Combinación de microdisección de captura láser y qPCR microfluídico para analizar perfiles transcripcionales de células únicas: un enfoque de biología de sistemas para la dependencia de opioides

Este es un método altamente preciso y rentable para entender la expresión génica a nivel de célula única. La principal ventaja de esta técnica es que podemos colocar 96 muestras en un lote. Este alto número de muestras nos permite identificar subfenotipos celulares con una especificidad anatómica.

La canalización de este método se puede aplicar a cualquier problema biológico, cualquier sistema, cualquier tejido, con el fin de preguntar en cuanto a la respuesta celular individual de las neuronas individuales u otros tipos celulares a la enfermedad o cualquier otra perturbación, cualquier función. Y luego ir más allá y preguntar si esas respuestas celulares tienen una arquitectura anatómica. Retire el cerebro de la caja de recolección de tejidos y colóquelo en el mandril del criostato.

Recoger secciones de 10 micras que contienen el núcleo central de la amígdala u otra región cerebral preferida mediante el deshielo del montaje de secciones de 10 micras en diapositivas de vidrio liso. Coloque inmediatamente los portaobjetos de vidrio sobre una sartén de metal que descansa sobre hielo seco. Coloque las diapositivas con secciones cerebrales en un congelador de menos 80 grados Centígrados tan pronto como sea posible.

Para realizar una serie de deshidratación de etanol y xileno, primero sumerja los portaobjetos en 75% etanol durante 30 segundos. Inmediatamente después, sumerja los portaobjetos en 95% etanol durante 30 segundos. A continuación, sumerja las diapositivas en 100% etanol durante 30 segundos.

Por último, sumerja las diapositivas directamente en un segundo recipiente de 100% etanol durante 30 segundos. Después de la serie de deshidratación de etanol, sumerja los portaobjetos en xileno recién vertido durante un minuto. Inmediatamente después, sumerja las diapositivas en un segundo recipiente de xileno durante cuatro minutos antes de secarse como se describe en el protocolo de texto.

Utilice fluorescencia para identificar el tipo de célula teñida y su núcleo en la región de interés. Elija una celda o varias celdas si realiza muestras agrupadas de una sola celda. Marque las células de interés utilizando la microdisección de captura láser o el software LCM.

Coloque la tapa LCM en la parte superior de la rebanada en la región de interés y derrita el adhesivo de tapa LCM sobre el área de la celda única seleccionada como se describe en el protocolo de texto. Seleccione las celdas individuales que se recopilarán para el análisis utilizando las herramientas de software LCM. Las células seleccionadas deben estar en el área anatómica del núcleo central de la amígdala según el atlas cerebral de la rata y el bregma.

Las células deben ser al menos tres micras de los núcleos manchados adyacentes. A continuación, dispare el láser infrarrojo para recoger las células individuales identificadas. Coloque la tapa en la estación de control de calidad y visual visualmente para asegurarse de que solo se seleccionaron las celdas deseadas.

Si otras células fueron seleccionadas por error, se puede utilizar un láser ultravioleta para destruir las células no deseadas mientras la tapa permanece en la estación de control de calidad. Tome una foto de la sección de tejido desde donde se recogió la célula para documentar su especificidad anatómica. Registre la distancia de la rebanada del bregma si procede utilizando un atlas de cerebro de rata como referencia.

Retire la tapa LCM de la estación QC y conecte el dispositivo de extracción de muestras. A continuación, pipetear 5,5 microlitros de tampón de lysis sobre la muestra. Coloque el dispositivo de extracción en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros y colóquelo en una placa caliente a 75 grados centígrados durante 15 minutos.

Gire hacia abajo la muestra y el búfer de lelisis durante 30 segundos a baja velocidad y coloque la muestra recogida en un congelador de menos 80 grados Centígrados. Para realizar la preamplificación del ARNm de una sola célula para un chip de matriz dinámica, agregue primero cinco microlitros de VILO 5X a cada pocero de una nueva placa PCR de 96 por 96. Retire las muestras de células individuales de LCM de menos 80 grados Celsius y deje que se descongelen brevemente.

Después de la centrifugación a baja velocidad, agregue 5,5 microlitros de las muestras de celda única de lesed a la placa PCR añadiendo cada muestra a su propio pozo. Coloque la placa PCR con las muestras y VILO en el termociclador y caliente a 65 grados Celsius durante un minuto y medio. A continuación, gire la placa durante un minuto a 1, 300 veces g y cuatro grados Celsius y coloque la placa sobre hielo.

