Name: Medición de la plasticidad de la privación visual monocular y la dominación ocular en la corteza visual primaria del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprende a medir la plasticidad de la privación visual monocular y la dominación ocular en la corteza visual primaria del ratón. Este protocolo permite analizar respuestas neuronales y explorar mecanismos de desarrollo visual.

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Este estudio fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (81571770, 81771925, 81861128001).

En este protocolo, los machos C57Bl/6 fueron obtenidos del Instituto de Animales de Laboratorio de la Academia de Ciencias Médicas de Sichuan y del Hospital Popular Provincial de Sichuan. Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China.
1. Privación monocular (MD) en el día 28 postnatal en ratones
<ol><li>Coloque las herramientas quirúrgicas, la aguja de sutura (0,25 mm de diámetro, diámetro de la cuerda 0,07 mm) y los hisopos de algodón en una caja de aluminio y autoclave a 120 oC durante 0,5 h. Esterilice la campana con 75% de etanol. Seque las herramientas quirúrgicas en un horno de secado.</li>
	<li>Preparar una solución de agarosa del 2%, ponerla en un baño de agua a 75 oC para evitar la solidificación.</li>
	<li>Utilice isoflurano mezclado con oxígeno para anestesiar al ratón (2% de inducción y 1,2–1,5% de mantenimiento). Fije el ratón en el aparato estereotaxico y utilice un dispositivo regulador de calor para mantener la temperatura corporal del ratón a 37 oC y evitar la hipotermia.</li>
	<li>Aplique una fina capa de pomada ocular a base de petróleo en ambos ojos.</li>
	<li>Bajo el microscopio anatómico con iluminación, sutura el párpado en un ojo. Haga pasar la aguja a través de ambos lados del párpado 2x(Figura 1A)y haga alrededor de cuatro puntos de sutura.</li>
	<li>Anudar el hilo 2–3x y luego recortar el hilo. Aplicar 3 ml de pegamento de secado instantáneo en el nudo para aumentar su estabilidad. A continuación, corte el hilo de sutura adicional.</li>
	<li>Proporcione una inyección intraperitoneal de buprenorfina (1 mg/kg) al ratón.</li>
	<li>Transfiera el ratón a una almohadilla de calentamiento para mantener su temperatura corporal a 37 oC y evitar la hipotermia y controlarla hasta que recupere la conciencia.</li>
	<li>Cuando el ratón esté completamente despierto, colóquelo en una jaula de sujeción separada.</li>
	<li>Revise los párpados diariamente para asegurarse de que permanezcan cerrados y no infectados. Excluya el ratón si se encuentra una abertura del párpado.</li>
	<li>Antes del registro electrofisiológico, utilice isoflurano mezclado con oxígeno para anestesiar al ratón (2% de inducción y 1,2-1,5% de mantenimiento).</li>
	<li>Retire los puntos con tijeras para los ojos para exponer el globo ocular. Recorte cuidadosamente los párpados.</li>
	<li>Enjuague el ojo con solución de lente y compruebe el ojo bajo un microscopio para mayor claridad. Excluya a los ratones con opacidades corneales o signos de infección.</li>
</ol>2. Craniotomía en la región binocular del ratón V1 después de la privación monocular el 4o día
<ol><li>Después de anestesiar el ratón, compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del tiempo.</li>
	<li>Coloque y fije el ratón en el aparato estereotaxico. Ajuste la altura de la barra del oído y la barra dental para mantener el cerebro plano y estable.</li>
	<li>Utilice una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal.</li>
	<li>Aplique una pomada ocular a base de petróleo en la superficie de los ojos para mantenerlos húmedos.</li>
	<li>Retire el pelo de la cabeza del ratón para exponer su piel. Frote la piel con exfoliantes alternados de yodo y 70% etanol 3x.</li>
	<li>Incise un área de 8 x 8 mm de la piel entre las orejas para exponer el cráneo y extraer el tejido del cuero cabelludo. A continuación, retire el tejido conectivo que cubre con un 30% de peróxido de hidrógeno.</li>
	<li>Taladre un agujero de 1 x 1 mm en el cráneo por encima del cerebelo. Fije un pequeño tornillo óseo en el agujero como referencia.</li>
	<li>Realizar una pequeña craneotomía de 1 mm de diámetro en la región binocular V1 desde el hemisferio contralateral hasta el ojo desfavorecido(Figura 1B, A-P: lambda -0.51–lambda +1.67 mm; M-L: -2.6– -3.0 mm; D-V: 0-1 mm). Retire cuidadosamente el fragmento del cráneo sin lastimar el cerebro.</li>
	<li>Cubrir la superficie cortical expuesta con 75 ml de agarosa del 2% a 40 oC para evitar el secado.</li>
	<li>Fijar un electrodo de tungsteno en el marco estereotaxico. Coloque el electrodo de tungsteno verticalmente sobre la superficie de la corteza expuesta, la región binocular de V1, para asegurarse de que las células que se registran reaccionan a ambos ojos.</li>
	<li>Use hisopos de algodón para eliminar el gel para los ojos y aplique aceite de silicio en el ojo cada 2 h.</li>
</ol>3. Estimulación visual y grabación electrofisiológica
<ol><li>Enmascarar el ojo con placa de plástico no transparente. Coloque un monitor LCD a 23 cm del ojo del ratón.</li>
	<li>Reduzca la anestesia a 0.5–0.8% cuando el ratón esté completamente anestesiado.</li>
	<li>Avance el electrodo de microelectrodo lentamente con un micromanipulador hidráulico de aceite. Deténgalo cuando se observe una alta relación señal-ruido y el electrodo esté avanzado a la capa 4(Figura 1C,aproximadamente 250–450 m de profundidad). Asegúrese de que el factor de amplificación esté ajustado en 1.000, el filtro a 300–100 Hz y la frecuencia de muestreo en 40 Hz.</li>
	<li>Presentar una rejilla sinusoidal móvil de campo completo(Figura 1D, 12 direcciones, 100% de contraste, 2 Hz de frecuencia temporal, 0,04 ciclos por grado de frecuencia espacial) en el monitor LED.</li>
	<li>Mida la respuesta de la célula estimulando el ojo ipsilateral y contralateral por separado. Presente 3-5x total.</li>
	<li>Mida las respuestas de cinco a ocho células en cada penetración. Realizar de cuatro a seis penetraciones en cada ratón.</li>
	<li>Después de la grabación, ajuste el caudal de isoflurano al 5% o superior, continúe la exposición al isoflurano durante 1 min y, a continuación, realice la luxación cervical. NOTA: Las penetraciones separadas se espaciaron al menos a 200 m de distancia en la zona binocular V1.</li>
</ol>4. Clasificación de picos fuera de línea y análisis de datos
<ol><li>Detecte picos cuando la señal sin procesar cruce un nivel de umbral. Alinee los picos capturados en el primer pico positivo o negativo. Utilice el software para detectar picos de diferentes células.</li>
	<li>Establezca dos cursores: uno para positivo y el otro para la desviación negativa. Establezca la plantilla de pico(Figura 2A). Establezca el área de plantilla con la variación más significativa entre las diferentes clases de picos.</li>
	<li>Utilice el análisis de componentes principales para separarlos en clústeres. Los métodos de agrupación en clústeres pueden variar entre diferentes laboratorios.</li>
	<li>Clasificar el pico de un límite mediante el algoritmo K-means.</li>
	<li>Correlacione la orientación con la velocidad de disparo del pico y trace las curvas de afinación de orientación para el ojo ipsilateral y contralateral.</li>
	<li>Calcular el índice OD para la unidad única, que representa la relación de resistencia de respuesta contralateral/ipsilateral: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60600/60600eq1a.jpg"> donde Rcontra y Ripsi son la respuesta óptima de la célula para el ojo contralateral e ipsilateral, respectivamente, y Rspon es la actividad espontánea de la célula.</li>
	<li>Asigne las puntuaciones de OD a 1–7 de la siguiente manera: de 1 a 0,75 a 1; 0,75 a 0,45 x 2; 0,45 a 0,15 x 3; 0,15 a 0,15 a 4; 0.15 a 0.45 a 5; 0,45 a 0,75 a 6; y de 0,75 a 1 x 7.</li>
	<li>Calcular el índice de sesgo contralateral (CBI): <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60600/60600eq2a.jpg"> donde N es el número de celda, y nx es igual al número de celda con puntuaciones OD iguales a x.</li>
</ol>

