Generación de paisajes químicos controlados y dinámicos para estudiar el comportamiento microbiano

Este método permite dilucidar la ecología y el comportamiento a microescala de los microorganismos que navegan por gradientes químicos dinámicos y descubrir sus compensaciones ocultas, cinética de nutrientes y dinámica de la población en microambientes ecológicamente relevantes. Mediante la combinación de tecnología microfluídica con folílisis, generamos pulsos químicos controlados, donde el quimioatractant localizado se pone repentinamente disponible a la microescala, para medir la respuesta quimiotáctica de las poblaciones microbianas expuestas por primera vez a gradientes químicos inestables. Diseñe el canal utilizando el software CAD e imprímalo en una película de transparencia para crear la máscara de foto.

Fabricar al maestro por litografía suave en una habitación limpia, según el manuscrito. Prepare una mezcla de PDMS combinando el elastómero con su agente de curado en una proporción de 10 a uno en un vaso de precipitados de 40 mililitros. Con un cuchillo de plástico, mezcle vigorosamente hasta que el líquido sea homogéneo.

Desgaste inmediatamente la mezcla PDMS en una cámara de vacío durante 45 minutos a temperatura ambiente. Para acelerar el proceso, libere periódicamente el vacío para reventar las burbujas que se forman en la interfaz. Retire el polvo de la superficie del maestro con un limpiador presurizado.

A continuación, vierta la mezcla de PDMS desgasificación en el maestro, y hornee en un horno a 80 grados Celsius durante dos horas. Corte el PDMS con una hoja alrededor de las microestructuras a una distancia de aproximadamente cinco milímetros y, a continuación, pele cuidadosamente los PDMS del maestro. Agujeros de punzonado para servir como entrada y salida del microcanal.

Selle el microcanal con cinta adhesiva para evitar la acumulación de polvo. Diseñe la forma 3D con el software de diseño 3D e imprima el maestro para el molde PDMS con una impresora 3D de alta resolución. Después de preparar y desgasificación de la mezcla PDMS como se hizo anteriormente, limpie la superficie del maestro mediante el desgasificación con cinta adhesiva.

Pon al maestro en una escala. Luego, evitando la región central del maestro, vierta 23,4 gramos de mezcla PDMS no curada para obtener la altura deseada de PDMS haciendo coincidir la altura del maestro en 0,5 milímetros. Retire las burbujas restantes con la ayuda de aire comprimido.

Coloque el PDMS fundido sobre el maestro en un horno a 45 grados Celsius para hornear durante al menos 12 horas. A continuación, despegue suavemente la capa PDMS endurecida y los orificios de entrada y salida de punzonado para la inyección de la suspensión bacteriana. Active la superficie de una placa Petri y el molde PDMS con plasma de oxígeno durante dos minutos.

Une el molde DE PDMS en el plato Petri presionando suavemente el molde a la placa Petri. Evite presionar dónde se encuentran las funciones. Coloque el plato Petri unido al molde PDMS 3D en un horno a 45 grados Centígrados durante al menos 12 horas para fortalecer el enlace químico.

A continuación, active la membrana de policarbonato nanoporoso en una cámara de plasma de oxígeno durante un minuto a temperatura ambiente. Bajo una capucha química, diluir una solución comercial de 3-aminopropiltreexisilano en agua desionizada al 1% en volumen mediante el uso de un tubo de polipropileno. Transfiera la solución diluida de 3-aminopropiltriexisilano en un plato de Petri y sumerja la membrana activada en la solución de 3-aminopropiltriethoxysillane durante 20 minutos.

A continuación, retire la membrana de la solución de 3-aminopropiltriethoxysilane con pinzas, y colóquela en una toallita limpia para secarla. Para la fabricación de los canales microfluídicos PDMS que se encuentran en la membrana y permiten el lavado de la arena bacteriana, repita la fabricación del dispositivo microfluídico para el experimento de pulso químico único como se hizo anteriormente. Para unir los canales de lavado PDMS a la membrana funcionalizada, primero active el canal de lavado PDMS y la membrana de policarbonato con una cámara de plasma de oxígeno durante dos minutos.

Inmediatamente después del tratamiento plasmático, ponga en contacto la membrana funcionalizada y el canal de lavado PDMS presionando suavemente el canal de lavado PDMS sobre la membrana. Es importante presionar suavemente el PDMS y la membrana, o la membrana podría estar unida irreversiblemente al techo del microcanal PDMS de 200 micrómetros de altura. A continuación, active tanto la membrana de policarbonato de canal de lavado PDMS laminada unida como el molde 3D PDMS previamente unido a la placa Petri colocándolos en una cámara de plasma de oxígeno durante dos minutos.

