Name: Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende inmunohistoquímica de montaje completo para detectar proteínas en embriones y larvas de Danio rerio usando anticuerpos fluorescentes. Este método permite visualizar patrones de expresión proteica en tejidos intactos con microscopía confocal.

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Financiación de NIH subvención 8P20GM103436 14.

Los procedimientos para trabajar con adultos y embriones reproductores de peces cebra descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Estatal de Murray.
1. Recogida y fijación de embriones
<ol><li>Prepare tanques de desove colocando parejas de sexo mixtas de pez cebra adultos en tanques con una malla o un revestimiento ranurado lleno de agua del sistema durante la noche.</li>
	<li>En las luces encendidas, cambie el agua del tanque de desove para agua fresca del sistema para eliminar las heces. Utilice un ciclo de luz oscura de 14 h/10 h con luces encendidas a las 9 am.</li>
	<li>Una vez que se pongan los huevos, devuelva a los adultos a los tanques domésticos.</li>
	<li>Recoger los huevos mediante la elaboración de ellos utilizando un pipeta de transferencia o vertiéndolos en un colador de malla.</li>
	<li>Transfiera los huevos a platos de Petri llenos de medio cuerpo con medio embrionario (como un 30% de danieau o un medio embrionario E2 con 0,5 mg/L de azul de metileno), limitando el número de embriones por plato a 50.</li>
	<li>Retire los huevos que estén muertos o que no se dividan. NOTA: Los embriones muertos se pueden identificar fácilmente a medida que se vuelven opacos y a menudo aparecen "nublados". Si el azul de metileno se añade al medio embrionario, los embriones muertos tienen una apariencia azul oscuro.</li>
	<li>Incubar platos de huevos a 28,5oC hasta que lleguen a la etapa deseada. Para este experimento, elevar los embriones hasta 23 hpf.</li>
	<li>Opcional) Transfiera los embriones a 24 hpf a 200 m 1-fenil 2-tiourea (PTU) en medio embrionario para prevenir la melanogénesis16,17. Alternativamente, blanquear los embriones después de la fijación (ver sección 5 opcional).</li>
	<li>Cambiar el medio embrionario o el medio de PTU diariamente.</li>
	<li>Dechorionar embriones desenombreced usando fórceps de punta ultrafina bajo un estereomicroscopio. Alternativamente, los embriones descolasten químicamente incubando en 1 mg/ml de pronasa en medio embrionario durante varios minutos a temperatura ambiente. Retire los embriones de Pronase y lávelos tres veces con medio embrionario.</li>
	<li>Los embriones desconredados se adhieren al plástico. Mantenerlos en platos Petri de vidrio o plástico recubiertos con 1-2% de agarosa disuelta en medio embrionario. Mueva embriones desconredados usando pipeteos Pasteur pulidos con fuego para minimizar el daño.</li>
	<li>Transfiera los embriones a tubos centrífugos de 1,5 ml utilizando un pipeta de plástico o pulida por fuego.</li>
	<li>Retire el medio embrionario con un micropités. Deje sólo suficiente líquido para cubrir los embriones después de cada cambio de líquido.</li>
	<li>Preparar 4% paraformaldehyde (PFA) en 1 x solución salina con fosfato (PBS) en una campana de humo químico. ADVERTENCIA: PFA es un material peligroso. Use guantes y deseche líquidos y sólidos contaminados en áreas designadas.</li>
	<li>Fijar los embriones en 4% PFA para 1-2 h con balanceo suave a temperatura ambiente. Alternativamente, fijar los embriones 4 h para pasar la noche a 4 oC.</li>
	<li>Lavar tres veces en 1PBS + 1% Triton-X (PBTriton) durante 5 min.</li>
	<li>Utilizar los embriones inmediatamente o almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana.</li>
	<li>Para el almacenamiento a largo plazo, deshidratar los embriones en 100% metanol (MeOH) 2 h o durante la noche a -20 oC. Almacene los embriones a -20 oC en MeOH durante varios meses. ADVERTENCIA: MeOH es un material peligroso. Use guantes y deseche líquidos y sólidos contaminados en áreas designadas.</li>
</ol>2. Preparación de embriones