<ol><li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monocular+deprivation+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archiv+f%C3%BCr+experimentelle+Pathologie+und+Pharmakologie%22%5BJournal%5D)">Effects of monocular deprivation in kittens.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archiv für experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 248 (6), 492-497 (1964).</li>
<li>Daw, N. W., Fox, K., Sato, H., Czepita, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+for+monocular+deprivation+in+the+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Critical period for monocular deprivation in the cat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 67 (1), 197-202 (1992).</li>
<li>Guire, E. S., Lickey, M. E., Gordon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+for+the+monocular+deprivation+effect+in+rats%3A+assessment+with+sweep+visually+evoked+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Critical period for the monocular deprivation effect in rats: assessment with sweep visually evoked potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 81 (1), 121-128 (1999).</li>
<li>Wang, L., Sarnaik, R., Rangarajan, K. V., Liu, X., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+receptive+field+properties+of+neurons+in+the+superficial+superior+colliculus+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visual receptive field properties of neurons in the superficial superior colliculus of the mouse.</a> Journal of Neuroscience. 30 (49), 16573-16584 (2010).</li>
<li>Niell, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types%2C+circuits%2C+and+receptive+fields+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell Types, circuits, and receptive fields in the mouse visual cortex.</a> Annual Review of Neuroscience. 38 (1), 413-431 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+specific+interneurons+improves+V1+feature+selectivity+and+visual+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of specific interneurons improves V1 feature selectivity and visual perception.</a> Nature. 488 (8), 379-383 (2012).</li>
<li>Cossell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+excitatory+synaptic+strength+in+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of excitatory synaptic strength in primary visual cortex.</a> Nature. 518 (2), 399-403 (2015).</li>
<li>Lacaruso, M. F., Gasler, L. T., Hofer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+visual+space+in+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of visual space in primary visual cortex.</a> Nature. 547 (7), 449-452 (2017).</li>
<li>Metin, C., Godement, P., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+visual+cortex+in+the+mouse%3A+Receptive+field+properties+and+functional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The primary visual cortex in the mouse: Receptive field properties and functional organization.</a> Experimental Brain Research. 69 (3), 594-612 (1988).</li>
<li>Marshel, J. H., Garrett, M. E., Nauhaus, I., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+seven+mouse+visual+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of seven mouse visual cortical areas.</a> Neuron. 72 (6), 1040-1054 (2011).</li>
<li>Gordon, J. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+binocular+responses+in+the+primary+visual+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of binocular responses in the primary visual cortex of the mouse.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (10), 3274-3286 (1996).</li>
<li>McGee, A. W., Yang, Y., Fischer, Q. S., Daw, N. W., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+plasticity+of+visual+cortex+limited+by+myelin+and+Nogo+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Experience-driven plasticity of visual cortex limited by myelin and Nogo receptor.</a> Science. 309 (5744), 2222-2226 (2005).</li>
<li>Sawtell, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-dependent+ocular+dominance+plasticity+in+adult+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-dependent ocular dominance plasticity in adult visual cortex.</a> Neuron. 38 (6), 977-985 (2003).</li>
<li>Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D., Bonhoeffer, T., Hubener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+experience+enhances+plasticity+in+adult+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prior experience enhances plasticity in adult visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 127-132 (2006).</li>
<li>Crozier, R. A., Wang, Y., Liu, C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deprivation-induced+synaptic+depression+by+distinct+mechanisms+in+different+layers+of+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deprivation-induced synaptic depression by distinct mechanisms in different layers of mouse visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (4), 1383-1388 (2007).</li>
<li>Tagawa, Y., Kanold, P. O., Majdan, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+periods+of+functional+ocular+dominance+plasticity+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiple periods of functional ocular dominance plasticity in mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 380-388 (2005).</li>
<li>Lickey, M. E., Pham, T. A., Gordon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+contrast+visual+evoked+potentials+and+their+plasticity+following+monocular+deprivation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Swept contrast visual evoked potentials and their plasticity following monocular deprivation in mice.</a> Vision Research. 44, 3381-3387 (2004).</li>
<li>Cang, J., Kalatsky, V. A., Lowel, S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+intrinsic+signal+as+a+measure+of+cortical+plasticity+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the intrinsic signal as a measure of cortical plasticity in the mouse.</a> Vision Neuroscience. 22 (5), 685-691 (2005).</li>
<li>Khan, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+suturing+techniques+for+cystotomy+closure+in+canines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+%26+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different suturing techniques for cystotomy closure in canines.</a> Journal of Animal & Plant Sciences. 23 (4), 981-985 (2013).</li>
<li>Weisman, D. L., Smeak, D. D., Birchard, S. J., Zweigart, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+continuous+suture+pattern+with+a+simple+interrupted+pattern+for+enteric+closure+in+dogs+and+cats%3A+83+cases+%281991-1997%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of a continuous suture pattern with a simple interrupted pattern for enteric closure in dogs and cats: 83 cases (1991-1997).</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 214 (10), 1507-1510 (1999).</li>
<li>Heneghan, C. P. H., Thornton, C., Navaratnarajah, M., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+isoflurane+on+the+auditory+evoked+response+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22BJA%3A+British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Effect of isoflurane on the auditory evoked response in man.</a> BJA: British Journal of Anaesthesia. 59 (3), 277-282 (1987).</li>
<li>Mitzdorf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+source-density+method+and+application+in+cat+cerebral+cortex%3A+investigation+of+evoked+potentials+and+EEG+phenomenal%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomenal.</a> Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Presentamos un protocolo detallado para MD y medición de la plasticidad OD mediante grabación de una sola unidad. Este protocolo es ampliamente utilizado en la neurociencia visual. Aunque el protocolo MD no es complicado, hay algunos procedimientos quirúrgicos críticos que deben seguirse cuidadosamente. En primer lugar, hay dos detalles importantes que garantizan la calidad de la costura. La sutura es lo suficientemente estable si los puntos se concentran en la parte medial del párpado. Por otra parte, se aplica 3 l de p...