Entreten la membrana entre dos capas PDMS y presione juntos. Coloque el plato Petri unido a la estructura del sándwich en un horno a 45 grados Celsius durante al menos 12 horas para fortalecer el enlace químico. Para comenzar, mantenga la cámara milifluídica al vacío durante 20 minutos.

A continuación, coloque el plato Petri que contiene la cámara milifluídica en una etapa del microscopio. Con una pipeta, llene la cámara debajo de la membrana con la suspensión bacteriana diluida de Vibrio ordalii fluorescente GFP en unlilolilolar 4-metoxi-7-nitroindolinil-enjaulado-L-glutamato solución en agua de mar artificial. Después de llenar el canal con la suspensión bacteriana, succiona la solución en exceso con una toalla de papel, y selle la entrada y la salida con tapones PDMS presionándolos suavemente en los orificios.

Llene una jeringa con una solución de agua de mar artificial de unlilolar 4-metoxi-7-nitroindolinil-enjaulado-L-glutamato, y conecte el tubo a la entrada y salida del canal de lavado por encima de la membrana. Conecte el tubo a un depósito de residuos y asegúrese de que el tubo esté completamente sumergido en el depósito de residuos de fluidos para evitar oscilaciones de presión. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 50 microlitros por minuto.

Encienda la bomba de la jeringa para establecer el flujo en el canal de lavado por encima de la membrana. Inicie el software que controla el haz LED y la etapa del microscopio, y genere secuencias de pulsos definidas por el usuario en diferentes ubicaciones y con diferentes intensidades. Grabe vídeo utilizando un objetivo 4x a intervalos de tiempo regulares durante un período de varias horas y en múltiples ubicaciones contiguas para cubrir una superficie grande.

En este estudio, los dispositivos microfluídicos y miliflu dídicos se utilizaron para estudiar la respuesta quimiotáctica bacteriana y los perfiles de acumulación en condiciones de nutrientes dinámicos. Las proyecciones de intensidad máxima muestran la posición bacteriana, indicada por trazas blancas, en un intervalo de 0,5 segundos inmediatamente después de la liberación del pulso y 40 segundos después de la liberación del pulso. Las trayectorias bacterianas también se mostraron en negro 60 segundos después de la liberación del pulso.

La región sombreada representa el pulso químico liberado por la fotólisis en el momento cero segundo en el centro del campo de visión, que posteriormente se difundió. La concentración bacteriana, así como la dinámica temporal de la velocidad de deriva radial después de una liberación de pulso en el centro del campo de visión se muestran aquí. Los valores negativos de la velocidad de deriva corresponden al movimiento quimiotáctico dirigido hacia el centro del pulso.

Las estadísticas de natación se presentan aquí para una población bacteriana en ausencia de gradientes químicos. Las trayectorias representan las proyecciones bidimensionales del movimiento bacteriano tridimensional en el microcanal. La distribución de probabilidad de la velocidad de natación bacteriana medida fue ajustada por una distribución gamma.

De las trayectorias bacterianas, se extrajo la distribución de probabilidad del tiempo entre reorientaciones sucesivas. El patrón de reorientación, la distribución de la velocidad de natación y las estadísticas de reorientación de los organismos se utilizaron para informar a un modelo basado en individuos. Este método ha sido probado en la bacteria marina Vibrio ordalii realizando quimiotaxis hacia el glutamato de aminoácidos, pero la metodología propuesta es ampliamente aplicable a diferentes combinaciones de especies y quimioatractantes, así como a procesos biológicos más allá de la quimiotaxis, como la dinámica poblacional y comunitaria en condiciones espacialmente heterogéneas y dinámicas.

Las técnicas clásicas en ecología microbiana y microbiología, como los crecimientos en cultivos por lotes o quimiostatos, han ignorado en gran medida las características espacio-temporales de los hábitats microbianos. La creación casi instantánea de pulsos químicos a las microescalas por fotólisis tiene como objetivo reproducir el tipo de pulsos de nutrientes que las bacterias marinas encuentran en la naturaleza a partir de una serie de fuentes, por ejemplo, la difusión difusa de las plumas detrás del hundimiento de partículas orgánicas o la propagación de nutrientes de las células de fitoplancton deslímbradas. La solución de aminosilano es agudamente tóxica y debe manejarse con extremo cuidado.

Trabajamos exclusivamente bajo la campana de humos y usamos equipos de protección como bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. También nos encargamos de los residuos que generamos.