Name: En Vivo Aumento de la Inducción de Células T Regulatorias Gut-Homing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a generar células dendríticas modificadas para potenciar la inducción de células T reguladoras con tropismo intestinal. Este protocolo demuestra una estrategia terapéutica aplicable en entornos proinflamatorios.

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Este trabajo fue apoyado por la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud a través del Programa de Investigación Médica Revisado por Pares bajo el Premio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por las Becas de Innovación en Investigación del Departamento de Medicina de la Universidad Loma Linda (681207-2967 [XT y GG], 681205-2967 [XT] y 325491 [DJB]).

Todos los protocolos de estudio animal in vivo fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad lomána (IACUC), así como por la Oficina de Revisión de Cuidado y Uso de Animales (ACURO) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) Departamento de Defensa.
1. Preparación del Lentivirus que expresa tanto 1o-hidroxilasa como RALDH2 (virus lenti-CYP-ALDH)
<ol><li>Día 0: En la madrugada, prepare 5 x 105 células/ml de células 293T en el medio de cultivo celular CM-10-D.</li>
	<li>Semilla s20 mL/placa en platos de cultivo de 150 mm x 25 mm. Cultivo de las células a 37oC y 5%co2 durante 24 h. La confluencia alcanzará el 80-90% después de 24 h.</li>
	<li>Día 1: Hacer 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, y 1.5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquot y almacenar a -20oC.</li>
	<li>Hacer 2 M CaCl2 y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para cada plato de cultivo de 150 mm x 25 mm, prepare una mezcla de precipitación de ADN en un tubo de cultivo estéril de 50 ml. En primer lugar, añadir 1.620 l de 2 x HBS, 9,5 g de PMD2G (VSVG), 17,5 g de pCMVR8,74 (Capsid), 27 g de plásmido Lenti-CYP-ALDH (un vector lentiviral que transporta tanto CYP27B1 como ALDH1a2). En segundo lugar, añada H2O a un volumen final de 3.037,5 l.</li>
	<li>En el último, añadir 202,5 l de 2 M CaCl2 en sentido de gota mientras se mezcla la solución a las concentraciones finales de 1x HBS y 125 mM CaCl2. CaCl2 debe ser el último en agregarse. Deje las mezclas de transfección a temperatura ambiente durante 20 minutos con mezcla ocasional. Para múltiples platos de cultivo de 150 mm x 25 mm, escale verticalmente en consecuencia.</li>
	<li>Agregue los 3.240 l de mezcla de precipitación de ADN con gota a un plato de cultivo de 150 mm x 25 mm que contenga las células 293T. Gire suavemente la guarnición del cultivo de lado a lado mientras agrega la mezcla de precipitación de ADN. Incubar el plato a 37oC y 5%CO2 durante 24 h.</li>
	<li>Día 2: Retire la solución de transfección de fosfato cálcico, lave suavemente con 1 pbS y vuelva a alimentar el cultivo celular con un medio de cultivo celular CM-4-D. Incubar las células a 37oC y 5%co2 durante 24 h.</li>
	<li>Día 3: Cosecha los sobrenatantes en botellas de almacenamiento estériles y guárdalos a 4-8oC. Reponer el cultivo celular con un medio de cultivo celular CM-4-D fresco. Cultivo de las células a 37oC y 5% co2 para otras 24 h.</li>
	<li>Día 4: Cosecha los sobrenatantes en botellas de almacenamiento estériles. Filtrar los sobrenadores desde el día 3 y el día 4 a través de un filtro de 0,45 m. Para concentrar el virus pseudotipo VSVG, transfiera los sobrenatantes a tubos de centrífuga y gire a 4.780 x g durante 24 h a 4 oC.</li>
	<li>Día 5: Vierta los sobrenadores de los pellets (el pellet es a menudo visible) y deje que los tubos drenen en una toalla de papel en un gabinete de bioseguridad estéril durante varios minutos.</li>
	<li>Resuspenda los pellets pipeteando con PBS estéril que contenga 5% glicerol. El volumen de resuspensión será de 33,3 ml por plato de cultivo de 150 mm x 25 mm.</li>
	<li>Aliquot 200 l/tubo y conservar a -80 oC. Haga una alícuota separada de 50 l/vial para fines de valoración. Los titers deben estar dentro del rango de 108–109 unidades de transducción (TU)/ml.</li>
	<li>Agregue lejía a los platos de cultivo y deséchelos. NOTA: Estas células transinfectadas son la mayor preocupación de seguridad en el protocolo, ya que todos los elementos lentivirales se expresan en las células.</li>
</ol>2. Generación de CC derivados de médula ósea (BMC)
<ol><li>Cosecha tibias y fémures de 4-5 ratones Balb/c en un tubo de polipropileno estéril de 50 ml que contiene el medio de cultivo6.</li>
	<li>Transfiera las tibias y los fémures a un plato de cultivo de 100 mm x 20 mm que contenga el medio de cultivo. Retire los tejidos como los músculos de las tibias y los fémures usando tijeras y fórceps disecantes.</li>
	<li>Corte ambos extremos de las tibias y fémures para exponer la cavidad de la médula ósea.</li>