La privación visual monocular es un excelente paradigma experimental para examinar la plasticidad V1. Para estudiar la importancia de la experiencia visual en el desarrollo neuronal, David Hubel y Torsten Wiesel1,2 gatitos privados de visión normal en un ojo en varios momentos y durante diferentes períodos de tiempo. A continuación, observaron los cambios en la intensidad de respuesta en V1 para los ojos desfavorecidos y no desfavorecidos. Sus resultados mostraron un número anormalmente bajo de neuronas reaccionando al ojo que habíasido suturadas cerradas en los primeros tres meses. Sin embargo, las respuestas de las neuronas en los gatitos permanecieron idénticas en todos los aspectos a las de un ojo de gato adulto normal que fue suturado cerrado durante un año, y los gatitos no se recuperaron. El MD en gatos adultos no puede inducir plasticidad de la DO. Por lo tanto, el impacto de la experiencia visual en el cableado V1 es fuerte durante una fase breve y bien definida de desarrollo, antes y después de la cual los mismos estímulos tienen menos influencia. Tal fase de mayor susceptibilidad a la entrada visual se conoce como el período crítico en la corteza visual.
Aunque el ratón es un animal nocturno, las neuronas individuales en el ratón V1 tienen propiedades similares a las neuronas que se encuentran en los gatos3,4,5. En los últimos años, con el rápido desarrollo de la tecnología transgénica, un número cada vez mayor de estudios en neurociencia visual han utilizado ratones como modelo experimental6,7,8. En estudios visuales con ratones, los neurocientíficos utilizan mutantes y líneas de ratón noqueadas, que permiten controlar la composición genética de los ratones. Aunque los ratones V1 carecen de columnas OD, las neuronas individuales en la zona binocular V1 muestran propiedades significativas de La DoS. Por ejemplo, la mayoría de las células responden con más fuerza a la estimulación contralateral que a la estimulación ipsilateral. El cierre temporal de un ojo durante el período crítico induce un cambio significativo en la distribución del índice OD9,10,11. Por lo tanto, MD se puede utilizar para establecer un modelo de plasticidad de OD para investigar cómo los genes involucrados en trastornos del desarrollo neural influyen en la plasticidad cortical in vivo.
Aquí, introducimos un método experimental para MD y sugerimos un método comúnmente utilizado (grabación electrofisiológica) para analizar el cambio en la plasticidad de la DO durante la privación visual monocular. El método ha sido ampliamente utilizado en muchos laboratorios durante más de 20 años12,13,14,15,16. Hay otros métodos utilizados en la medición de la plasticidad De OD, como el potencial evocado visual crónico (VEP) que registra17,y las imágenes ópticas intrínsecas (IOI)18. La ventaja significativa de este método agudo es que es fácil de seguir, y los resultados son notablemente fiables.