<ol><li>Rehidratar los embriones a través de incubaciones en serie a temperatura ambiente.<ol>
<li>Incubar en 75% MeOH/25% 1x PBS durante 5 min, balanceándose.</li>
		<li>Incubar en 50% MeOH/50% 1x PBS durante 5 min, balanceándose.</li>
		<li>Incubar en 25% MeOH/75% 1x PBS durante 5 min, balanceándose.</li>
		<li>Incubar en 100% PBTriton durante 5 min, meciéndose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Opcional) Preparar una solución de trabajo fresca de proteína K (10 g/ml en PBTriton) en hielo añadiendo 10 ml de caldo de proteína K recién desaliñado (10 mg/ml).<ol>
<li>Permeabilizar los embriones digiriendo hasta 30 min en Proteinase K. NOTA: El tiempo sugerido es <24 hpf: sin digestión; 24 hpf: 15 min de digestión; y 7 días de edad: 30 min de digestión.</li>
		<li>Enjuague los embriones permeabilizados en PBTriton y vuelva a fijarlos en 4% de PFA durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave los embriones tres veces en PBTriton durante 5 minutos a temperatura ambiente con un suave balanceo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Incubación de anticuerpos primarios
<ol><li>Seleccione una solución de bloqueo comercial o suero que coincida con las especies de host de anticuerpos secundarios (por ejemplo, 10% de suero de cabra en PBTriton) con o sin 2 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA).</li>
	<li>Bloquear los embriones en solución de bloqueo durante 1-3 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 oC mientras se balancea.</li>
	<li>Incubar en anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo o 1% de suero en PBTriton durante la noche a 4oC mientras se balancea. En este experimento, los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-NMDAR1, receptor anti-pan-AMPA, y anti-fosfo-histona H3, cada uno diluido a una concentración final de 1:500 en 1% suero de cabra en PBTriton.</li>
	<li>Lavar cinco veces en PBTriton durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se balancea.</li>
</ol>4. Incubación secundaria de anticuerpos
<ol><li>Seleccione un anticuerpo secundario basado en las especies anfitrionas del anticuerpo primario y la longitud de onda deseada.</li>
	<li>Incubar en anticuerpos secundarios diluidos en solución de bloqueo o 1% de suero durante 2 h a temperatura ambiente (o durante la noche a 4oC) durante el balanceo. NOTA: Los anticuerpos secundarios fluorescentes son sensibles a la luz. Usamos 1:500 cabra-anti-ratón Alexa488 diluido en 1% suero de cabra en PBTriton.</li>
	<li>Cubra los tubos con papel de aluminio o cubra con una caja de bloqueo de luz para este y todos los pasos subsiguientes.</li>
	<li>Lavar tres veces en PBTriton durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se balancea.</li>
	<li>Transfiera los embriones a una solución de glicerol al 50% en PBS sobre un lecho de agarosa del 2% en medio embrionario y proceda a la documentación o proceda a los pasos de procesamiento posteriores a continuación.</li>
</ol>Pasos opcionales
5. Blanqueamiento
<ol><li>Preparar la solución de lejía en un tubo de 1,5 ml añadiendo 810,7 l de ddH2O, 89,3 ml de 2 M KOH y 100 ml de 30% H2O2.</li>
	<li>Invierta el tubo tres veces para mezclar.</li>
	<li>Pipetear 1 ml de dirección de la solución de lejía a los embriones.</li>
	<li>Abra la tapa del tubo embrionario para permitir que el gas escape. Toque suavemente el tubo en el banco para desalojar las burbujas.</li>
	<li>Supervise el proceso de blanqueo (utilice un microscopio si es necesario) y detenga la reacción cuando el pigmento se extraiga lo suficiente (aproximadamente 5 min para 24 hpf o 10 min para 72 hpf).</li>
	<li>Retire cuidadosamente la solución de blanqueo con un micropipeta y enjuague los embriones tres veces en 1 ml de PBTriton. NOTA: Los embriones son pegajosos en este paso.</li>
	<li>Continúe con la documentación o los pasos de procesamiento adicionales a continuación.</li>
</ol>6. Disección de embriones y desyolking
