Name: Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Aprende a generar tumores pancreáticos ortotópicos en modelos murinos y caracterizar la citotoxicidad de células T infiltrantes mediante digestión enzimática rápida y citometría de flujo. Este protocolo permite evaluar respuestas inmunes en el microambiente tumoral.

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Nos gustaría agradecer al Servicio de Técnicos Animales y a la Dra. Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University de Londres, Londres, Reino Unido) por su asistencia durante la cirugía ortotópica. También queremos agradecer a la Dra. Jennifer Morton (Instituto Beatson para la Investigación del Cáncer, Glasgow, Reino Unido) por su orientación en técnica quirúrgica, la Dra. Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University de Londres, Londres, Reino Unido) por su consejo sobre la digestión tumoral y la Dra. Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University de Londres, Londres, Reino Unido) por su asesoramiento en relación con los protocolos de estimulación celular ex vivo T. También queremos dar las gracias al Consejo de Investigación Médica (MRC), al Fondo de Investigación del Cáncer de Páncreas (PCFR) y a la Acción del Cáncer de Ovario, que financió esta investigación.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los modelos in vivo del cáncer de páncreas proporcionan herramientas inestimables para comprender la progresión de la enfermedad y evaluar nuevas dianas terapéuticas3. El modelo ortotópico en particular es un modelo rentable y reproducible que se puede aplicar en grandes cohortes de ratones simultáneamente4,27. El modelo ortotópico también proporciona el microambiente cognado y el sistema inmune intacto para el crecimiento tumoral, por lo que es más apropiado que los modelos subcutáneo y PDX. Sin embargo, hemos encontrado que algunos elementos de infiltración inmune pueden diferir entre el modelo ortotópico y ratones KPC, el estándar de oro murino modelo10. Una razón para esto podría ser el crecimiento acelerado del tumor visto en el modelo ortotópico. Se han descrito otras diferencias en la densidad de los subconjuntos de células inmunitarias entre los modelos ortotópicos y subcutáneos3,28. Por lo tanto, aunque el modelo transgénico de KPC es más costoso y variable6,los hallazgos clave deben verificarse en una pequeña cohorte de ratones KPC siempre que sea posible.
La preparación de células tumorales para la cirugía ortotópica es un paso crítico en el protocolo. Las células siempre deben estar en la fase log del crecimiento y sin micoplasma y sin infecciones. La cirugía ortotópica debe posponerse si hay alguna preocupación sobre el crecimiento de las células tumorales. El uso de membrana del sótano mejora la tasa de incidencia tumoral sobre las células inyectantes sinella 29 y reduce la fuga celular y, por lo tanto, la propagación peritoneal27. Sin embargo, una vez suspendidas en la membrana del sótano, las células tumorales deben inyectarse rápidamente (dentro de 2 horas) para evitar cualquier pérdida celular. Es probable que el número de células tumorales necesarias para generar tumores dependa de la línea celular, y se debe analizar un rango de números celulares (por ejemplo, de 100 a 100.000) que también puede determinar el tiempo para alcanzar el punto final. Es probable que haya un margen de error al preparar 1.000 celdas por ratón para inyección; por lo tanto, si se requieren varios días de cirugía, el tratamiento de los grupos debe extenderse por igual a lo largo de los días para controlar los efectos por lotes. La mayoría de los pasos quirúrgicos se pueden modificar dependiendo de las preferencias; sin embargo, se debe tener cuidado de no alterar la membrana del sótano al reemplazar el páncreas en la cavidad abdominal o cerrar la pared peritoneal. La fuga de membrana del sótano puede causar crecimiento de las células tumorales en la pared peritoneal, que se forman rápidamente y pueden resultar en tener que sacrificar al animal antes.
Idealmente, los tumores pancreáticos deben digerirse rápidamente después de la cosecha y prepararse para la estimulación ex vivo inmediatamente. Sin embargo, esto podría no ser posible si hay un gran lote de tumores para cosechar, en este caso los tumores deben mantenerse en hielo y digerirse en lotes. Se ha demostrado que el tipo, la concentración y la duración de la exposición a las enzimas digestivas afectan a un gran número de moléculas superficiales en las células inmunitarias30,31,32. El tiempo de digestión también es deliberadamente corto para limitar la muerte celular33. Las células digeridas se pueden congelar en medio de congelación para almacenamiento a largo plazo; sin embargo, alguna pérdida celular ocurrirá al descongelarse. El proceso de digestión puede ser menos que óptimo si las piezas tumorales no están suficientemente cortadas en cubos antes de la incubación de la colagenasa y esto será evidente ya que las piezas tumorales duras permanecerán en el filtro después de la digestión. La concentración de colagenasa se puede reducir si se trabaja con páncreas sano o tumores en estadio temprano; informes sobre la extracción de células ductales pancreáticas saludables utilizan concentraciones significativamente más bajas34. Un alto grado de muerte celular epitelial es de esperar durante la digestión; sin embargo, las células inmunitarias deben tolerar bien el proceso. Existen métodos alternativos para aislar células epiteliales viables para el crecimiento organoide35 o para preservar la arquitectura tisular36.
Las modificaciones al protocolo de estimulación se pueden hacer fácilmente, dependiendo de la lectura deseada y la célula inmune analizada (por ejemplo, macrófagos o células B). El uso de reactivos panestimuladores PMA/ionomicina no discrimina por la especificidad del antígeno TCR, por lo que es útil cuando no se conoce el antígeno. Sin embargo, la producción de IFN está estrechamente asociada con la contratación de TCR37 y tanto la producción de IFN como la TNF son críticas en las respuestas antitumorales del PDAC38. La estimulación de la PMA/ionomicina refleja la capacidad máxima de las células T para producir citoquinas, que podrían o no ser producidas por las células T dentro del microambiente tumoral. La producción endógena se puede medir sin necesidad de estimulación; sin embargo, los niveles pueden ser mucho más bajos o indetectables. Existen métodos alternativos para estimular las células T: cuentas recubiertas anti-CD3/28, que tampoco requieren antígeno o, de hecho, otras poblaciones de células inmunitarias. La ventaja de este método es permitir la cuantificación de la producción de citoquinas por subconjuntos específicos de células T sin necesidad de métodos de separación. También se pueden añadir otros marcadores de citotoxicidad (granzim, B y Perforin A), actividad (IL-2) o inmunosupresión (IL-10)21. Sin embargo, los anticuerpos de citometría de flujo de alta calidad no están disponibles para detectar todas las citoquinas y factores de interés. Por lo tanto, si hay otras aplicaciones como ELISA requerida la estimulación se puede realizar sin la inclusión de brefeldina A/monensina, permitiendo la liberación de citoquinas en el sobrenadante. Sin embargo, cabe destacar que esto permitirá la liberación total de citoquinas celulares y no será posible determinar qué poblaciones celulares contribuyeron.
La producción de IFN es una característica dominante de una respuesta antitumoral de células T, a menudo utilizada como sustituto del reconocimiento TCR-antígeno37,38. Otros métodos in vivo que definen con mayor precisión respuestas específicas del antígeno utilizan células tumorales que expresan un antígeno conocido, como Ovalbumin o SV40. El antígeno universal se puede utilizar ex vivo para probar el reconocimiento de células T o en combinación con un ratón host restringido por TCR. Alternativamente, cuando se desconoce el antígeno, la cuantificación de la expansión clonal de células T se puede realizar mediante la secuenciación tOCR a granel, o más recientemente la secuenciación tCR de una sola célula39,40. Para comprender plenamente el estado de la respuesta intratumoral de los linfocitos T, también se deben medir marcadores indicativos de agotamiento o receptores inhibitorios, entre los que se incluyen: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Así como marcadores de células T efectoras (CD44hi,CD62lo)y actividad proliferativa, Ki67+ o CSFE dilución41,42,43,44. En general, el modelo ortotópico proporciona una plataforma útil para probar rápidamente estrategias terapéuticas, en particular que pueden modular la respuesta antitumoral de células T, que luego se puede validar en una cohorte más pequeña de ratones transgénicos, KPC.