	<li>Dibuje un medio de cultivo de 10 ml en una jeringa de 10 ml unida a una aguja de 30 G.</li>
	<li>Inserte cuidadosamente la aguja en la cavidad de la médula ósea y latire la médula ósea en un tubo de polipropileno estéril limpio de 50 ml. Repita este procedimiento si es necesario, para asegurarse de que la médula ósea se ha eliminado por completo.</li>
	<li>Peletizar las células de la médula ósea por centrifugación (400 x g)a 2-8 oC durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda el pellet con 5 ml de 1 x tampón de lisis de glóbulos rojos.</li>
	<li>Incubar las células a temperatura ambiente durante 4-5 min con agitación ocasional.</li>
	<li>Detenga la reacción añadiendo 30 ml de medio de cultivo.</li>
	<li>Reventar las células por centrifugación (400 x g)a 2-8 oC durante 5 min. Resuspender las células en 10 ml de medio de cultivo celular CM-10-R. Si es necesario, las células se pueden pasar a través de un colador de células de 40 m para eliminar los desechos.</li>
	<li>Realice un recuento de celdas y ajuste las celdas a 1 x 106 celdas/ml usando el medio de cultivo de células CM-10-R.</li>
	<li>Añadir el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrofagos recombinantes (GM-CSF, concentración final a 100 U/ml) e interleucina murina-4 (IL-4, concentración final a 10 U/ml). NOTA: Las soluciones de stock de GM-CSF e IL-4 se almacenan a -80 oC a 100.000 U/ml (1.000x) y 10.000 U/ml (1.000x), respectivamente.</li>
	<li>Distribuya las células en 6 placas de cultivo de pozos a 4 ml/pozo y linolie las células a 37oC y 5%CO2 durante 48 h.</li>
	<li>Retire las celdas no adherentes con un pipeteo suave.</li>
	<li>Agregue el nuevo medio de cultivo de células CM-10-R que contenga el GM-CSF (100 U/mL) y el IL-4 (10 U/mL). Cultivo de las células durante otras 48 h.</li>
	<li>Cosecha de células no adherentes (BMCD) para la transducción por el virus lenti-CYP-ALDH.</li>
</ol>3. Transducción de DC con el virus lenti-CYP-ALDH para generar células DC-CYP-ALDH
<ol><li>Preparar 1 x 106 DCs/bien en un volumen total de 0,5 ml de medio de cultivo celular CM-10-R que contenga 50 s de virus y protamina de 8 g/ml en una placa de cultivo de 6 pocillos.</li>
	<li>Cultivo de las células a 37oC y 5%co2 durante 24 h.</li>
	<li>Sustituya el medio por un nuevo medio de cultivo celular CM-10-R y el cultivo de las células a 37 oC y 5% deCO2 para otros 24 h. En este momento, se pueden evaluar las actividades enzimáticas de 1o-hidroxilasa y RALDH2 (ver paso 4). Si es necesario, repita los pasos 3.1–3.3 para una segunda transducción.</li>
	<li>Añadir lipopolisacárido (100 ng/mL) y cultivar las células durante 24 h.</li>
	<li>Cosecha las células (células DC-CYP-ALDH) para experimentos.</li>
</ol>4. Evaluación de las células sobreexpresadas de 1o-hidroxilasa y RALDH2 en células DC-CYP-ALDH
<ol><li>Evaluación de la sobreexpresa de la hidroxilasa de 1o en células DC-CYP-ALDH<ol>
<li>Semilla 1.0 x 106 CÉLULAs DC-CYP-ALDH/bien en 2 mL de medio de cultivo celular CM-10-R en 12 placas de cultivo de pozo.</li>
		<li>Añadir 25(OH)D a la concentración final de 2,5 m. Incubar las células DC-CYP-ALDH durante 24 horas.</li>
		<li>Cosecha los supernatantes y guárdalos a -20oC.</li>
		<li>Ensayo para concentraciones de 1,25(OH)2Den los supernatantes utilizando un radioinmunoensayo (RIA) disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Determinar la expresión de 1-hidroxilasa en células DC-CYP-ALDH por fluorescencia activada clasificación celular (FACS) utilizando un anticuerpo anti-CYP27B1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluación del RALDH2 sobreexpresado en células DC-CYP-ALDH NOTA: La expresión y la actividad del RALDH2 sobreexpresado se determinan utilizando un kit de detección de aldehído deshidrogenasa comercial (ALDH) (ver Tabla de materiales).<ol>
<li>Semilla 1 mL de DC-CYP-ALDH o células de control (1 x 105 celdas/ml en tampón de ensayo) en cada uno de dos tubos de 5 ml (uno etiquetado como "Control" y el otro etiquetado como "Prueba").</li>
		<li>Añadir 10 l de solución de dietilominobenzaldehído (DEAB) (1,5 mM en etanol al 95%) a cada uno de los tubos de control y mezclar inmediatamente. DEAB es un inhibidor de RALDH2.</li>
		<li>Añadir 5 l de sustrato de fluorescencia RALDH activado (300 m) a los tubos de control y ensayo y mezclar inmediatamente.</li>
		<li>Incubar los tubos durante 45 min.</li>
		<li>Peletizar las células por centrifugación a 400 x g a 2-8 oC durante 5 min. Aspirar los sobrenadores.</li>
		<li>Reconstituir las celdas en 200 ml de búfer de ensayo.</li>
		<li>Mantenga las células en hielo y proceda para el análisis por FACS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li>
<li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li>
<li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing%2C+IL-10-producing+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li>
</ol>

