Name: Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Aprende a medir constantes de disociación de interacciones proteína-lípido usando termoforesis a microescala marcada. Este método rápido y reproducible facilita el desarrollo farmacéutico temprano con bajo coste.

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Esta investigación fue apoyada por una subvención de la National Science Foundation (MCB 1818310) a la RAF. Este trabajo fue apoyado en parte por la Instalación Básica de Biología Química / Unidad de Cristalografía de Proteínas en el Centro oncológico H. Lee Moffitt (NIH / NCI: P30-CA076292).

1. Preparación de materiales
<ol><li>Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 y 2 mM KH2PO4, pH 7.41.</li>
	<li>Preparar el tinte NTA-Atto 647 N. Diluya el tinte NTA-Atto 647 N a 100 nM de una solución 100% DMSO en PBS sin Tween.</li>
	<li>Express Vam7-His8 – Proteína como proteína de fusión en E. coli y purificar mediante Cromatografía de Ni-NTA y exclusión de tamaño8.</li>
	<li>Valore el analito en el tampón PBS. Si el analito está en un tampón diferente, el MST etiquetado no es particularmente sensible a las diferencias menores del tampón de moléculas como el DMSO, a menos que el contenido del tampón de analito interactúe con la proteína marcada.</li>
</ol>2. Preparación del dispositivo MST
<ol><li>Encienda el interruptor de encendido en la parte posterior del dispositivo.</li>
	<li>Abra el software de control y asegúrese de que la computadora portátil esté encendida y en estado de conexión en la computadora conectada al dispositivo.</li>
	<li>Introduzca la configuración de fluorescencia y MST para este experimento. Establezca MST Antes a 3 s, MST en 30 s y Recuperación de fluorescencia (Fluo.) después de 1 s. Antes mide la fluorescencia inicial y no requiere largos tiempos; MST es la cantidad real de tiempo para que se alcance el equilibrio después de la inducción de calor.</li>
	<li>
Tabla de capilares: Para cada tubo capilar, ingrese el nombre del objetivo (ligando), el nombre del ligando (analito), la concentración del objetivo y la concentración de titulación más alta y use la relación de titulación de autollen. Por ejemplo, introduzca 50 nM para la concentración objetivo de Vam7-His8, Vam7-His8 para el nombre del objetivo, (ácido fosfatídico 1,2-dioctanoil) Di-C8 PA para el nombre del ligando, y la concentración más alta el ligando seleccionando 1:1 y arrastrándolo hacia abajo hasta las ranuras de autollenado 2-16.</li>
	<li>Ejecute un escaneo de tapa para seleccionar el LED apropiado (20% LED (preestablecido)) en función de la señal de la proteína objetivo y ajuste entre 200 y 2000 unidades de fluorescencia para MST etiquetado. Los escaneos de tapa deben mostrar picos uniformes redondeados en forma de campana.</li>
	<li>Seleccione un rango de potencias MST e ingrese valores para cada uno para probar el ajuste de unión más robusto y presione Start Cap Scan + Measurement, escaneando diferentes valores para determinar las mejores condiciones de operación para una interacción dada que se está probando.</li>
	<li>Determine la potencia MST con el mejor ajuste utilizando el software de análisis y el ajuste preestablecido para termoforesis con Tjump. Analice los ajustes de acuerdo con la mayor parte de la separación de fluorescencia entre la concentración más baja y la más alta en comparación con la potencia MST con el mejor ajuste y seleccione la potencia MST para replicar los ensayos.</li>
	<li>Determine si el fotoblanqueo se ha producido entre la primera y la segunda ejecución yendo al software de análisis y cambiando el análisis al modo experto. A continuación, seleccione fluorescencia en lugar de termoforesis para el análisis. Seleccione el modo experto y luego el fotoblanqueo.</li>