Este método detalla, de principio a fin, el procedimiento quirúrgico para generar tumores pancreáticos ortotópicos utilizando una cantidad mínima de material celular y la posterior disociación rápida de tumores establecidos para el análisis integral de la citometría de flujo de las poblaciones de células inmunitarias, incluyendo el análisis ex vivo de la función de células T.
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es un carcinoma agresivo con sólo el 8 % de los pacientes que sobreviven a 5 años1. Dado que menos del 20 % de los pacientes son elegibles para la resección quirúrgica2,las muestras de pacientes frescos no son fácilmente accesibles para la investigación y, por lo tanto, los modelos in vivo proporcionan herramientas esenciales para investigar esta enfermedad. Existen múltiples modelos murinos de PDAC: ortotópicos, subcutáneos, transgénicos, intravenosos y derivados del paciente (PDX), ampliamente descritos aquí3. El modelo ortotópico descrito aquí permite la inyección de células PDAC singénicas en el páncreas de ratones inmunocompetentes. Esto se puede realizar en grandes cohortes de ratones de tipo salvaje o mutante, y por lo tanto proporciona un modelo rentable y consistente para la comparación de agentes terapéuticos. Es importante destacar que el modelo ortotópico proporciona el microambiente cognado para el crecimiento de células tumorales y metástasis en nuestras manos y otros4 a sitios clínicamente relevantes (por ejemplo, hígado), haciéndolo más relevante clínicamente que los modelos subcutáneos o inducidos químicamente. Los tumores ortotópicos muestran características clave de PDAC, como una fuerte reacción desmoplástica con una abundancia de fibroblastos y la deposición de matriz extracelular5. Los modelos transgénicos de PDAC son el estándar de oro del modelo murino y el más utilizado es el modelo KPC, que expresa el mutante KrasG12D/+ y Trp53R172H/+ bajo el promotor Pdx-1-Cre 6 específico del páncreas. Los modelos adicionales de KPC y otros modelos de In vivo PDAC se revisan aquí7. Los ratones KPC desarrollan espontáneamente tumores pancreáticos con una progresión de la enfermedad que replica fielmente las características de PDAC6humano. Sin embargo, en cuanto a todos los modelos transgénicos, el programa de cría es costoso, la progresión tumoral es variable y, por lo tanto, a menudo requiere grandes cohortes de ratones. Los modelos PDX utilizan células tumorales derivadas del paciente o piezas que luego se cultivan ortopédicamente o más a menudo por vía subcutánea en ratones inmunocomprometidos. Los modelos Xenograft proporcionan herramientas útiles para el cribado de compuestos terapéuticos y tienen en cuenta la heterogeneidad del paciente. Sin embargo, no proporcionan un microambiente inmune completo, limitando así sus aplicaciones8,9.
Una vez establecidos, los tumores ortotópicos suelen tardar alrededor de 1 mes o más en crecer (dependiendo de la línea celular utilizada) y forman tumores grandes que pueden ser fácilmente imageados por ultrasonido o RMN para realizar un seguimiento de la progresión y determinar la eficacia del tratamiento4,5,10. Sin embargo, una vez en crecimiento exponencial, la última fase del crecimiento tumoral puede ser rápida, por lo que la mayoría de los regímenes de tratamiento se inician relativamente temprano (por ejemplo, 14 días)11,12. El sistema inmunitario desempeña un papel crítico en el desarrollo tumoral, incluso en el PDAC, que se caracteriza por un infiltrado tumoral inmunosupresor con escasez relativa de células T y presencia frecuente de células mieloides13. Una alta presencia de células T en PDAC confiere un mejor pronóstico14,15. Sin embargo, como agentes individuales, los inhibidores del punto de control inmune que alivian la inmunosupresión de células T, como anti-CTLA-416 y anti-PD-L117,no han mostrado beneficio clínico en pacientes con PDAC, probablemente porque la reactividad general de los tnéficos es muy baja. Sin embargo, los agentes que priman las respuestas de los células T, como el anti-CD40, pueden superar la resistencia anti-PD-L1/CTLA-418,19 y la vacunación con la vacuna primaria-CSF PDAC (GVAX) puede aumentar la inmunogenicidad de los tumores PDAC20,lo que indica que la mejora de las respuestas a los células T forma una importante vía terapéutica.
La respuesta antitumoral de los linfocitos T es el reconocimiento de antígenos derivados de tumores a través del receptor de células T (TCR) y la posterior producción de citoquinas y gránulos citotóxicos. Mientras que el reconocimiento del antígeno de células T se puede determinar mediante la secuenciación de TCR, este enfoque es costoso y consume mucho tiempo. Sin embargo, la cuantificación de los subconjuntos de células T infiltrantes de tumores proporciona una buena indicación de una respuesta antitumoral. Un examen más profundo de la actividad de los células T ex vivo en términos de degranulación, producción de citoquinas y otros factores citotóxicos proporciona un análisis funcional más profundo. Estos ensayos se pueden realizar en muestras de tumores frescos y muchos parámetros de la función de los células T se pueden medir rápidamente mediante citometría de flujo.
Los células CD8+ y CD4+ T producen citoquinas como IFN y TNF para potenciar una respuesta inmune21. IFN induce la regulación del MHCI sobre las células diana, induce la diferenciación y el reclutamiento de células inmunitarias y ayuda a la muerte celular. La producción de IFN por células CD8+ T está bien caracterizada por formar parte de una respuesta antitumoral y se correlaciona con la regresión tumoral22,23. El TNF es otra citoquina proinflamatoria producida por las células CD8+ y CD4+ T. Mejora la activación dependiente de TCR y la proliferación de células T, ayudando a la respuesta antitumoral. Tras el compromiso con TCR, los células cd8+ T citotóxicas pueden sufrir degranulación, donde los lisosomas secretores preformados que contienen moléculas citotóxicas se liberan en la sinapsis inmunológica para causar la degradación de las células diana21. Estas moléculas incluyen Perforin, una proteína que se une a la membrana celular diana, formando poros que luego alteran la integridad de la membrana y permiten la difusión21 o endocitosis24 de otras moléculas citotóxicas, como Granzyme B, directamente en el citoplasma de la célula diana. Granzyme B es una proteasa que promulga la degradación de múltiples proteínas dentro de la célula diana, lo que lleva a la muerte celular21. La liberación de tales moléculas requiere exócitosis de endosomas a la superficie celular, donde el marcador endosomal CD107a (también conocido como LAMP-1) se incorpora transitoriamente a la membrana celular25.
La medición de la secreción de citoquinas por células T requiere su aislamiento mediante la clasificación de células asistidas por flujo o ensayos de separación basados en cuentas, que no se pueden realizar fácilmente en un gran número de muestras simultáneamente. Sin embargo, la medición de citoquinas intracelulares no requiere ningún paso previo al aislamiento y se puede realizar fácilmente en varias muestras a la vez, lo que permite un enfoque de mayor rendimiento. Como las citoquinas son secretadas rápidamente por las células T, los niveles intracelulares pueden ser indetectables y por lo tanto la célula T requiere estimulación para aumentar la producción basal de citoquinas. Para evaluar la producción de citoquinas impulsada por antígenos, el antígeno reconocido por el TCR debe presentarse a la célula T mediante un APC in vitro cebado. En los casos en que no se conoce la especificidad del antígeno, se requiere un enfoque de estimulación amplio. La estimulación TCR se puede imitar utilizando perlas anti-CD3/28 que proporcionan activación de TCR y coestimulación, lo que induce la producción y proliferación de citoquinas. Sin embargo, una alternativa más rentable es el uso de PMA y ionomicina, que en conjunto activan ampliamente las vías de señalización que conducen a la síntesis y liberación de citoquinas intracelulares. Específicamente, pmA activa la proteína quinasa C (PKC) y la ionomicina aumenta los iones Ca2+ intracelulares, lo que conduce a una mayor señalización celular. Con el fin de preservar el contenido intracelular de citoquinas, esta estimulación se puede combinar eficazmente con inhibidores del transporte de proteínas brefeldina A y monensina, que bloquean las proteínas en el Golgi y así prevenir la liberación extracelular. El uso de PMA/ionomicina es un método bien establecido para estimular las células T y existe una fuerte correlación entre las citoquinas extracelulares e intracelulares26. La estimulación de las células T con PMA y ionomicina también aumenta el tráfico de lisosoma a la membrana celular y por lo tanto CD107a se integra transitoriamente en la superficie celular antes de ser reciclado en la célula. Al incluir un anticuerpo anti-CD107a durante la estimulación, es posible utilizarlo como un marcador de la actividad de desgranulación25.
Este método digiere rápidamente los tumores para proporcionar una suspensión de una sola célula. En este punto, las poblaciones individuales pueden ser teñidas directamente para la citometría de flujo o purificadas por métodos aguas abajo: clasificación de células asistidas por flujo o separación de perlas magnéticas. La preparación de una suspensión de una sola célula para el análisis de citometría de flujo permite el análisis de alto rendimiento de múltiples poblaciones de células inmunitarias y sus marcadores fenotípicos, proporcionando una cuantificación precisa del número de células inmunitarias y el fenotipo.
Por último, el protocolo de digestión descrito aquí previene la pérdida de marcadores de superficie celular y mantiene la viabilidad de las células inmunitarias, permitiendo que las células inmunitarias se sometan a más pasos de purificación celular y cultivo según sea necesario. Sin embargo, este método no ha sido probado para derivar células epiteliales de esta digestión.