<table><tbody><tr><td>502 pegamento</td><td>M& G Chenguang Papelería Co., Ltd.</td><td></td><td></td>AWG97028</tr><tr><td>Tarjeta de aprobación</td><td>Instrumento Nacional</td><td>PCI-6250</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Sistema A-M</td><td>Modelo 1800</td><td></td></tr><tr><td>Atropina</td><td>Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd</td><td>A135946-5</td><td></td></tr><tr><td>Aparato estereotáxico cerebral</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68001</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Cohan-Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Soluciones de lentes de contacto</td><td>Beijing Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GM17064</tr><tr><td>Hisopos de algodón</td><td>Henan Guangderun Medical Instruments Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas finas</td><td>SuZhou Stronger Medical Instruments Co., Ltd</td><td>CZQ1370</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>53320A</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>66 Visión Tech Co., Ltd.</td><td>53072</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>66 Visión Tech Co., Ltd.</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Stryker</td><td>TP 700 T</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador</td><td>Motic China Group Co., Ltd.</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>monitor LCD</td><td>Philips (China) Investment Co., Ltd.</td><td>39PHF3251/T3</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>SOPTOP</td><td>SZMT1</td><td></td></tr><tr><td>Monitor de signos vitales no invasivo</td><td>Mouseox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador hidráulico de aceite</td><td>NARISHIGE International Ltd.</td><td>PC-5N06022</td><td></td></tr><tr><td>Gel de ojos de vaselina</td><td>Dezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd.</td><td>17C801</td><td></td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido</td><td>Spike2 Versión 9</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>54010</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>54002</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de sutura</td><td>Ningbo Medical Co., Ltd</td><td>3/8 arco 2.5 * 8</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de tungsteno</td><td>FHC, Inc</td><td>L504-01B</td><td></td></tr><tr><td>Xilocaína</td><td>Huaqing</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la plasticidad de la privación visual monocular y la dominación ocular en la corteza visual primaria del ratón