Los Doctores Xiaolei Tang y David J. Baylink son inventores de una patente pendiente relacionada con este estudio.

En este artículo describimos el uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos. Nuestros datos han demostrado que las células DC-CYP-ALDH pueden sintetizar concentraciones localmente altas de novo de 1,25(OH)2D y RA in vitro en presencia de sustratos correspondientes (es decir, 25[OH]D y retinol, respectivamente). Debido a que las concentraciones sanguíneas suficientes de 25(OH)D y retinol se pueden lograr fácilmente a través de suplementos ...

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial mucosa1,2. Por esta razón, actualmente disponibles medicamentos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus sitios) inhiben las funciones de los mediadores inflamatorios o bloquean la localización de células inmunitarias en el intestino. Sin embargo, los mediadores inflamatorios y las células inmunitarias que están dirigidas también son necesarios para las defensas inmunitarias. Como resultado, los inhibidores del mediador inflamatorio comprometen la defensa inmune sistémica y los bloqueadores de homing de células inmunitarias debilitan la defensa inmune intestinal, lo que puede conducir a consecuencias graves3,4. Además, los bloqueadores de homing de células inmunitarias también pueden bloquear la homing de células T reguladoras (Treg) en el intestino y por lo tanto pueden empeorar la tolerancia inmunitaria intestinal ya comprometida en pacientes con EII. Además, el bloqueo de la célula de Treg homing en el intestino también puede conducir a la supresión inmune sistémica debido a la acumulación de células Treg en la sangre5. Por último, los inhibidores y bloqueadores funcionan de forma transitoria y, por lo que, requieren administraciones frecuentes. La administración frecuente de estos inhibidores y bloqueadores puede exacerbar aún más los efectos secundarios adversos.
Recientemente, propusimos una estrategia novedosa que potencialmente puede mitigar o incluso eliminar los efectos secundarios asociados con los fármacos actuales para el tratamiento de la EII6. Esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6. La razón de esta estrategia es que las células Treg intestinales específicamente hogar del intestino y por lo tanto no comprometerá las defensas inmunitarias sistémicas. Además, dado que las células Treg pueden potencialmente formar memoria7,8, las células Treg intestinales pueden potencialmente proporcionar un control estable de la inflamación intestinal crónica en pacientes con EII y, por lo tanto, el tratamiento no debe ser necesario administrar con tanta frecuencia. Además, dado que esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales in vivo, no tiene la preocupación de la inestabilidad in vivo en un entorno altamente proinflamatorio que se asocia con la transferencia adoptiva de células Treg generadas in vitro9,10. En este sentido, las células Treg generadas in vitro son una de las estrategias propuestas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes11,12,13 y rechazo de trasplante14,15. Finalmente, en esta estrategia, las células dendríticas (CC) están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de dos moléculas de novo: vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA porque 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabezal de horquilla P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 y que RA puede estimular la expresión de receptores de homing intestinal en las células T18. Debido a que tanto 1,25(OH)2D como RA también pueden tolerizar los CC28,29,raquemos por ello que los CC de ingeniería se mantendrán establemente en un estado tolerogénico in vivo y, por lo tanto, eludan las preocupaciones de inestabilidad in vivo asociadas con los CC tolerogénicos generados in vitro (TolDCs)19,20,21. En este sentido, los TolDC son también una de las estrategias propuestas para el aumento in vivo de las funciones celulares treg19,20,21. Para apoyar nuestro razonamiento, hemos demostrado que los controladores de tecnología de desarrollo, tras la entrega in vivo, pueden aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6.
Una ventaja adicional de nuestra estrategia propuesta es que 1,25(OH)2D también tiene otras funciones que potencialmente pueden beneficiar a los pacientes con EII. Estas otras funciones incluyen la capacidad de 1,25(OH)2D para estimular la secreción de antimicrobianos22 y para suprimir la carcinogénesis23. Las infecciones y los cánceres se asocian con frecuencia con la EII24,25.
Para generar los CC que pueden producir concentraciones localmente altas de 1,25(OH)2D y RA de novo, utilizamos un vector lentiviral para diseñar dCs para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D-hidroxilasa (1o-hidroxilasa), que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 (ALDH1a2) que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2 (RALDH2), que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA6.
Debido a que el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal es potencialmente importante en el tratamiento de la EII, en el siguiente protocolo detallaremos los procedimientos para la generación de los DC subexpresantes 1--hidroxilasa-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que se puede utilizar para la futura investigación de células Treg intestinales in vivo.