<table><tbody><tr><td>Suturas reabsorbibles de vicryl recubiertas de calibre 6/0</td><td>Ethicon</td><td>W9500T</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; </td><td>Fisher Scientific</td><td>11597522</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Pinzas Clay Adams</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015A</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD107a PE (clon 1D4B)</td><td>Biolegend</td><td>121612</td><td>1:100 a los medios de cultivo</td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Uso en la dilución final 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD3 PerCP eFluor710 (clon 17A2)</td><td>Biolegend</td><td>46-0032</td><td>Uso en la dilución final 1:50</td></tr><tr><td>anti-CD4 FITC (clon GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td>Uso en la dilución final 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103140</td><td>Uso en la dilución final 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100738</td><td>Uso en la dilución final 1:100</td></tr><tr><td>anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clon XMG1.2)</td><td>Biolegend</td><td>505826</td><td>Uso en la dilución final 1:50</td></tr><tr><td>anti-TNF-alfa Alexa Fluor 647 (clon MP6-X)</td><td>Biolegend</td><td>506314</td><td>Uso en la dilución final 1:50</td></tr><tr><td>BD Matrigel Matriz de Membrana Basal Alta Concentración BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td>354248 Alícuota en hielo y almacenar en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de estimulación celular (500x) (forbol 12-miristato, 13-acetato (PMA) e ionomicina)</td><td>eBioscience</td><td>00-4970-03</td><td>1x Concentración final: PMA 0,081 &mu; M, ionomicina 1,34 &mu; M</td></tr><tr><td>Aplicador de Autoclip de Clay Adams</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Removedor de Autoclip de Clay Adams</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo V de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9263</td><td>2 mg/mL en medio</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glucosa alta (4,5 g/L) con L-glutamina</td><td>PAA</td><td>E15-810</td><td></td></tr><tr><td>DNasa (desoxirribonucleasa I del páncreas bovino tipo II-S) stock 10 mg/mL en 0,15 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td>Concentración final en medios de digestión 0,025 mg/mL</td></tr><tr><td>Colorante de viabilidad fijable 506 (FVD506)</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td><td>Uso a 1:200 en PBS</td></tr><tr><td>Suero fetal de ternero (FCS)</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-104</td><td>10% en RPMI</td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton serie 700, 25 &mu; Volumen L, calibre 22s Punta biselada de la aguja</td><td>Fisher Scientific</td><td>10100332</td><td></td></tr><tr><td>tampón de fijación intracelular y tampón de permeabilización intracelular</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td>Tampón de permeabilización diluido a 1x en H2O</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>PAA</td><td>15140122</td><td>100 unidades/mL Penicilina, 100 &mu; g/mL Estreptomicina</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores del transporte de proteínas (500x) (brefeldina A y monesina)</td><td>eBioscience</td><td>00-4980-03</td><td>1x Concentración final Brefeldina A 10.6 &mu; M, monensina 2 y mu; M</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (contiene 0,3 g/L de glutamina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí quirúrgico n.º 10</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>594-18C</td><td>Tripsina (0,1%) EDTA (0,4%) concentración final</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos con fondo en U</td><td>VWR</td><td>734-2080</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores universales con punta de algodón - 6 pulgada x 100</td><td>Medisave</td><td>UN982</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos con fondo en V</td><td>VWR</td><td>735-0184</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células t infiltrantes en tumores