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

La privación visual monocular es un excelente paradigma experimental para inducir la plasticidad de la respuesta cortical visual primaria. En general, la respuesta de la corteza al ojo contralateral a un estímulo es mucho más fuerte que la respuesta del ojo ipsilateral en el segmento binocular de la corteza visual primaria del ratón (V1). Durante el período crítico de los mamíferos, la sutura del ojo contralateral dará lugar a una rápida pérdida de capacidad de respuesta de las células V1 a la estimulación ocular contralateral. Con el desarrollo continuo de tecnologías transgénicas, cada vez más estudios utilizan ratones transgénicos como modelos experimentales para examinar los efectos de genes específicos en la plasticidad de la dominación ocular (OD). En este estudio, introducimos protocolos detallados para la privación visual monocular y calculamos el cambio en la plasticidad de la DoS en el ratón V1. Después de la privación monocular (MD) durante 4 días durante el período crítico, se miden las curvas de ajuste de orientación de cada neurona, y las curvas de afinación de la capa cuatro neuronas en V1 se comparan entre la estimulación de los ojos ipsilaterales y contralaterales. El índice de sesgo contralateral (CBI) se puede calcular utilizando la puntuación de DO ocular de cada célula para indicar el grado de plasticidad de la DoD. Esta técnica experimental es importante para estudiar los mecanismos neuronales de la plasticidad de la DoC durante el período crítico y para examinar las funciones de genes específicos en el desarrollo neuronal. La principal limitación es que el estudio agudo no puede investigar el cambio en la plasticidad neuronal del mismo ratón en un momento diferente.

Los resultados experimentales descritos aquí permiten mediciones exitosas de plasticidad MD y OD a partir de un ratón desfavorecido y sin desfundado durante el período crítico (P19–P32). La Figura 1 muestra cómo realizar grabaciones de una sola unidad en la capa 4 de V1 de la zona binocular para comparar las respuestas en el ojo ipsilateral y contralateral 4 días después de MD. La Figura 2 muestra la clasificación de picos y las mediciones de ajuste de orientaci...

Aquí, presentamos protocolos detallados para la privación visual monocular y el análisis de plasticidad de dominio ocular, que son métodos importantes para estudiar los mecanismos neuronales de la plasticidad visual durante el período crítico y los efectos de genes específicos en desarrollo visual.

Medición de la plasticidad de la privación visual monocular y la dominación ocular en la corteza visual primaria del ratón

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...