</ol>3. Preparación de muestras para MST etiquetado
<ol><li>Lleve la solución Vam7-His8 a una concentración de 200 nM en PBS sin Tween.</li>
	<li>Lleve el tinte NTA-Atto 647 a 100 nM en PBS sin Tween.</li>
	<li>Mezcle el tinte Vam7-His8 y NTA-Atto 647 en una proporción volumétrica de 1:1 y deje reposar a temperatura ambiente cubierto de luz durante 30 min. Determinar la concentración adecuada de proteína diana como en la sección 2.5 (ver Suplemento sobre la utilización de KD de colorante Ni-NTA como se demuestra en vídeo).</li>
	<li>Mezcla centrífuga de colorante NTA-Atto 647 N y proteína durante 10 min en una habitación oscura utilizando una centrífuga de mesa a aproximadamente 8.161 x g.</li>
	<li>Guarde la mezcla a 4 °C después del experimento o en hielo durante el experimento para reutilizarla en unas pocas horas si es necesario para evitar que la proteína se desnaturalice.</li>
	<li>Utilice el buscador de concentración NT para determinar el rango de concentración necesario para la titulación.</li>
	<li>Llevar Di-C8 PA a la concentración máxima adecuada en agua.</li>
	<li>Valore el analito utilizando una dilución en serie 1:1 en tampón PBS para 16 concentraciones basadas en el paso anterior. A diferencia de SPR, la termoforesis no es tan sensible a las diferencias de amortiguación.</li>
</ol>4. MST de muestras
<ol><li>Encienda el dispositivo y la computadora portátil conectada.</li>
	<li>Presione la flecha hacia arriba en la parte frontal de la máquina y deslice la rejilla capilar hacia afuera.</li>
	<li>Cargue los capilares en el bastidor con la mayor concentración en la posición 1.</li>
	<li>En el software de control, seleccione el canal rojo correspondiente a NTA-Atto 647 N.</li>
	<li>Introduzca la información de concentración, posición y nombre de cada capilar en la Tabla de capilares.</li>
	<li>Ejecute un escaneo capilar presionando Start Cap Scan al 20% de LED (preestablecido) y ajuste de acuerdo con entre 200 y 2000 unidades de fluorescencia utilizando la configuración de intensidad del LED o la concentración de ligando (proteína etiquetada).</li>
	<li>Seleccione un rango de potencia MST.</li>
	<li>Inicie El escaneo de la tapa + medición MST.</li>
	<li>Analice utilizando el software de análisis.</li>
</ol>5. Análisis de los datos del MST
NOTA: El software de análisis proporcionado por Nanotemper es propietario y se realiza utilizando M.O. Affinity Analysis. Existen diferentes formas de medir las afinidades de unión basadas en la fluorescencia o la termoforesis. Las versiones más recientes de este software están preestablecidas para evaluar automáticamente los datos mediante termoforesis y están preestablecidas para usar Thermophoresis con Tjump aprovechando ambas mediciones. Alternativamente, se puede seleccionar Tjump solo o Termoforesis solo. Además, el software de análisis permite mediciones de afinidad estimada utilizando fluorescencia inicial. Solo se puede acceder a esta configuración en modo experto.
<ol><li>Establezca la estrategia de evaluación en el software de análisis en experto haciendo clic en el cuadro del rayo junto a un conjunto de datos en la pantalla Selección de datos. El software de análisis está preestablecido para analizar a MST Analysis; sin embargo, un investigador puede seleccionar Crear nuevo análisis y seleccionar Análisis de fluorescencia inicial para estimar las afinidades de unión basadas en la fluorescencia inicial. El modo experto también está disponible para la fluorescencia inicial. En el análisis descrito a continuación, se utilizó termoforesis y Tjump para determinar el KD del presentado de Vam7-His8 con su sustrato natural, el ácido fosfatídico lipídico.</li>
</ol>

