar la producción de poliburbujas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe un procedimiento general para el estudio de unión al receptor recombinante de dominio (RBD) basado en vacunas de subunidades contra el SARS. Que incluye los métodos de transfección y expresión de la proteína en las células 293T RBD, la inmunización de ratones con RBD y la detección de la actividad de neutralización de los sueros de ratón utilizando un pseudovirus SRAS establecida una prueba de neutralización.

Protocolo para las vacunas recombinantes para RBD basada en el SRAS: Preparación de la proteína, la vacunación de animales y la detección de neutralización

Este video muestra un método para generar vacunas de vesículas de membrana externa (OMV) de visualización multivalente. Las células de mamíferos se transfectan para expresar y secretar antígenos virales fusionados a un SpyTag y un tag de polihistidina. A continuación, estos antígenos se purifican utilizando una columna de afinidad de ácido níquel-nitritriacético (Ni-NTA). El antígeno purificado se mezcla con vesículas de membrana externa que expresan la proteína SpyCatcher (SC) unida a la...

Generación de una vacuna multivalente contra vesículas de membrana externa

Este video muestra un método para la generación de una plataforma novedosa basada en burbujas de polímero o poliburbujas que permite la liberación de ráfagas retardadas. Los polímeros a base de poliéster se utilizan para formar las poliburbujas con estructura de núcleo-cáscara, y las moléculas pequeñas y los antígenos se pueden utilizar como carga.

Una técnica para generar una nueva plataforma de administración para una liberación retardada de moléculas

Este video muestra un método para generar una vacuna candidata de ARNm utilizando nanopartículas poliméricas. El polímero catiónico interactúa con el ARNm cargado negativamente, formando poliplexos. La formación de poliplexos estabiliza el ARNm, lo que lo convierte en un candidato potencial para futuras vacunas de ARNm en aplicaciones inmunoterapéuticas.

Formulación de nanopartículas cargadas de ARNm con fines de vacunación

Aquí se proporciona un método detallado que describe la purificación, el enjuimiento y la caracterización de nanopartículas de proteínas autoensamblables (SAPN) para su uso en el desarrollo de vacunas.

Producción de E. coli-expresada Nanopartículas de Proteína Auto-Ensamblaje para Vacunas Que Requieren Presentación de Epitope Trimérico

Este protocolo describe el uso de kits comerciales de expresión de proteínas libres de células para producir proteínas de membrana soportadas en nanodiscos que se pueden usar como antígenos en vacunas de subunidades.

Producción de escamas libres de células y adición adyuvante a una proteína principal recombinante de membrana externa de Chlamydia muridarum para el desarrollo de vacunas

El presente protocolo describe la bioingeniería de vesículas de membrana externa como una plataforma de vacunas "Plug-and-Display", que incluye producción, purificación, bioconjugación y caracterización.

Una plataforma de vacuna de nanopartículas "plug-and-display" basada en vesículas de membrana externa que muestran el dominio de unión al receptor SARS-CoV-2

Aquí, presentamos métodos detallados para la preparación y evaluación de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo.

Preparación, características, toxicidad y evaluación de la eficacia de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo

Este método describe la encapsulación del antígeno de la rabia en micropartículas poliméricas biodegradables con propiedades estructurales y materiales que permiten la liberación pulsátil después de un retraso predeterminado. La evaluación del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) del antígeno recuperado del núcleo de la partícula confirma la presencia de glicoproteína intacta del virus de la rabia trimérica a través de la fabricación de partículas.

Fabricación de micropartículas poliméricas pulsátiles que encapsulan el antígeno de la rabia

En este protocolo, desarrollamos un ácido retinoico (AR) encapsulado en nanoemulsión catiónica para ser utilizado como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de antígeno. Al agregar el AR aprobado por la FDA a la nanoemulsión, se promovió la sIgA específica del antígeno en la vagina y el intestino delgado después de la inyección intramuscular de la nanoemulsión.

Ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de OVA

Aprende a fabricar poliburbujas con PLGA y PCL para mejorar la estabilidad de vacunas mediante liberación retardada activada por infrarrojo cercano. Este método optimiza la distribución en países en desarrollo.

Producción de la plataforma de entrega de vacunas Core-Shell, sensible al infrarrojo cercano

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