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Los modelos in vivo del cáncer de páncreas proporcionan herramientas invaluables para estudiar la dinámica de enfermedades, la infiltración inmune y nuevas estrategias terapéuticas. El modelo de murina ortotópica se puede realizar en grandes cohortes de ratones inmunocompetentes simultáneamente, es relativamente barato y preserva el microambiente del tejido cognado. La cuantificación de la infiltración de células T y la actividad citotóxica dentro de los tumores ortotópicos proporciona un indicador útil de una respuesta antitumoral.
Este protocolo describe la metodología para la generación quirúrgica de tumores pancreáticos ortotópicos mediante inyección de un bajo número de células tumorales sinémicas resuspendidas en una membrana de sótano de 5 l directamente en el páncreas. Los ratones que llevan tumores ortotópicos tardan aproximadamente 30 días en alcanzar la variable, momento en el que los tumores se pueden cosechar y procesar para caracterizar la actividad de células T infiltrantes en el tumor. La digestión enzimática rápida mediante colagenasa y DNase permite extraer una suspensión de una sola célula de los tumores. Se conservan los marcadores de viabilidad y superficie celular de las células inmunitarias extraídas del tumor; por lo tanto, es apropiado para múltiples aplicaciones aguas abajo, incluyendo la clasificación celular asistida por flujo de células inmunitarias para el cultivo o la extracción de ARN, el análisis de citometría de flujo de las poblaciones de células inmunitarias. Aquí, describimos la estimulación ex vivo de las poblaciones de células T para la cuantificación de citoquinas intracelulares (IFN y TNF) y la actividad de degranulación (CD107a) como una medida de la citotoxicidad general. Los digeridos de tumor entero fueron estimulados con acetato de miristate de phorbol y yonomicina durante 5 h, en presencia de anticuerpos anti-CD107a con el fin de regular la producción de citoquinas y la desgranulación. La adición de brefeldina A y monensina para las 4 h finales se realizó para bloquear el transporte extracelular y maximizar la detección de citoquinas. Luego se realizó la tinción extra e intracelular de células para el análisis de citometría de flujo, donde se cuantificó la proporción de células IFN+, TNF+ y CD107a+ CD4+ y CD8+ T.
Este método proporciona una base de partida para realizar un análisis exhaustivo del microambiente tumoral.