<ol><li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScale+Thermophoresis%3A+Interaction+analysis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
<li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues%3A+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li>
<li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100(2010).</li>
<li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li>
<li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li>
<li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+%28Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor%29+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+%28Phox+Homology%29+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li>
<li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li>
<li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+proteins%3A+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Immunitat+und+Infektion%22%5BJournal%5D)">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li>
<li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li>
<li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li>
<li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening%3A+A+European+Lead+Factory+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li>
<li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA%2B+protein+NSF%2FSec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existe un posible conflicto de intereses.

La determinación de Vam7-His8unión a DiC8-PA proporcionó un KD ajustado robusto para la interacción dada, que es una afinidad ligeramente menor que el KD medido de Vam7-His8 a los liposomas pa (no publicado). Esta diferencia se debe muy probablemente a la falta de una membrana, lo que generalmente resulta en una menor afinidad por las interacciones de unión lipídica específicas de la membrana y, por lo tanto, demuestra el papel del andamio de membrana del liposoma...

La termoforesis a microescala es una técnica relativamente nueva para determinar constantes de disociación (KD) y constantes de inhibición (IC50) entre ligandos bioquímicamente relevantes. El minorista comercial líder para MST (por ejemplo, NanoTemper) ofrece dos tecnologías populares de MST: 1) MST sin etiquetas que requiere una etiqueta fluorescente, y 2) termoforesis etiquetada utilizando la fluorescencia inherente de proteínas dependientes del número de residuos aromáticos presentes en cada proteína1. Una desventaja de la termoforesis sin etiqueta es que, en la mayoría de los casos, no permite la medición de las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, puede ser posible diseñar proteínas sin aminoácidos aromáticos como el triptófano para su uso en la termoforesis sin etiqueta2.
MST mide el movimiento de partículas en respuesta a la inducción de campos de temperatura microscópicos iniciados por un láser infrarrojo en las tecnologías actualmente disponibles1. MST se puede utilizar para medir las interacciones proteína-proteína, las interacciones proteína-lípido, la molécula pequeña de proteína, los experimentos de competencia e incluso las interacciones entre moléculas pequeñas, siempre y cuando se pueda producir suficiente separación de señales. Además, MST permite la medición de interacciones basadas en membrana-proteína incrustadas en liposomas o nanodiscos. La termoforesis etiquetada aprovecha el uso de etiquetas marcadas fluorescentemente que permiten la separación químicamente controlable de la señal entre el ligando y el analito. Los valores de KD se pueden obtener mediante termoforesis para interacciones que implican la unión a proteínas a bajas concentraciones nanomolares, que en la mayoría de los casos es una concentración de proteína mucho menor que la requerida para la calorimetría isotérmica (ITC)3. Además, MST no tiene requisitos de amortiguación estrictos como se requiere para la resonancia de plasmón de superficie (SPR)4 y la termoforesis etiquetada incluso se puede usar para medir constantes de unión de proteínas de interés a partir de soluciones proteicas no completamente purificadas5 con etiquetas fluorescentes insertadas genéticamente6. Una desventaja de MST es que los parámetros cinéticos no se pueden obtener fácilmente para MST como en SPR2.
Las mediciones de termoforesis dependen de la diferencia de temperatura local de una solución. Este calor se puede generar a partir de un láser infrarrojo. El dispositivo MST tiene un detector de fluorescencia acoplado a un haz infrarrojo (IR) y puede detectar cambios en la fluorescencia de los cambios de concentración local de las moléculas fluorescentes en el punto donde se dirige el láser IR. El dispositivo MST utiliza un láser dirigido a IR acoplado directamente a un detector de fluorescencia enfocado en el mismo punto en el que se genera el calor en la solución. Esto permite una detección robusta de los cambios de temperatura correspondientes al agotamiento de las moléculas en el punto de calor generado por el láser IR. La fluorescencia medida generalmente disminuye más cerca del láser IR en respuesta a los aumentos de temperatura. Las diferencias medidas como resultado pueden deberse a múltiples factores, incluida la carga, el tamaño o la entropía de la solvatación. Estas diferencias se miden como cambios en la fluorescencia en respuesta a la inducción de calor o al movimiento de moléculas de partes calientes a más frías del capilar.
Al cargar un capilar con una solución dada, es importante dejar aire en cada extremo del capilar y no cargar el capilar completamente lleno. El capilar comercial contiene aproximadamente 10 μL de solución. Uno puede lograr mediciones precisas con 5 μL de solución siempre que la solución se manipule hasta el centro del capilar, no haya burbujas de aire (potencialmente desgasificación antes de la carga capilar), y uno tenga cuidado al cargar el bastidor para no empujar la solución desde el centro del capilar, donde se dirige el láser infrarrojo. Si el láser no entra en contacto completamente con la solución, lo más probable es que el resultado sea una de las tres salidas inutilizables para esa concentración: 1) detección de fluorescencia nula o baja, 2) detección de fluorescencia más alta (potencialmente con pico irregular), o 3) detección de fluorescencia dentro de otros valores de titulación dada, pero con un pico irregular y no redondeado.
Para la termoforesis etiquetada es óptimo tener una señal de fluorescencia por encima de 200 y por debajo de 2000 unidades de fluorescencia7. El dispositivo MST utiliza un rango de intensidades LED de 0 a 100, que se pueden seleccionar para lograr una señal superior a 200 o inferior a 2000. Alternativamente, se pueden usar diferentes concentraciones del ligando marcado para modificar la señal de fluorescencia a un nivel óptimo. Es importante ejecutar un escaneo de tapa con una medición MST dada como referencia al analizar datos, ya que un escaneo de tapa deficiente a menudo puede resultar en un punto que luego se puede determinar que es un valor atípico. Cada carrera debe tomar aproximadamente 30 minutos si se mide una sola potencia MST con un escaneo de tapa. Los dispositivos comerciales permiten cambios en la potencia MST. En versiones de software anteriores, esto se podía establecer de 0 a 100; y en versiones posteriores se puede seleccionar MST bajo, medio o alto. Para lograr trazas robustas, un investigador puede necesitar probar cada una de ellas y decidir qué configuración de MST da como resultado los datos más robustos para una interacción determinada.