<table><tbody><tr><td>Jeringas de 10 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 03-377-23</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 100 mm x 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 12 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 150 mm x 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#</td> CLS430559 <td></td></tr><tr><td>25-hidroxicolecalciferol (25[OH]D)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# H4014</td><td></td></tr><tr><td>293T celdas</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de 6 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Kit ALDEFLUOR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>Cat# 01700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CYP27B1</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab95047</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1016</td><td></td></tr><tr><td>CM-10-D medio</td><td></td><td></td> de cultivo celular <td>DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol (2-ME), 1 mM de piruvato de sodio, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y 2 mM de L-glutamina.</td></tr><tr><td>Medio de cultivo</td><td></td><td></td> celular CM-10-R <td>Medio RPMI 1640 (sin glutamina) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol (2-ME), 1 mM de piruvato de sodio, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y 2 mM de L-glutamina.</td></tr><tr><td>Medio de cultivo</td><td></td><td></td> celular CM-4-D <td>Medio DMEM que contiene 4% de suero fetal bovino (FBS), 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol (2-ME), 1 mM de piruvato de sodio, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y 2 mM de L-glutamina.</td></tr><tr><td>Filtros de vacío con tapa de botella Corning, 0,22 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430513</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de vacío con tapa de botella Corning, 0,45 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430514</td><td></td></tr><tr><td>tijera de disección</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 08-940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>medio ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 11960044</td><td></td></tr><tr><td>Suero</td> <td>fetal bovinoThermoFisher Scientific</td><td>Gato#</td> Pinzas 16000044 <td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Gato# 22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisado Gibco ACK</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Gato# A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gato# G5516</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore</td><td>Cat# 391340</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-CYP-ALDH</td><td>Los</td><td>ADNc de CYP27B1 ratón de 1,6 kb y ADNc de ALDH1a2 hechos a medida se amplificaron mediante PCR utilizando un plásmido que contenía el ADNc CYP27B1 y un plásmido que contenía el ADNc de ALDH1a2 respectivamente (GeneCopoeia). El fragmento de ADNc CYP27B1 amplificado con una secuencia de entrada de ribosoma KOZAK 5' se clonó en el vector lentiviral pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE (Addgene). El constructo resultante se designó como lenti-CYP-GFP. El fragmento de ADNc ALDH1a2 amplificado se clonó en el lenti-CYP-GFP para reemplazar al GFP y se designó como lenti-CYP-ALDH. Este plásmido bicistrónico expresa CYP27B1 controlado por el promotor SFFV y ALDH1a2 controlado por el promotor PGK.</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Gato#25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacárido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gato# L3755</td><td></td></tr><tr><td>Murino GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>Gato# 315-03</td><td></td></tr><tr><td>Murino IL-4</td><td>Peprotech</td><td>Gato# 214-14</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gato# NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agujas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 14-841-02</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>pCMVR8.74 Addgene</td><td></td><td>Plasmid# 22036</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#15140148</td><td></td></tr><tr><td>Solución equilibrada de fosfato ( PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>PMD2G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 12259</td><td></td>Tubo</tr> de <tr><td>polipropileno, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno, 50 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P3369</td><td></td></tr><tr><td>Conejo control de isotipo de IgG policlonal</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab171870</td><td></td></tr><tr><td>Radioinmunoensayo para la medición de 1,25(OH)2D</td><td>Ensayos</td><td></td><td></td>Heartland</tr><tr><td>RPMI 1640 medio, sin glutamina</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Cat# 21870076</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat de sodio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> <td>Sorvall Legend XTRThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 75004521</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de células estériles, 40 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de almacenamiento estériles, 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# CLS431432</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo aumento de la inducción de células t regulatorias gut-homing