Después de inyectar 1000 células TB32048 en el páncreas, los tumores ortotópicos tardan aproximadamente 30 días en desarrollarse(Figura 1A,B). La fuga de membrana del sótano durante la cirugía puede hacer que se formen tumores grandes directamente en la pared peritoneal, que son prominentemente visibles a través de la piel(Figura 1C). Eliminaríamos estos ratones del estudio. Sin embargo, con buenas habilidades quirúrgicas se minimiza la incidencia de fugas. Los tumores ortotópicos cosechados en la variable pueden crecer a un tamaño sustancial en ratones de tipo salvaje C57BL/6 (Figura 1D). Los tumores ortotópicos cosechados requieren digestión en colagenasa/DNase durante 20 min para lograr una suspensión de una sola célula(Figura 2). En este punto, las células derivadas del tumor se pueden placar en una placa con fondo en U a 2 x 106 células/bien. El número de células chapadas puede alterarse dependiendo de la prevalencia de células T dentro de la muestra; el número de celda se puede reducir si las células T están en una alta densidad. Las muestras de bazo de control o de ganglios linfáticos también se pueden placar en este punto para la estimulación. Cada pozo se estimula con PMA y ionomicina durante 5 h y después de 1 h de incubación, se añaden brefeldina A y monensina con el fin de bloquear la liberación extracelular de citoquinas(Figura 2). Después de la incubación, las muestras se tiñen para los epítopos extracelulares y las citoquinas intracelulares para su análisis por citometría de flujo(Figura 2).
Se analizaron muestras de bazo y tumores de ratones portadores de tumores ortotópicos mediante citometría de flujo. La estrategia de gating utilizada en el análisis de citometría de flujo para los tumores del bazo y ortotópicos excluye los desechos que utilizan FSC-A, SSC-A, dobletes por FSC-A/FSC-H y SSC-A/SSC-W, luego células muertas o apoptóticas como positivas para el tinte de viabilidad fijable(Figura 3A). Las celdas inmunes se anegan como CD45+, y las células T se asantan aún más como CD3+ de las cuales se definen CD4+ y CD8+ subconjuntos(Figura 3A). Se realiza una fluorescencia menos uno (FMO) para determinar la fluorescencia de fondo para el gating y se realiza un control de brefeldina Sólo A/monensina para determinar la producción basal de citoquinas(Figura 3B-D).
En el caso de ifn, la incubación con brefeldina A/ monensina no dio lugar a un aumento de IFN sobre el control de la FMO tanto en muestras de bazo como de tumor. Sin embargo, la adición de PMA e ionomicina aumentó el porcentaje de IFN intracelular detectable en células CD4+ y CD8+ T esplénicas y derivadas de tumores.
Los células esplénicas CD4+ y CD8+ T, utilizadas como control positivo, tienen una producción de IFN relativamente mayor que los subconjuntos de células T que infiltran tumores, con una media de 6,60 a 1,5 % y 12,97 a 3,4 % en comparación con 4,81 a 1,0 % y 4,13 a 1,3 %, lo que indica que la inmunosupresión se produce dentro del tumor(Figura 3B y 4A). Usando la misma estrategia para El TNF, visualizamos que un alto porcentaje de células esplénicas CD4+ T son positivas para el TNF intracelular (65,93 a 2,3%), en comparación con las células CD4+ T que infiltran tumores (22,45 x 5,4%). Los células ESplénicas y tumorales CD8+ T producen niveles similares de TNF (25,15 a 3,7 % y 19,91 a 5,1 %, respectivamente)(Figura 3C, Figura 4B).
Finalmente, CD107a es un marcador endosomal que se expresa transitoriamente en la superficie celular durante la exocitosis de gránulos citotóxicos y citoquinas, como tal, se utiliza como un marcador suplente para la citotoxicidad. El beneficio de la tinción de CD107a durante la estimulación es que todo el CD107a expresado en superficie celular transitoria será capturado por el anticuerpo fluorescente. Los niveles basales de CD107a se muestran en células tratadas con brefeldina A/monensina solamente. Para los células CD8+ T esplénicas, la estimulación con PMA/ionomicina aumenta el nivel de CD107a detectado, con la regulación más fuerte en CD8+ células que fueron 23,95 a 3,5% CD107a+, en comparación con 5,8 a 1,9 % en CD8+ células que infiltran tumores, lo que indica que el CD8+ esplénico tenía una mayor tasa de degranación. Por otro lado, CD4 esplénico e infiltrante tumoral+ expresaron niveles comparables de CD107a 9,37 a 1,5 % y 11,50 a 1,8 %(figura 3D y 4C).
En general, estos resultados resaltan que los tumores ortotópicos se pueden generar a partir de la inyección de un número muy bajo (1.000) de células tumorales en el páncreas. Estos tumores se pueden digerir rápidamente para el aislamiento de las células T para la estimulación ex vivo. La detección de citoquinas intracelulares es posible y pone de relieve el nivel basal de inmunosupresión de los linfocitos T infiltrados, en comparación con las células T en los órganos linfoides secundarios.