<ol><li>Para eliminar la yema, transfiera una pequeña cantidad (200 ol o suficiente para cubrir completamente el embrión, pero lo suficientemente restrictivo como para limitar dónde puede flotar) de 1x PBS a una diapositiva de depresión o un portaobjetos de vidrio liso.</li>
	<li>Utilice un pipeta de transferencia de plástico para mover 1 o más embriones a la gota de PBS.</li>
	<li>Utilice fórceps ultrafinos y 00 pines de insectos para romper la yema y raspar muy suavemente gránulos de yema de la superficie ventral del embrión (véase también Cheng et al., 2014)18.</li>
	<li>Retire los gránulos de yema y reponga PBS según sea necesario.</li>
	<li>Repita hasta que el embrión esté lo suficientemente libre de yema.</li>
</ol>7. Montaje plano en diapositivas
<ol><li>Transfiera embriones deyolked a un portaobjetos de vidrio cargado con una pipeta de plástico o una micropipeta de 1 ml con una punta recortada (para reducir el estrés de cizallamiento). Orientar como desee con una punta de micropipeta de 200 l o un pasador de insecto.</li>
	<li>Elimina el exceso de PBS con una toallita Kim o una toalla de papel.</li>
	<li>Agregue 2-3 gotas de soporte de montaje a la corredera y al cubreobjetos.</li>
	<li>Secar al aire durante aproximadamente 5 a 10 min.</li>
	<li>Selle el cristal de la cubierta sobre el portaobjetos con esmalte de uñas transparente. NOTA: Los bordes del vidrio de la cubierta deben estar completamente cubiertos con una capa fina y continua de esmalte de uñas.</li>
	<li>Dejar secar aproximadamente 10 minutos antes de la toma de imágenes.</li>
</ol>8. Montaje en Agarose
<ol><li>Preparar el 1% de agarosa en medio embrionario añadiendo 0,5 g de agarosa a 50 ml de medio embrionario en un matraz o vaso de precipitados aptos para microondas de al menos 3 veces mayor volumen del deseado.</li>
	<li>Calienta en un microondas, girando cada 30 s, hasta que la agarosa se disuelva por completo.</li>
	<li>Hacer 1 ml de alícuotas en tubos centrífugos de 1,5 ml. Almacene las alícuotas a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cubra las tapas del tubo con cerraduras de tapa antes de calentar.</li>
	<li>Coloque los tubos de agarosa en un soporte de tubo flotante en un vaso de precipitados medio lleno de agua.</li>
	<li>Microonda el vaso de precipitados con tubos flotantes durante 2-3 minutos, o hasta que la agarosa esté completamente derretida.</li>
	<li>Transfiera un embrión a la corredera puenteada con una pipeta de plástico o una micropipeta de 200 ml con una punta recortada (para reducir el estrés de cizallamiento).</li>
	<li>Coloque el embrión en un cubreobjetos rectangular utilizando alfileres de insectos y agregue aproximadamente 20 ml de agarosa derretida directamente al embrión.</li>
	<li>Oriente rápidamente la región de interés más cercana al cubreobjetos usando 00 alfileres de insectos. NOTA: Este es un soporte al revés.</li>
	<li>Vuelva a colocar el tubo de agarosa en el flotador del tubo de agua caliente entre cada uso y el microondas según sea necesario.</li>
	<li>Imagen utilizando un microscopio cuando la agarosa se endurece. Mantenga el embrión montado boca abajo para usarlo en un microscopio invertido. Voltear el cubreobjetos (para que la agarosa esté debajo del cubreobjetos) para su uso en microscopios verticales.</li>
</ol>9. Montaje en diapositivas puenteadas
<ol><li>Para hacer diapositivas puenteadas, pegue las cubiertas cuadradas a la diapositiva de vidrio usando un pequeño punto de superpegamento. NOTA: Debe haber una vaguada de al menos 5 mm de ancho entre los labios de las cubiertas. Dos #1 de cubiertas altas es típicamente apropiado para embriones de 24-48 hpf, mientras que tres cubresítos altos pueden ser necesarios para 72 hpf.</li>
	<li>Transfiera 1-2 embriones deyolked a la corredera puenteada con una pipeta de plástico o una micropipeta de 200 l con una punta recortada (para reducir el estrés de cizallamiento).</li>
	<li>Elimina el exceso de líquido con una toallita Kim o una toalla de papel.</li>
	<li>Añadir una gota de glicerol del 80% directamente al embrión.</li>