<table><tbody><tr><td>Cy5 Maleimida Colorante Mono-Reactivo GE</td><td>Healthcare</td><td>PA23031</td><td>para el etiquetado de proteínas</td></tr><tr><td>Graphpad Prsim</td><td>Graphpad software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115 Capilares (1000 unidades)</td><td>Nanotemper</td><td>MO-K022</td><td>Capilares para máquina MST</td></tr><tr><td>Monolith NT.115</td><td>Equipo universitario</td><td>Nanotemper</td><td></td></tr><tr><td>NTA-Atto 647 N</td><td>Sigma</td><td>2175</td><td>etiqueta para sus etiquetas</td></tr><tr><td>Fosfatidilinositol 3-fosfato diC8 (PI(3)P diC8)</td><td>Echelon</td><td>P-3008</td><td>Lípidos para experimentos de unión</td></tr></tbody></table>

uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

La capacidad de determinar la afinidad de unión de los lípidos a las proteínas es una parte esencial de la comprensión de las interacciones proteína-lípido en el tráfico de membranas, la transducción de señales y la remodelación citoesquelética. Las herramientas clásicas para medir tales interacciones incluyen la resonancia de plasmón de superficie (SPR) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Si bien son herramientas poderosas, estos enfoques tienen contratiempos. ItC requiere grandes cantidades de proteína purificada, así como lípidos, que pueden ser costosos y difíciles de producir. Además, el ITC y el SPR consumen mucho tiempo, lo que podría aumentar significativamente el costo de realizar estos experimentos. Una forma de evitar estas restricciones es utilizar la técnica relativamente nueva de termoforesis a microescala (MST). MST es rápido y rentable utilizando pequeñas cantidades de muestra para obtener una curva de saturación para un evento de unión dado. Actualmente hay dos tipos de sistemas MST disponibles. Un tipo de MST requiere etiquetado con un fluoróforo en el espectro azul o rojo. El segundo sistema se basa en la fluorescencia intrínseca de los aminoácidos aromáticos en el rango UV. Ambos sistemas detectan el movimiento de las moléculas en respuesta a la inducción localizada de calor de un láser infrarrojo. Cada enfoque tiene sus ventajas y desventajas. El MST sin etiquetas puede usar proteínas nativas sin etiquetar; sin embargo, muchos analitos, incluidos los productos farmacéuticos, emiten fluorescencia en el rango UV, lo que puede interferir con la determinación de valores precisos de KD. En comparación, el MST etiquetado permite una mayor diversidad de interacciones medibles por pares utilizando sondas marcadas fluorescentemente unidas a ligandos con absorbancias medibles en el rango visible en lugar de UV, lo que limita el potencial de interferencia de señales de analitos.