La privación visual monocular es un excelente protocolo experimental para inducir plasticidad de respuesta cortical visual primaria. Normalmente, las neuronas en el segmento binocular de la corteza visual primaria en el ratón responden aproximadamente dos veces más fuertemente a la estimulación del ojo contralateral que al ojo ipsilateral. Sin embargo, la sutura de cerrar el ojo contralateral durante el período crítico de plasticidad de dominancia ocular resulta en la rápida pérdida de capacidad de respuesta por parte de las neuronas V1 a la estimulación ocular contralateral y también seguido de un aumento posterior en la respuesta al ojo ipsilateral.Aquí, introducimos el protocolo experimental para la privación monocular y para sugerir un método comúnmente utilizado para analizar la tendencia en el dominio ocular durante la privación visual. Coloque las herramientas quirúrgicas en una caja de aluminio y autoclavelas por debajo de 120 grados centígrados durante media hora. Preparar una solución de 2% de agarosa en la tetera de agua y mantenerla a 75 grados centígrados.Aplica una fina capa de pomada ocular en ambos ojos. Bajo el microscopio anatómico con iluminación, suturar los párpados. Haz unos cuatro puntos.Haga de dos a tres nodos del subproceso. Aplicar tres microlitros de pegamento de secado instantáneo 502 en la cabeza del nodo para aumentar la estabilidad del nodo. A continuación, corte el hilo lo suficientemente corto.Cuando el ratón esté completamente despierto, colóquelos en una jaula de sujeción separada. Antes de la grabación electrofisiológica, utilice isoflurano para anestesiar al ratón. Retire los puntos y exponga el globo ocular.Recorte cuidadosamente el párpado. Enjuague los ojos con soluciones de lentes de contacto y compruebe la claridad de los ojos. Sólo se puede utilizar el ratón con buen estado de los globos oculares.Después de anestesiar el ratón, coloque el ratón sobre un marco estereotaxico. Utilice una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal durante todo el procedimiento. Aplica la pomada ocular sobre la superficie de los ojos para mantenerla húmeda.Retire el pelo del ratón para exponer su piel. Incise un ocho milímetros multiplicado por ocho milímetros de área de la piel entre ambas orejas para exponer el cráneo y eliminar el tejido del cuero cabelludo. A continuación, retire el tejido conectivo superblando con peróxido de hidrógeno.Taladre un agujero en el cráneo por encima del cerebelo. Fije un pequeño tornillo óseo en el agujero como referencia. Realizar una pequeña craneotomía de un milímetro de diámetro en la región binocular V1.Retire cuidadosamente el fragmento del cráneo sin dañar el cerebro. Cubra la superficie cortical expuesta con un 2% de agarosa para evitar el secado. Fijar un electrodo de tungsteno en el marco estereotaxico.Coloque el electrodo de tungsteno verticalmente en la región binocular V1 para asegurarse de que las células que se registran reaccionan a ambos ojos. El estímulo se separa 30 grados en un bloque aleatorio. En cada medición se presentaron un total de tres a cinco bloques.Enmascarar un ojo con placa de plástico no transparente. Presente LCD1 a la posición en 23 centímetros de los ojos del ratón. Avance el microelectrodo lentamente por el micromaniprógrafo hidráulico de aceite.Detener el avance de la señal de relación de ruido de señal alta cuando el electrodo está avanzado a la capa cuatro y iniciar la medición. Amplificamos las actividades de pico a un factor de 1.000 y lo filtramos de 300 a 10 kilohercios y luego lo probamos a 40 kilohercios. Luego enmascara el otro ojo y mide la respuesta del ojo contralateral.Las señales medidas por electrodos individuales son actividades de población. Utilice software para separar picos de diferentes celdas. Primero, filtre la señal de 500 a 5.000 hercios.Establezca dos cursores, uno para la desviación positiva y otro para los picos de desviación negativos. Configurar plantillas de pico. Establezca el área de plantillas donde muestra la mayor variación entre las diferentes clases de picos.Utilice el análisis de componentes principales para separarlos en clústeres. Clasificar los picos de un límite mediante el algoritmo de medios K. Correlacione la orientación con la velocidad de disparo de picos y trace las curvas de ajuste de orientación para los ojos ipsilaterales y contralaterales.A continuación, calcule el índice OD para celdas individuales que representa la respuesta contralateral e ipsilateral Asignar una puntuación OD para cada celda de acuerdo con el índice OD. Calcule el índice de sesgo contralateral de acuerdo con la fórmula. Este diagrama muestra las curvas de afinación de orientación del ojo ipsilateral y contralateral en ratón monocular privado y no privado.Este protocolo permite una privación visual monocular exitosa y una medición de dominio ocular de un ratón privado y no privado en el período crítico. Acabamos de mostrarle cómo lograr este experimento y habíamos analizado el cambio en el dominio ocular durante la privación visual. Durante el experimento, es importante evitar la infección en el proceso de sutura e interacción durante el registro electrofisiológico.Gracias por ver nuestro video.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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