Uso del inmunoensayo de electroforesis capilar para buscar biomarcadores potenciales de la esclerosis lateral amiotrófica en plaquetas humanas

Este protocolo se puede utilizar para optimizar las concentraciones de proteínas y anticuerpos primarios en una sola placa de ensayo, y para realizar dos ensayos utilizando una sola preparación de muestra. La principal ventaja de esta técnica es que permite completar 2 días y medio de trabajo de laboratorio, incluido el análisis de datos, en 3 horas y media. Esta técnica proporciona un formato de ensayo de alto rendimiento para desarrollar un biomarcador a base de sangre para la ELA y es un método ideal para realizar grandes ensayos clínicos.

Este método puede proporcionar información sobre los perfiles de proteínas diana durante el pronóstico de la enfermedad y puede facilitar el seguimiento de los efectos de los fármacos de ensayos clínicos interesantes. Después de recoger 100 microlitros de lisatos de plaquetas humanas de pacientes con ELA y sujetos sanos, rellene las plantillas generadas internamente para el diseño capilar y la preparación de la muestra. La tabla de preparación de la mezcla de muestras es dinámica y calculará automáticamente cuánto volumen se debe eliminar de la fuente.

Coloque todos los reactivos de ensayo sobre hielo. Excepto el paquete estándar, que debe permanecer a temperatura ambiente. Para preparar la mezcla maestra fluorescente, agregue 40 microlitros de agua desionizada a un tubo transparente de TDT, y agregue 20 microlitros de tampón de muestra 10X.

Y 20 microlitros de la solución de TDT de 400 miliamlares preparada al tubo rosa del kit de ensayo. Para preparar la escalera biotinilada, añadir 16 microlitros de agua desionizada, dos microlitros de tampón de muestra 10X y dos microlitros de la solución de TDT de 400 mililitros preparada al tubo blanco suministrado en el kit. Después de una mezcla suave, transfiera la solución de escalera a un tubo PCR de 200 microlitrotros antes de desnaturalcar.

Agregue 1,5 microlitros de tampón de muestra 10X y 148,5 microlitros de agua desionizada a un tubo de microcentrífuga de 600 microlitros y vórtice para mezclar, antes de colocar el tubo sobre hielo. Añadir los anticuerpos de interés directamente el diluyente como se indica en la tabla y lavar la punta de la pipeta varias veces en una solución de anticuerpos homogéneos. Para preparar la mezcla de muestra capilar, abra todos los tubos PCR y añada 1,6 microlitros alícuotas de tampón de muestra fluorescente 5X a cada tubo como se indica en la tabla utilizando una técnica de pipeteo inverso.

Cierre inmediatamente cada tubo a medida que se añade el búfer. Cuando se haya agregado todo el búfer, abra todos los tubos y agregue un búfer de muestra 0.1X en volúmenes como se indica en la tabla, cerrando inmediatamente cada tubo a medida que se agrega el búfer. A continuación, abra todos los tubos y agregue las muestras de proteínas como se indica en la tabla y cierre inmediatamente cada tapa del tubo.

Una vez añadidas todas las muestras, centrifugar brevemente todos los tubos en una centrífuga de sobremesa. Vórtice para mezclar y centrifugar las muestras de nuevo. Al final de la segunda centrifugación, coloque todos los tubos en un termociclador con una tapa calentada.

Y desnaturalizar las muestras en las condiciones indicadas. Al final de la desnaturalización, centrifugar, mezclar y centrifugar las muestras de nuevo y colocar todos los tubos en un estante de tubo sobre hielo. Usando la figura como guía, agregue 10 microlitros de estreptavidina de rábano picante peroxidasa al pozo D1, 10 microlitros del anticuerpo secundario apropiado a los pozos D2 a D5, 10 microlitros de anticuerpos diluyentes a cada pozo en la fila B y a C1, 10 microlitros del anticuerpo primario apropiado a los pozos C2 a C25, cinco microlitros de escalera biotinilada del tubo PCR número uno al pozo A1 , tres microlitros de muestra a las filas A2 a A25 y 15 microlitros de peróxido de luminol recién preparados a cada pocódico de la hilera E.Pipetting la mezcla de la muestra y el reactivo en el pozo diminuto en los pedidos correctos es crítico para el éxito del experimento, por lo que debe hacerse con mucho cuidado.

A continuación, agregue 500 microlitros de tampón de lavado a cada pozo de tampón de lavado designado. Y gira el contenido de la placa por centrifugación. Para realizar el análisis capilar en la placa de ensayo, conecte el analizador capilar al sistema en línea y haga clic en Instrumento y conexión en el software del analizador.

Seleccione el número de serie del instrumento en el menú emergente y haga clic en Conectar. Seleccione la pestaña Ensayo y seleccione Nuevo ensayo, introduzca los parámetros del ensayo y guarde el nombre y la ubicación del archivo. A continuación, confirme que el indicador azul parpadeante en el analizador es de color azul sólido y retire el cartucho capilar de su embalaje.

Retire el sello protector de la placa de ensayo y observe visualmente los pozos precargados en busca de burbujas de aire. Coloque la placa de ensayo en el soporte de la placa y sujetando el cartucho capilar en un ángulo, inserte el cartucho en la ranura capilar y cierre la puerta del analizador. A continuación, haga clic en Inicio en el software del analizador.

El uso de una mezcla de izado plaquetario entero en el ensayo puede reducir la intensidad de la señal de las proteínas diana y contribuir a una señal de fondo alta. Por lo tanto, en este ensayo, se utilizó un sobrenadante transparente después de romper las plaquetas. Se estableció un rango dinámico lineal para la concentración de proteína citosquina plaquetaria de 0,2 a 0,8 miligramos por mililitro, y se adoptó una plantilla de ensayo para que tanto la concentración de proteínas como la valoración de anticuerpos primarios pudieran realizarse en un solo ensayo.

El perfil de detección de alto rango dinámico ofrece un rango dinámico significativamente más amplio debido a la mayor sensibilidad del ensayo capilar, lo que resulta en una mejor detección y cuantificación en un rango de concentración de muestras más grande. También se pueden definir tiempos de exposición individuales. Utilizando las condiciones optimizadas del ensayo, este análisis de fracciones citosólicas de litosato plaquetario obtenidas de pacientes con ELA utilizando dos conjuntos de anticuerpos permiten la identificación de TDP-43 específico de la enfermedad y su derivado fosforilado dentro de las muestras.

El TDP-43 total podría cuantificarse utilizando la curva de calibración. Y las variables de ensayo intra e inter-run se probaron en fracciones citosólicas plaquetarias humanas agrupadas. Este método permite el uso de anticuerpos primarios, facilitando la identificación de hasta cinco proteínas diana diferentes dentro de la misma muestra en una sola ejecución de ensayo.

Esta técnica no sólo reduce sustancialmente el tiempo de análisis de proteínas, sino que requiere volúmenes de muestras de microlitros y genera resultados con un alto grado de reproducibilidad. Algunos de los productos químicos utilizados en este ensayo y todas las muestras humanas se consideran biopeligrosos, por lo que siempre se debe utilizar un equipo de protección personal adecuado al realizar estos experimentos.