Esta es una salida de muestra utilizando el análisis de afinidad. El MST etiquetado se utilizó para determinar la constante de unión del Vam7-His8 al dioctanoilo soluble (DiC8) PA de uno de sus sustratos naturales9. La Figura 1 presenta los rastros termoforéticos de un ensayo de una titulación 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 μM contra 50 nM de Vam7-His8. Se muestra la fluorescencia inicial (tiempo antes de que se encienda el láser infrarrojo), Tjump (tiempo inicialment...

La termoforesis a microescala obtiene constantes de unión rápidamente a bajo costo de material. La termoforesis a microescala etiquetada o sin etiqueta está disponible comercialmente; sin embargo, la termoforesis sin etiquetas no es capaz de la diversidad de mediciones de interacción que se pueden realizar utilizando etiquetas fluorescentes. Proporcionamos un protocolo para mediciones de termoforesis etiquetadas.

Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

La termoforesis a microescala etiquetada obtiene constantes de disociación, o KD, de diversas interacciones bioquímicas de manera eficiente. Este protocolo y el vídeo que lo acompaña dan la afinidad aproximada por Vam7, la única proteína SNARE soluble en levadura, al ácido fosfatídico. Esta es la forma en que Vam7 se asocia con dos membranas antes de interactuar con otras proteínas.Este método obtiene KDs rápidamente para diversas interacciones bioquímicas a bajo costo, con alta reproducibilidad y con un costo mínimo de proteínas. Esta técnica es adecuada para el desarrollo farmacéutico en primera etapa, lo que permite que los KD fácilmente obtenibles determinen posibles compuestos de plomo. Antes de comenzar un análisis, encienda el interruptor de encendido en la parte posterior del dispositivo MST y abra el software de control.Confirme que el equipo está conectado al dispositivo y en estado conectado y establezca el MST Antes en 3 segundos, el MST en 30 segundos y la Recuperación de fluorescencia en después de 1 segundo. Para cada tubo capilar, ingrese el nombre del ligando objetivo, el nombre del analito del ligando, la concentración del objetivo y la concentración de titulación más alta utilizando la relación de titulación de autollen. Seleccione un rango de potencias MST e introduzca valores para cada potencia para probar el ajuste de unión más robusto.Para preparar muestras de MST etiquetadas, diluya una solución de Vam7-octahistidina a una concentración de 200 nanomolares y un colorante NTA-Atto 647 a una concentración nanomolar de 100, ambos en PBS. Mezcle el Vam7-octahistidina y el tinte NTA-Atto 647 en una proporción volumétrica de 1:1 y deje que la mezcla permanezca a temperatura ambiente protegida de la luz durante 30 minutos. Al final de la incubación, centrífuga la mezcla de colorante y proteína y almacene la solución a 4 grados centígrados hasta unas horas antes de su uso.Luego, prepare la muestra, tome el ligando teñido y exponga el analito. Para la termoforesis a microescala de la muestra, abra el dispositivo y deslice el estante capilar hacia afuera. Cargue los capilares de muestra en el bastidor con la mayor concentración en la posición uno y seleccione el canal rojo en el software de control.Luego, cargue el bastidor en el instrumento. A continuación, seleccione un rango de potencia MST e inicie la medición MST de Cap Scan y evalúe la respuesta de desplazamiento. Aquí se muestran los rastros termoforéticos de un ensayo de una titulación 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 micromoles contra 50 nanomolares NTA-Atto 647 marcados como dominio Vam7.Se puede observar la fluorescencia inicial, el salto de tiempo y la termoforesis, lo que permite calcular KD a partir de cualquiera o una combinación de estas mediciones. Se puede trazar una curva de saturación a partir de estos resultados, por ejemplo, para la termoforesis con la salida de salto de tiempo, como se ilustra en el gráfico. Generalmente, los resultados de MST se determinan utilizando la escala logarítmica, teniendo en cuenta la concentración de proteínas para determinar la afinidad de unión seleccionando el modelo KD e ingresando la concentración de proteínas.Al realizar este protocolo, asegúrese de que la solución esté en el centro del capilar y que no haya burbujas de aire y que el capilar no tenga polvo o solución en el exterior del capilar. La calorimetría de titulación isotérmica o la resonancia de plasmón de superficie podrían utilizarse para validar el KD experimental obtenido. Si existe una posible vinculación cooperativa, el ITC sería el siguiente método lógico realizado, dados los recursos.Esta técnica ha permitido a los investigadores de biología tradicional incorporar técnicas de detección biofísica en su investigación para determinar las relaciones de vía. Un ejemplo de esta técnica es la lisasa celular con la proteína diana expresada endógenamente, donde la etiqueta GFP es una forma novedosa de realizar un ensayo tradicional de pull-down.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video muestra la termoforesis a microescala para estudiar la interacción proteína-lípido. El ensayo detecta la interacción entre moléculas cuantificando el movimiento termoforético de las proteínas marcadas con fluorescencia en respuesta a un gradiente de temperatura. La molécula fluorescente se mezcla con diferentes concentraciones de moléculas lipídicas no fluorescentes, y la mezcla de moléculas en la solución se carga en capilares. Se aplica un gradiente de temperatura a las muestras en...