Agregue la mezcla maestra de síntesis de cDNA 10X, la proteína T4 Gene 32 y el tampón de suspensión de ADN a cada pozo. Coloque la placa PCR que es la placa de muestra uno en el termociclador y funcione como se detalla en el protocolo de texto. Después del ciclo, agregue nueve microlitros de solución de Taq polimerasa a cada pozo en la placa PCR de 96 pozos.

Nueve microlitros consisten en 7,5 microlitros de mezcla maestra de polimerasa Taq y 1,5 microlitros de la piscina de imprimación. Ahora, coloque la placa PCR en el termociclador y ejecute el programa de preamplificación detallado en el protocolo de texto. Siguiendo el protocolo de preamplificación, agregue seis microlitros de solución exonucleasa a cada pocóctil en la placa PCR de 96 pocillos.

La solución de exonucleasa consta de 0,6 microlitros de 10X exonucleasa-un tampón de reacción, 1,2 microlitros de exonucleasa-uno, y 4,2 microlitros de tampón de suspensión de ADN. Coloque la placa PCR en el termociclador y ejecute el programa que aparece en el protocolo de texto. Por último, añada 54 microlitros de tampón TE a cada pozo de la placa de muestra uno.

Gire la placa PCR a 1.300 veces g durante cinco minutos. Almacene a cuatro grados centígrados si continúa inmediatamente con el siguiente paso. En una nueva placa PCR de 96 pozos que es la placa de muestra dos, agregue cinco microlitros de tinte de unión de ADN y solución de mezcla maestra.

Agregue tres microlitros de muestras preamplificadas de la placa de muestra uno en los pozos correspondientes en la placa de muestra dos. Gire la placa PCR a 1.300 veces g y luego coloque la placa sobre hielo. En una nueva placa PCR de 96 pozos que es la placa de ensayo dos, agregue cinco microlitros de solución de carga de ensayo a cada pozo.

La solución de carga de ensayos consta de 3,75 microlitros de reactivo de carga de ensayo 2X GE y 1,25 microlitros de tampón de suspensión de ADN por pozo. A continuación, añada 2,5 microlitros de imprimación qPCR de 10 micromolares de la placa de ensayo uno a su correspondiente pozo en la placa de ensayo dos. Gire la placa PCR a 1.300 veces g durante cinco minutos.

Para cargar y ejecutar el chip de matriz dinámica, primero primerte el chip con fluido de línea de control. A continuación, coloque el chip en un controlador IFC HX y ejecute el script 136X primo. Agregue seis microlitros de la placa de muestra dos en los pozos de muestra correspondientes en el chip de matriz dinámica de 96 por 96.

Ahora, agregue seis microlitros de la placa de ensayo dos en los pozos de ensayo correspondientes en el chip de matriz dinámica de 96 por 96. Utilice agujas para hacer estallar cualquier burbuja de aire en los pozos del chip de matriz dinámica de 96 por 96. A continuación, coloque el chip en el controlador IFC HX y ejecute el script 136X de la mezcla de carga.

A continuación, retire el chip del controlador IFC HX. Coloque el chip de matriz dinámica de 96 por 96 en una plataforma RT-qPCR microfluídica y ejecute el protocolo GE fast 96 by 96 PCR. La selección de las células individuales fue validada tanto visual como molecularmente. Visualmente, la morfología celular fue vista antes de la recolección celular.

Aquí se muestran imágenes representativas de un tobogán con forebraína de rata hemicagó con el núcleo central de la amígdala. Las imágenes posteriores muestran la selección de células individuales y su extracción del tejido para el análisis transcriptómico. Molecularmente, los marcadores específicos de tipo de celda demostraron un aumento de la expresión en su tipo de celda respectivo.

Específicamente, se observó un aumento de la expresión de NeuN en las neuronas, Maf en microglia y Gfap en astrocitos. El mapa de calor muestra la expresión de todas las muestras en 40 genes ensayados. Las filas son muestras agrupadas de tracción, los números denotan los racimos de muestra y las columnas son los genes.

Los métodos de análisis multivariante muestran que los astrocitos en el grupo de abstinencia eran el tipo de célula más afectado. Sobre la base de estos datos en el contexto de otros estudios, los astrocitos probablemente desempeñan un papel clave en la inflamación en el núcleo central de la amígdala durante la abstinencia de opioides. Lo más importante a recordar acerca de esta técnica es utilizar el pipeteo adecuado para limitar el número de burbujas de aire.

Los hallazgos transcripcionales de estos experimentos se pueden validar utilizando métodos de medición de proteínas como la inmunofluorescencia o la mancha occidental en el mismo tejido.