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial de la mucosa. Recientemente demostramos que las células T reguladoras intestinales (Treg) son una terapia prometedora para la EII. En consecuencia, este artículo presenta un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir concentraciones localmente altas de dos moléculas de novo, vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA basándose en hallazgos anteriores que muestran que 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabecera P3 e interleucina-10) y que la AR puede estimular la expresión de receptores intestinales en células T. Para generar estas células dendríticas diseñadas, utilizamos un vector lentiviral para transducir las células dendríticas para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1o-hidroxilasa, que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2, que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA. Este protocolo se puede utilizar para la investigación futura de células Treg intestinales in vivo.

Las células DC-CYP-ALDH expresaron un aumento significativo de la cantidad de 1o-hidroxilasa. Para determinar si las células DC-CYP-ALDH generadas a partir de BMDC expresaron una cantidad significativamente mayor de 1o-hidroxilasa, los BMDC fueron transducidos con el virus lenti-CYP-ALDH para producir células DC-CYP-ALDH derivadas de médula ósea (células BMDC-CYP-ALDH). Posteriormente, las células BMDC-CYP-ALDH fueron examinadas para la expresión de 1-hidroxilasa por FACS. Nuestros datos mostraron que la...

Aquí presentamos un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de células T reguladoras intestinales. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de la vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y la vitamina A activa (ácido retinoico o RA) de novo.

En Vivo Aumento de la Inducción de Células T Regulatorias Gut-Homing

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Este protocolo describe una estrategia terapéutica potencialmente novedosa que se puede modificar fácilmente para aplicaciones humanas. Esta técnica mejora directamente la inducción de las células T reguladoras de la dirección intestinal en los tejidos linfoides periféricos y se puede implementar de forma estable incluso en entornos altamente proinflamatorios. Estas técnicas también se pueden utilizar para investigar el papel de la vitamina D activa y la vitamina A dentro del sistema inmunitario periférico.Esta demostración visual proporcionará instrucciones paso a paso para la generación de células dendríticas de ingeniería de alta calidad que son fundamentales para el éxito de esta técnica. Comience por sembrar una vez 10 a las siete células 293T en 20 mililitros de medio de cultivo celular CM-10-D en placas de cultivo de 150 por 25 milímetros para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. Al día siguiente, añadir 1,62 mililitros de solución de HBS recién preparada, 9,5 microgramos de plásmido de envolvente, 17,5 microgramos de plásmido de envasado y 27 microgramos del plásmido LENTI-CYP-ALDH a un tubo cónico de 50 mililitros.Lleve el volumen final d

in-vivo-augmentation-of-gut-homing-regulatory-t-cell-induction

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Competitiva experimentos homing permiten la evaluación directa de las propiedades migratorias de dos poblaciones diferentes de células en un ratón. Aquí se ilustra este procedimiento mediante la comparación de la migración de los ex vivo generado intestino tropicales versus no-gut células T trópico.

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Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

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Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

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Reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1

Aprende a generar células dendríticas modificadas para potenciar la inducción de células T reguladoras con tropismo intestinal. Este protocolo demuestra una estrategia terapéutica aplicable en entornos proinflamatorios.

En Vivo Aumento de la Inducción de Células T Regulatorias Gut-Homing

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