	<li>Cubierta con una cubierta rectangular. La gota de glicerol debe tocar el cristal de la cubierta.</li>
	<li>Añadir más glicerol al espacio entre el cristal de la cubierta y deslizarse según sea necesario para cubrir completamente el embrión con un margen de glicerol en los lados del embrión.</li>
	<li>Deslice suavemente el vidrio de la cubierta rectangular para enrollar el embrión en su posición para la toma de imágenes.</li>
</ol>10. Tinción DAB
NOTA: Esta sección comienza después del paso 4.2 anterior y reemplaza el resto del paso 4.
<ol><li>Incubar los embriones en una solución de bloqueo con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC mientras se balancea.</li>
	<li>Lavar tres veces en PBTriton durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera los embriones a una placa de cultivo o diapositiva de depresión con una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Mezclar 50 éL de 1% DAB (3,3'-diaminobenzidina) disuelto en ddH2O y 50 oL de 0,3% de peróxido de hidrógeno y llevar a 1 ml con PBS. ADVERTENCIA: DAB es un material peligroso. Use guantes y deseche líquidos y sólidos contaminados por DAB en áreas designadas.</li>
	<li>Cubra los embriones teñidos con HRP con la solución DAB preparada anteriormente y monitoree para el desarrollo del color (normalmente 1-5 min) bajo un microscopio.</li>
	<li>Después de alcanzar el nivel deseado de desarrollo de color, enjuague los embriones brevemente en PBS.</li>
	<li>Transfiera los embriones a un tubo de 1,5 ml antes de la fijación.</li>
	<li>Vuelva a fijar los embriones durante 15-20 min en 4% de PFA a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave los embriones tres veces en PBTriton durante 5 min.</li>
	<li>Proceda a la documentación.</li>
</ol>11. Protocolo modificado para la tinción de tejido seccionado que se monta en diapositivas
<ol><li>Rodear el tejido para ser manchado con una pluma de papá.</li>
	<li>Transfiera los portaobjetos a una cámara húmeda.</li>
	<li>Agregue 1 ml de PBS directamente a la diapositiva.</li>
	<li>Incubar 7 min a temperatura ambiente para eliminar el medio de incrustación.</li>
	<li>Vierta PBS invirtiendo la diapositiva.</li>
	<li>Rehidratar 1 min en hasta 1 mL de tampón TNT (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20).</li>
	<li>Bloquear en hasta 1 ml de solución de bloqueo (comercial o 10% de suero + 2% de BSA) durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar durante la noche en anticuerpos primarios diluidos en suero del 1% o solución de bloqueo a 4oC.</li>
	<li>Lavar cinco veces en hasta 1 ml de tampón TNT a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar en anticuerpos secundarios durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC. Cubra la cámara con papel de aluminio o utilice una tapa oscura.</li>
	<li>Lavar cinco veces en TNT a temperatura ambiente. Vierte el último lavado.</li>
	<li>Montar con 2-3 gotas de medio de montaje y cubreobjetos. Dejar sentarse 5-10 min.</li>
	<li>Selle el cristal de la cubierta sobre el portaobjetos con esmalte de uñas transparente. Deje secar completamente antes de tomar imágenes.</li>
</ol>12. Documentación
<ol><li>Registre el procedimiento completo y las desviaciones en un cuaderno de laboratorio.</li>
	<li>Registre la concentración, el nombre, el número de catálogo, el fabricante y el número de lote del anticuerpo principal.</li>
	<li>Coloque la muestra montada adecuadamente en la etapa del microscopio. Localice la región de interés.</li>
	<li>Seleccione un ejemplo relativamente brillante. Ajuste la exposición y la ganancia de la cámara para que la señal sea lo suficientemente brillante sin saturarla.</li>
	<li>Compare la intensidad de tinción de la misma región de interés utilizando los mismos ajustes de exposición al comparar entre embriones experimentales etiquetados con anticuerpos y embriones de anticuerpos de control (por ejemplo, IgG).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen información que revelar.