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig01.jpg"> Figura 1: Generación de tumores pancreáticos ortotópicos. (A) Lista de experimentos in vivo. (B) La apariencia macroscópica de los tumores ortotópicos dentro de la cavidad abdominal (izquierda) y después de la escisión (derecha) donde el tumor mostrado se ha cortado por la mitad. (C) La evidencia de fuga de membrana del sótano durante la cirugía puede hacer que se desarrollen tumores que son visibles a través de la piel (foto superior) y se forman en la pared peritoneal (foto inferior). (D) Pesos tumorales pancreáticos ortotópicos cosechados de ratones que habían alcanzado la variable (n-22). Cada punto de datos representa un ratón individual, el gráfico de barras muestra la media de SEM. Los datos de esta figura se han modificado a partir de la obra publicada anteriormente10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig02.jpg"> Figura 2: Esquema del procesamiento de tumores ortotópicos para la estimulación de células T ex vivo. Después de la cosecha, los tumores pancreáticos se digieren rápidamente en colagenasa (2 mg/ml) y DNase (0,025 mg/ml) durante 20 min a 37 oC. Después de esto, las celdas se resuspenden a 2 x 106/mL en medios RPMI completos y se chapan en una placa con fondo en U. Se añade un cóctel de estimulación de PMA e ionomicina durante 5 h, momento en el que también se puede añadir al cultivo el anticuerpo antiratón CD107a. Después de 1 h de incubación se añaden los bloqueadores de transporte intracelular, brefeldina A y monensina. Después de la estimulación ex vivo, las células se transfieren a una placa con fondo en V para la tinción con el tinte de viabilidad fijable (en PBS) durante 20 min 4 oC. Las células se lavan en tampón FACS y se incuban en anti-CD16/32 (bloque FcR) durante 15 minutos (en tampón FACS) y luego se incuban con anticuerpos fluorescentes conjugados extracelulares durante otros 30 minutos (en búfer FACS). Las células se lavan de nuevo en el búfer FACS y se resuspenden en el búfer de fijación intracelular durante 20 min. Después de esto, las células se lavan una vez en el búfer FACS y una vez en 1x búfer de permeabilización. Las células se resuspenden durante 1 h a RT en anticuerpos fluorescentes conjugados intracelulares durante 1 h (en 1 x tampón de permeabilización). Las celdas se lavan una vez en 1x búfer de permeabilización y una vez en el búfer FACS antes de volver a serinminente en el búfer FACS para la adquisición en el citómetro de flujo dentro de 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig3.jpg"> Figura 3: Análisis de citometría de flujo de células T estimuladas ex vivo y células T derivadas de tumores. (A) Estrategia de gating de citometría de flujo utilizada para muestras de bazo (control positivo) y tumores ortotópicos. Las células son discriminadas de escombros usando FSC-A/SSC-A y las células individuales se aíslan aún más usando FSC-A/FSC-H y SSC-A/SSC-W. Las células muertas o apoptoticas se excluyen utilizando el tinte de viabilidad fijable -FVD506 y las células inmunitarias están activadas por CD45+. Siguiendo este CD3+ T se definen las celdas CD4+ y CD8+. Los datos fueron adquiridos en un BD Fortessa. (B) La estrategia de gating utilizada para cuantificar las células IFN+ CD4+ y CD8+ T. Se utiliza un control fluorescente menos uno (FMO) en muestras totalmente estimuladas (PMA/ionomicina/brefeldina A/monensina) para determinar la fluorescencia de fondo. Un control de brefeldina Sólo A/monensina (sólo B+M) se utiliza para determinar la producción basal de citoquinas. La muestra totalmente estimulada se utiliza para calcular el % de células IFN+ T. (C) La estrategia de gating utilizada para cuantificar las células TNF+ CD4+ y CD8+ T. Se utiliza un control FMO en muestras totalmente estimuladas (PMA/ionomicina/brefeldina A/monensina) para determinar la fluorescencia de fondo. Un control de brefeldina Sólo A/monensina (sólo B+M) se utiliza para determinar la producción basal de citoquinas. La muestra totalmente estimulada se utiliza para calcular el % de células TNF+ T. (D) La estrategia de gating utilizada para definir las células CD107a+ CD4+ y CD8+ T. Se utiliza un control FMO en muestras totalmente estimuladas (PMA/ionomicina/brefeldina A/monensina) para determinar la fluorescencia de fondo. Un control de brefeldina Sólo A/monensina (sólo B+M) se utiliza para determinar la degranulación basal. La muestra totalmente estimulada se utiliza para calcular el % DE células CD107a+ T. Todos los datos de citometría de flujo se analizaron en FlowJo Versión 10.6.1. Los datos de esta figura se han modificado a partir de la obra publicada anteriormente10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig04.jpg"> Figura 4: Cuantificación de la actividad de células T ex vivo bazo y tumores. La proporción de células CD4+ y CD8+ T positivas para (A) IFN+ (B) TNF+ y (C) CD107a+ se cuantificó en el bazo (n-4) y el tumor (n-7) de los ratones portadores de ortotópicos-tumores. Cada punto de datos representa una media de visualización individual del ratón y de las barras de error : SEM. La significancia estadística se ha probado mediante una prueba t no emparejada en la que * . Todos los datos fueron analizados usando Prism 8. Los datos de esta figura se han modificado a partir de la obra publicada anteriormente10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe la generación quirúrgica de tumores pancreáticos ortotópicos y la rápida digestión de tumores pancreáticos murinos recién aislados. Después de la digestión, las poblaciones viables de células inmunitarias se pueden utilizar para análisis posteriores, incluida la estimulación ex vivo de las células T para la detección de citoquinas intracelulares por citometría de flujo.