Termoforesis a microescala para estudiar las interacciones proteína-lípidos en solución

Este video muestra una técnica de microgravimetría disipativa para investigar la unión de proteínas a bicapas lipídicas. Se añaden pequeñas vesículas unilaminares para recubrir la superficie del sensor de cuarzo de una microbalanza. Utilizando la unión dependiente de iones de calcio de la proteína de unión a fosfolípidos objetivo a la bicapa, se monitorean los cambios en la frecuencia de oscilación del sensor y la disipación de la oscilación para determinar la naturaleza de la unión de la...

Técnica de microgravimetría disipativa para estudiar la interacción proteína-bicapa lipídica

En este video, demostramos las interacciones proteína-fosfoinositida en un patrón microfluídico utilizando el ensayo de modulación de pH, utilizando un colorante fluorescente sensible al pH marcado con el lípido de fosfatidiletanolamina de una bicapa lipídica soportada, llamada plataforma microfluídica. Las modulaciones en el pH después de la unión de proteínas a fosfolípidos causan extinción de fluorescencia.

Ensayo de modulación del pH en bicapas lipídicas soportadas para detectar interacciones proteína-fosfoinositida

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

La fluorimetría diferencial de barrido es un método ampliamente utilizado para el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de interacciones con proteínas. Aquí, presentamos un método sencillo para ampliar estos análisis para proporcionar una estimación de la constante de disociación entre una molécula pequeña y su proteína asociada.

Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

Resonancia de plasmón superficial (SPR) es un método de etiqueta libre para la detección de interacciones biomoleculares en tiempo real. En esto, un protocolo para una proteína de membrana: la interacción experimento receptor se describe, mientras se discuten las ventajas y desventajas de la técnica.

Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

La termoforesis a microescala (MST) es una tecnología sensible para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo. Este manuscrito describe un protocolo MST para caracterizar las interacciones aptámero-molécula pequeña.

Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

Aquí, presentamos un protocolo para la producción y purificación de proteínas que están marcados con isótopos estables y posterior caracterización de las interacciones de la proteína-proteína usando la espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Los experimentos de Thermophoresis (MST).

Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST)

Este artículo describe los protocolos para la preparación de muestras, la reducción de datos y el análisis de datos en estudios de eco de espín de neutrones (NSE) de membranas lipídicas. El etiquetado juicioso de los lípidos con deuterio permite el acceso a diferentes dinámicas de membrana en escalas de longitud y tiempo mesoscópicas, sobre las cuales ocurren procesos biológicos vitales.

Espectroscopía de eco de espín de neutrones como una sonda única para la dinámica de la membrana lipídica y las interacciones membrana-proteína

Este protocolo combina la fotometría de masas con un novedoso sistema de microfluídica para investigar las interacciones proteína-proteína de baja afinidad. Este enfoque se basa en la dilución rápida de complejos altamente concentrados en solución, lo que permite mediciones de baja afinidad y amplía la aplicabilidad de la fotometría masiva.

Análisis de la formación de complejos proteicos a concentraciones micromolares mediante el acoplamiento de microfluídica con fotometría de masas

Aprende a medir constantes de disociación de interacciones proteína-lípido usando termoforesis a microescala marcada. Este método rápido y reproducible facilita el desarrollo farmacéutico temprano con bajo coste.

Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido

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