La inmunohistoquímica es una herramienta versátil que se puede utilizar para caracterizar la expresión espacio-temporal de prácticamente cualquier proteína de interés en un organismo. La inmunohistoquímica se utiliza en una amplia variedad de tejidos y organismos modelo. Este protocolo ha sido optimizado para su uso en peces cebra. La inmunohistoquímica en diferentes especies puede requerir diferentes técnicas de fijación y manipulación, bloqueando las soluciones dependiendo de las especies y la presencia de peroxidasas ...

El pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un modelo poderoso para el estudio de los procesos biológicos por varias razones, incluyendo el corto tiempo de generación, el desarrollo rápido, y la amenabilidad a las técnicas genéticas. Como resultado, el pez cebra se utiliza comúnmente en pantallas de moléculas pequeñas de alto rendimiento para la investigación toxicológica y el descubrimiento de fármacos. El pez cebra también es un modelo atractivo para el estudio de los procesos de desarrollo, ya que una sola hembra puede producir rutinariamente 50-300 huevos a la vez y los embriones ópticamente claros se desarrollan externamente permitiendo una visualización eficiente de los procesos de desarrollo. Sin embargo, las primeras investigaciones se basaron principalmente en pantallas genéticas delanteras utilizando N-etil-N-nitrosourea (ENU) u otros mutágenos debido a los desafíos en el establecimiento de técnicas genéticas inversas. Hace aproximadamente dos décadas, los morfosolinos se utilizaron por primera vez en peces cebra para derribar genes dirigidos1. Los morpholinos son pequeños oligonucleótidos antisentido que inhiben la traducción del ARNm objetivo después de la microinyección en un embrión en una etapa temprana del desarrollo. Una debilidad importante de los morfolinos es que se diluyen a medida que las células se dividen y generalmente pierden eficacia en 72 horas después de la fertilización (hpf). Si bien los morfolinos siguen siendo una poderosa herramienta para la alteración del gen del pez cebra, las nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción (TALEN), las nucleasas de zinc-dedo (ZFN) y las repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) interespaciadas regularmente agrupadas se utilizan más recientemente para apuntar directamente al genoma del pez cebra2,3. Estas estrategias genéticas inversas, en combinación con la genética delantera y las pantallas de alto rendimiento, han establecido el pez cebra como un modelo poderoso para estudiar la expresión y la función génicas.
La capacidad de estudiar la función génica generalmente requiere una evaluación de la distribución espacio-temporal de la expresión de genes o genes. Las dos técnicas más utilizadas para visualizar estos patrones de expresión durante el desarrollo temprano son la hibridación in situ (ISH) y la inmunohistoquímica de montaje completo (IHC). La hibridación in situ se desarrolló por primera vez en 1969 y se basa en el uso de sondas de ARN antisentido etiquetadas para detectar la expresión de ARNm en un organismo4. Por el contrario, los anticuerpos etiquetados se utilizan en la inmunohistoquímica para visualizar la expresión de proteínas. La idea de etiquetar proteínas para la detección se remonta a los5 de 1930 y el primer experimento del IHC se publicó en 1941 cuando se utilizaron anticuerpos etiquetados con FITC para detectar bacterias patógenas en los tejidos infectados6. ISH e IHC han evolucionado y mejorado significativamente en las décadas siguientes y ahora se utilizan rutinariamente en el laboratorio de investigación molecular y diagnóstica7,8,9,10,11. Si bien ambas técnicas tienen ventajas y desventajas, IHC ofrece varios beneficios sobre ISH. Prácticamente, IHC consume mucho menos tiempo que la ISH y generalmente es menos costoso dependiendo del costo del anticuerpo primario. Además, la expresión de ARNm no siempre es una métrica fiable de la expresión de proteínas, ya que se ha demostrado en ratones y humanos que sólo alrededor de un tercio de la variación de la abundancia de proteínas puede explicarse por la abundancia de ARNm12. Por esta razón, IHC es un suplemento importante para confirmar los datos de ISH, cuando sea posible. Por último, IHC puede proporcionar datos subcelulares y de colocalización que no pueden ser determinados por ISH13,14,15. Aquí, describimos un método paso a paso para detectar de forma fiable las proteínas mediante inmunohistoquímica en embriones y larvas de pez cebra de montaje completo. El objetivo de esta técnica es determinar la expresión espacial y temporal de una proteína de interés en todo el embrión. Esta tecnología utiliza anticuerpos primarios específicos para antígenos y anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente. El protocolo es fácilmente adaptable para su uso en secciones de tejido deslizante y para su uso con sustratos cromogénicos en lugar de fluorescencia. Usando este protocolo, demostramos que el desarrollo de músculo esquelético de pez cebra expresa receptores de glutamato ionotrópico, además de receptores de acetilcolina. Las subunidades del receptor de glutamato de tipo NMDA son detectables en el músculo longitudinal a 23 hpf.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio, resistente</td><td>Kirkland</td><td></td><td>Cualquier marca puede ser sustituida Anticuerpo</td></tr><tr><td>anti-NMDA</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-histona H3 (Ser10), clon RR002</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-598</td><td></td></tr><tr><td>Receptor anti-pan-AMPA (GluR1-4)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>MABN832</tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de calcio [Ca(NO3)2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4955</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 1,5 mL</td><td>Esmalte de uñas Axygen</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Clear</td><td>Sally Hanson</td><td></td><td>Cualquier esmalte de uñas o endurecedor puede ser sustituido</td></tr><tr><td>Portaobjetos de depresión (concavidad)</td><td>Electrónica Miscroscopy Sciences</td><td>71878-01</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidina</td><td>Thermo Scientific</td><td>1855920</td><td></td></tr><tr><td>Medio embrionario, Danieau, 30%</td><td></td><td></td><td>17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgS04, 0,18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES en agua ultrapura.</td></tr><tr><td>Medio embrionario, E2</td><td></td><td></td><td>7,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 &mu; M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L azul de metileno</td></tr><tr><td>Soporte de tubo flotante</td><td></td><td></td> Microscopio compuesto de fluorescencia Thermo Scientific 59744015 <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de fluorescencia</td><td>Leica Biosystems</td><td>M165-FC</td><td></td></tr><tr><td>Cubertades de vidrio 18 mm x 18 mm</td><td>Corning</td><td>284518</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio 22 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-050-222</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Solución HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Cámara húmeda con tapa</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno, 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>Pluma Pap Immunedge</td><td>Vector labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos, tamaño 00</td><td>Stoelting</td><td>5213323</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4 &middot; 7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Colador de malla</td><td>Oneida</td><td></td><td>Cualquier marca puede ser sustituida</td></tr><tr><td>por Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Cerradura de tapa de microtubo</td><td>Research Products International</td><td>145062</td><td></td></tr><tr><td>Horno microondas</td><td>Toastmaster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Millipore Sigma S02L1ML</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezclador nutante</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-044</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBTriton</td><td></td><td></td><td>1% TritonX-100 en 1x PBS</td></tr><tr><td>Medio de montaje Permount</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (vidrio)</td><td>Pyrex</td><td>3160100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (plástico)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> FB0875713 <td></td></tr><tr><td>1-fenil 2-tiourea</td><td>Acros Organics</td><td>207250250</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10x, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x</td><td></td><td></td><td>1x hecha a partir de 10x caldo diluido en dH2O</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dibásico de fosfato de sodio (Na2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de desove con tapa e inserto</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>SuperBlock PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost + correderas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNT</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, pH 8,0; 150 mM de NaCl; 0,1% Preadolescente20; fabricado en dH2</td></tr><tr><td>O Pipeta de transferencia</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético (Cl3CCOOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Pinza ultrafina</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Agua, ultrapura/doble destilada</td><td>Fisher Scientific</td><td>W2-20</td><td></td></tr></tbody></table>

inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para explorar la expresión y localización de proteínas durante los estados normales de desarrollo y enfermedad. Aunque muchos protocolos de inmunohistoquímica se han optimizado para secciones de tejido y tejido de mamíferos, estos protocolos a menudo requieren modificación y optimización para organismos modelo no mamíferos. El pez cebra se utiliza cada vez más como sistema modelo en la investigación básica, biomédica y traslacional para investigar los mecanismos biológicos moleculares, genéticos y celulares de los procesos de desarrollo. Zebrafish ofrece muchas ventajas como sistema modelo, pero también requieren técnicas modificadas para una detección óptima de proteínas. Aquí, proporcionamos nuestro protocolo para la inmunohistoquímica de fluorescencia de montaje completo en embriones y larvas de peces cebra. Este protocolo también describe varias estrategias de montaje diferentes que se pueden emplear y una visión general de las ventajas y desventajas que proporciona cada estrategia. También describimos modificaciones a este protocolo para permitir la detección de sustratos cromogénicos en el tejido de montaje completo y la detección de fluorescencia en el tejido larvario seccionado. Este protocolo es ampliamente aplicable al estudio de muchas etapas de desarrollo y estructuras embrionarias.

La inmunohistoquímica de montaje completo utiliza anticuerpos para detectar el patrón espacial de expresión de proteínas en el animal intacto. El flujo de trabajo básico de la inmunohistoquímica (representado en la Figura 1)consiste en la cría de peces cebra, la cría y preparación de embriones, el bloqueo de antígenos no específicos, el uso de un anticuerpo primario específico del antígeno para apuntar a la proteína de interés, la detección de ese anticuerpo ...

Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

La inmunohistoquímica de montaje completo es una técnica relativamente rápida y sencilla que permite la observación espacial y temporal de proteínas directamente en un tejido u organismo utilizando anticuerpos etiquetados. La utilidad de esta técnica es que permite la tinción de un tejido intacto o un organismo sin tener que secarlo primero y la microscopía confocal se puede utilizar para generar una representación tridimensional del patrón de expresión de proteínas. La inmunohistoquímica es ampliamente utilizada en la investigación biomédica para entender la etiología y los mecanismos moleculares que subyacen a la enfermedad.También es una valiosa herramienta de diagnóstico para identificar tumores en muestras patológicas. Para empezar, prepare tanques de desove llenos de agua del sistema y con una malla o forro ranurado en su lugar. Coloque parejas de sexo mixto de peces cebra adultos en grupos en los tanques durante la noche.Utilice un ciclo de luz/oscuridad de 14 horas/10 horas con luces encendidas a las 9 a.m. A la mañana siguiente, con las luces encendidas, cambie el agua del tanque de desove con agua fresca del sistema para eliminar las heces. Una vez que los huevos se ponen, devolver a los adultos a los tanques caseros.Recoger los huevos por elaborarlos utilizando una pipeta de transferencia. Transfiera 50 huevos a cada plato de Petri lleno a mitad de camino con un medio embrionario. Retire los huevos opacos y nublados que estén muertos o que no se dividan.Incubar el plato de huevos a 28,5 grados centígrados hasta 23 horas después de la fertilización. Si los embriones son mayores de 24 horas después de la fertilización, con una pipeta transfiera los embriones a 200 PTU micromolares en un medio embrionario para prevenir la melanogénesis. Bajo un microscopio estéreo, descorionar los embriones sin rayar usando fórceps de punta ultra fina.Usando pipetas Pasteur pulidas por fuego para minimizar el daño, transfiéralas a platos Petri de vidrio o plástico recubiertos con 1-2% de agarosa disuelta en medio embrionario. A continuación, transfiera los embriones a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros utilizando una pipeta de plástico o pulida por el fuego. Retire el medio embrionario con una micropipeta.Deje sólo suficiente líquido para cubrir los embriones. Fije los embriones en 4%PFA durante una o dos horas con un suave balanceo a temperatura ambiente. A continuación, lave los embriones tres veces en 1X PBS y 1%PBTriton durante cinco minutos.Utilice los embriones inmediatamente o guárdelos a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. Para el almacenamiento a largo plazo, deshidratar y almacenar los embriones en 100% metanol a menos 20 grados Celsius. Para rehidratar los embriones, realice incubaciones en serie cinco minutos cada una a temperatura ambiente con cantidades decrecientes de metanol y PBS y PBTriton para el lavado final.Proceda con la preparación del embrión de acuerdo con el manuscrito. Seleccione una solución de bloqueo que coincida con las especies anfitrionas de anticuerpos secundarios, por ejemplo 10% de suero de cabra en PBTriton con o sin dos miligramos por mililitro de BSA. Añadir 0,5 mililitros de la solución de bloqueo en el tubo que contiene el embrión y colocar el tubo en un balancín durante una a tres horas a temperatura ambiente.Luego incubar el embrión en anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo y PBTriton durante la noche a cuatro grados Celsius mientras se balancea. Por la mañana, lave el embrión cinco veces en PBTriton durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras se balancea. A continuación, seleccione un anticuerpo secundario basado en la especie huésped del anticuerpo primario y la longitud de onda deseada a 488 nanómetros.Añadir el anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo en el tubo que contiene el embrión. Cubra el tubo con papel de aluminio e incubar durante dos horas a temperatura ambiente mientras se balancea. Después de eso, lave los embriones tres veces en PBTriton durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente mientras está cubierto con papel de aluminio y balanceo.Con una pipeta, transfiera los embriones a una solución de 50% de glicerol en PBS sobre un lecho de 2% de agarosa en medio embrionario. Para quitar la yema, transfiera 200 microlitros de 1X PBS a un portaobjetos de depresión o a un portaobjetos de vidrio plano. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para mover uno o más embriones a la gota PBS.Utilice fórceps ultra finos y pasadores de insectos de doble cero para romper la yema y raspar muy suavemente los gránulos de yema de la superficie ventral del embrión. Retire los gránulos de yema y reponga con PBS según sea necesario. Después del montaje, coloque la muestra en la etapa del microscopio.Busque la región de interés seleccionando un ejemplo relativamente brillante. Ajuste la exposición y la ganancia de la cámara para que la señal sea lo suficientemente brillante sin saturación. Cuando se compare entre los embriones experimentales etiquetados con anticuerpos y los embriones de anticuerpos de control, utilice los mismos ajustes de exposición.Este protocolo de inmunohistoquímica de montaje completo es una herramienta valiosa para el estudio de la expresión de proteínas espaciales y temporales utilizando el desarrollo de peces cebra. La subunidad GluN1 del receptor de glutamato tipo NMDA reveló la expresión de subunidades del receptor de glutamato a lo largo del desarrollo de los músculos del pez cebra a las 23 horas después de la fertilización. Secciones congeladas de embriones post fertilización de 72 horas se montaron en diapositivas e inmunosutened para fosfo-H3, un marcador de células proliferantes.Varias células expresaron fosfo-H3 y la expresión fue más notable en las zonas ventriculares. Los anticuerpos de control IgG de ratón y la exclusión de los anticuerpos primarios revelaron un bajo nivel de expresión no específica. Es importante seleccionar soluciones de bloqueo adecuadas y anticuerpos secundarios basados en las especies anfitrionas de anticuerpos primarios para asegurar la detección y minimizar las manchas no específicas.La inmunohistoquímica debe verificarse para garantizar que la señal observada sea realmente la proteína de interés. Los experimentos de seguimiento generalmente implican el uso de organismos modificados genética o ambientalmente. La inmunohistoquímica otorga a los investigadores la capacidad de observar proteínas in situ, acelerando en gran medida nuestra comprensión de numerosos sistemas en biología básica y aplicada, particularmente durante el desarrollo embrionario.El metanol y el formaldehído son tóxicos y deben manipularse cuidadosamente. Los desechos deben recogerse y eliminarse de acuerdo con los procedimientos institucionales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Una forma rápida para llevar a cabo la inmunotinción del corazón embrionario del pez cebra se describe. En comparación con el enfoque de montaje inmunotinción todo, este método aumenta considerablemente la penetración de los anticuerpos, lo que permite obtener imágenes de alta resolución que revelan la estructura celular / subcelular en el corazón dentro de un tiempo de procesamiento muy reducida.

Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra

El pez cebra, un pequeño pez tropical, se ha convertido en un modelo popular para el estudio de la función de genes durante el desarrollo de vertebrados y la enfermedad. La expresión temporal y espacial de los genes diana se puede determinar...

Alta resolución todo el montaje de<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en embriones de pez cebra para estudiar la expresión génica y la función

Los procesos de desarrollo tales como la proliferación, el patrón, la diferenciación, y guía de axones se pueden modelar fácilmente en la médula espinal pez cebra. En este artículo se describe un procedimiento de montaje para los embriones de pez cebra, que optimiza la visualización de estos eventos.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Se describen las técnicas de inmunotinción fosfo-epítopos en embriones de pez cebra enteros y luego llevar a cabo la localización de dos colores confocal de fluorescencia en las estructuras celulares tan pequeños como los cilios primarios. Las técnicas para la fijación y formación de imágenes pueden definir la ubicación y la cinética de la aparición o la activación de proteínas específicas.

Inmunotinción fosfo-epítopos en ciliadas Órganos de todo el montaje embriones de pez cebra

Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.

Inmunofluorescencia secuencial e inmunohistoquímica en embriones de pez cebra crioseccionados

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Este protocolo describe cómo obtener imágenes combinando hibridación in situ e inmunohistoquímica de secciones embrionarias de pez cebra. La hibridación in situ se realizó antes de la criosección, seguida de tinción de anticuerpos. Es útil detectar los patrones de expresión de dos genes en el pez cebra si hay escasez de anticuerpos.

In situ Hibridación combinada con inmunohistoquímica en embriones crioseccionados de pez cebra

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes in vivo de todo el cerebro de larvas de pez cebra utilizando microscopía de fluorescencia tridimensional. El procedimiento experimental incluye la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y la visualización.

In vivo Imágenes de todo el cerebro de larvas de pez cebra usando microscopía de fluorescencia tridimensional

Aprende inmunohistoquímica de montaje completo para detectar proteínas en embriones y larvas de Danio rerio usando anticuerpos fluorescentes. Este método permite visualizar patrones de expresión proteica en tejidos intactos con microscopía confocal.

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

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