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Este método se puede utilizar para asses cómo nuevos agentes terapéuticos o estrategias, influir o aumentar la respuesta de los linfocitos T citotóxicos durante el cáncer de páncreas. Esta técnica permite que los tumores se digieren y estimulen rápidamente in vitro, permitiendo el análisis de múltiples parámetros de la respuesta de la célula T simultáneamente, que se pueden adaptar fácilmente para otras aplicaciones. Para empezar, usa fórceps, transfiere el tumor a una placa de petri.Almacene cinco mililitros de medio de digestión en un tubo de 50 mililitros sobre hielo para evitar que la actividad enzimática se amencie. Tome una pequeña alícuota de esta solución, para cubrir el tumor en el plato petri. Usa un bisturí estéril y fórceps para cortar el tumor en trozos pequeños, de aproximadamente menos de tres milímetros de longitud.Raspa las piezas del tumor en el tubo e invierte suavemente el tubo hasta que todas las piezas estén sumergidas en los medios de digestión. Transfiera el tubo a un dispositivo de agitación durante 20 minutos a 37 grados centígrados para digerir. Asegúrese de que todos los trozos de tumor estén sumergidos y no pegados al borde del tubo.Inmediatamente después del paso de digestión, coloque el tubo sobre hielo para ralentizar la actividad enzimática. Añadir EDTA para lograr una concentración final de 20 milimolar, y vórtice brevemente la muestra a mezclar con el fin de ralentizar aún más la actividad enzimática. Abra el tubo y enjuague cualquier tumor digiere la tapa del tubo con un medio RPMI fresco.A continuación, prepare un colador de 70 micras, colóquelo en un tubo abierto de 50 mililitros sobre hielo. Pre-humedece el filtro con medio. Resuspender las células digeridas y lavar los lados del tubo usando un Stripette de 25 mililitros o más grande.La apertura más ancha de la Stripette permite que el digerido grueso pase fácilmente. Transfiera todo el digerido al colador, usando el Stripette de 25 mililitros. Machacar hacia arriba y hacia abajo el tumor en la parte superior del filtro usando un émbolo de jeringa de un mililitro.Lave continuamente las células a través del colador con RPMI. Asegúrese de lavar con suficiente fuerza para empujar las células a través. Continúe lavando hasta que todas las células hayan pasado a través del colador.Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 300 veces G, y cuatro grados Celsius. Resuspender cuidadosamente el pellet celular, y completar la RPMI, y pasar directamente a través de otro filtro para eliminar cualquier matriz extracelular, o grumos de células grandes que no se pueden resuspender adecuadamente. Si no se requiere estimulación, manche inmediatamente las células aisladas para el análisis de citometría de flujo, o resuspenderlas en medio de congelación de 10%DMSO y FBS, y almacenar en menos 80 grados Celsius.Para realizar la estimulación, primero cuente las células. Diluir las células en medio completo para lograr una concentración de dos veces diez a seis por cada 100 microlitros. Placa 100 microlitros de células en cada pozo de una placa de 96 pozos con fondo en U.Añadir 100 microlitros de medio completo, que contienen una preparación 2X de PMA, e Ionomicina. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados, pero 5% de dióxido de carbono durante una hora. Luego, a 20 microlitros de una preparación 10X de Brefeldin A, y Monensin, y medios completos para lograr una concentración final de 1,06 micromolares, y 2,0 micromolares, respectivamente.Vuelva a colocar el plato en la incubadora durante otras cuatro horas. Después de inyectar 1000 TB32048 células en el páncreas, los tumores ortotópicos tardan aproximadamente 30 días en desarrollarse. Después de la digestión y estimulación de los tumores ortotópicos cosechados, se realizó una fluorescencia menos una para determinar la fluorescencia de fondo para el gating.Y Brefeldin A Monensin sólo se realizó el control para determinar la producción basal de citoquinas. Para la incubación de interferón-gamma con Brefeldin A y Monensin, no se produce ningún aumento en la gamma de interferón sobre el control de la MOF, tanto en muestras de bazo como de tumores. Sin embargo, la adición de PMA e ionomicina, aumentó el porcentaje de gamma de interferón intracelular detectable en células T positivas CD4 y CD8 derivadas de tumores y esplénicas.Los células T positivas CD4 esplénicas y CD8 positivas, utilizadas como control positivo, tienen una producción gamma de interferón relativamente mayor, que los subconjuntos de células T que se infiltran en tumores. Indicando que la inmunosupresión ocurre dentro del tumor. Utilizando la misma estrategia para TNF alfa, un alto porcentaje de células T positivas CD4 esplénicas fueron positivas para el alfa TNF intracelular.En comparación con las células T positivas CD4 infiltrantes de tumores. Células T POSITIVAs CD8 esplénicas e infiltrantes de tumores, produjeron niveles similares de TNF alfa. Asegúrese de que el tumor esté suficientemente picado y de que todas las piezas estén sumergidas en medios de digestión.Al machacar el tumor, asegúrese de ser suave y lavar las células a fondo. El protocolo de digestión tumoral se puede combinar con la clasificación celular asistida por flujo, para purificar subconjuntos de células inmunitarias individuales para análisis adicionales, funcionales o de expresión génica. Hemos utilizado este método para caracterizar cómo las células B dan forma a la respuesta inmune durante el cáncer de páncreas, generando tumores ortotópicos en ratones con nocaut de células B y B agotadas.

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Investigación

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Investigación del cáncer

Este artículo describe la técnica de estimulación ex vivo de células T para aumentar la concentración intracelular de citocinas como interferón-gamma o IFN-gamma y factor de necrosis tumoral alfa o TNF-alfa en la célula T. Estas citocinas median una respuesta antitumoral eficaz y pueden tener un papel terapéutico en el tumor.

Estimulación ex vivo de células T en el tumor de páncreas: un método para aumentar la producción de citocinas en las células T

El video explica un método quirúrgico escalonado para la implantación ortotópica de un fragmento de tumor de un donante canceroso al páncreas de un ratón receptor no canceroso para el desarrollo de cáncer de páncreas. El PDAC implantado ortotópicamente podría recapturar el microambiente tisular de los cánceres de páncreas humanos con mayor precisión que los modelos subcutáneos (SC) convencionales.

Trasplante de tumor ortotópico con homoinjerto: una técnica para generar modelos de ratón de tumores pancreáticos

Una mejor comprensión de la biología del cáncer de páncreas es una necesidad vital para permitir el desarrollo de mejores opciones terapéuticas para el tratamiento de cáncer de páncreas. Para hacer frente a esta necesidad, se demuestra un modelo ortotópico de cáncer de páncreas que permite la monitorización no invasiva de la progresión del cáncer...

Modelo ortotópico bioluminiscente de la progresión del cáncer de páncreas

El procedimiento experimental en el immunophenotyping de homoinjertos PDAC Murino ortotópico pretende perfilar el inmuno-microambiente tumoral. Los tumores son orthotopically implantado mediante cirugía. Tumores de 200 – 600 mm3 en tamaño fueron cosechados y disociados para preparar suspensiones de unicelular, seguidos del análisis de marcador múltiple inmunológico FACS utilizando diferentes anticuerpos marcados con fluorescencia.

Immunophenotyping de Orthotopic la homoplastia (Syngeneic) de Adenocarcinoma Ductal pancreática KPC primaria murinas por citometría de flujo

Este artículo describe un método novedoso para generar antígenos tumorales inducidos por células madre pluripotentes inducidas por antígenos timáticos (iTE) por un sistema de cultivo timico tridimensional (3D). iTE son un subconjunto homogéneo de células T estrechamente relacionadas con células T ingenuas con la capacidad de proliferación, formación de la memoria y supresión tumoral.

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

En el contexto clínico, los pacientes con cáncer de páncreas localizado se someterán a pancreatectomía seguida de tratamiento adyuvante. Este protocolo divulgado aquí apunta establecer un método seguro y de manera efectiva de modelar este escenario clínico en ratones desnudos, con la implantación orthotopic del cáncer pancreático seguido por pancreatectomy y splenectomy distales.

Un modelo ortotópico de ratón reseccional de cáncer de páncreas

Aquí, presentamos un protocolo de trasplante tumoral para la caracterización de linfocitos infiltrados tumorales inherentes y derivados de la periferia en un modelo de tumor de ratón. El rastreo específico de la afluencia de células inmunes derivadas del receptor con citometría de flujo revela la dinámica de los cambios fenotípicos y funcionales de estas células durante las respuestas inmunes antitumorales.

Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones

Este protocolo describe la preparación de cultivos organotípicos de cortes (OTSC). Esta técnica facilita el cultivo ex vivo de tejido multicelular intacto. Las OTSC se pueden utilizar inmediatamente para probar su respectiva respuesta a los fármacos en un entorno multicelular.

Cultivos de cortes organotípicos como modelos preclínicos del microambiente tumoral en cáncer de páncreas primario y metástasis

Presentamos un protocolo para generar un modelo de cáncer de páncreas ortotópico mínimamente invasivo mediante inyección guiada por ultrasonido de células de cáncer de páncreas humano y el posterior monitoreo del crecimiento tumoral in vivo por imagen ecográfica.

Generación de un xenoinjerto ortotópico de células de cáncer de páncreas mediante inyección guiada por ultrasonido

Los aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) recapitulan la biología, los fenotipos y las respuestas terapéuticas de los subtipos de enfermedades. Debido a su progresión tumoral rápida y reproducible, son ampliamente utilizados en estudios preclínicos. Aquí, mostramos prácticas comunes para generar estos modelos, inyectando cultivos singénicos murinos de PDAC en el páncreas.

Aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón para modelar el cáncer de páncreas

Describimos un método para utilizar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones a través de citometría de flujo para la transferencia de células adoptivas. Este protocolo tiene como objetivo verificar la citotoxicidad específica de los TIL contra tumores en un modelo de ratón de cáncer de páncreas singénico, proporcionando información sobre el desarrollo de terapias celulares adoptivas para el cáncer de páncreas.

Aislamiento basado en citometría de flujo y evaluación terapéutica de linfocitos infiltrantes tumorales en un modelo murino de cáncer de páncreas

Aprende a generar tumores pancreáticos ortotópicos en modelos murinos y caracterizar la citotoxicidad de células T infiltrantes mediante digestión enzimática rápida y citometría de flujo. Este protocolo permite evaluar respuestas inmunes en el microambiente tumoral.

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores (Video) | JoVE Journal

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

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