Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente
July 25th, 2020
Aquí presentamos un protocolo para probar la eficacia de las terapias dirigidas seleccionadas en base a la composición genómica de un tumor. El protocolo describe la identificación y validación de reordenamientos estructurales del ADN, injerto de tumores de los pacientes en ratones y pruebas de respuestas a los fármacos correspondientes.
El protocolo descrito aquí tiene como objetivo demostrar un algoritmo para probar la eficacia del tratamiento utilizando modelos de cáncer in vivo. El protocolo consiste en una combinación de varias técnicas. La biosecuenciación del genoma completo de muestras de tumores humanos se utiliza para identificar alteraciones genómicas.
Estos incluyen tanto reordenamientos genéticos como cambios en el número de copia genética. Por lo tanto, el análisis de las alteraciones identificadas se realiza con el fin de seleccionar cambios potencialmente farmacológicas. Los fármacos seleccionados en base al análisis genómico se utilizan para el tratamiento in vivo de los tumores correspondientes cultivados en ratones inmunocomprometidos.
El algoritmo desarrollado representa un enfoque prometedor para ayudar a las decisiones de tratamiento para la atención de los pacientes con cáncer. Utilice la herramienta Panda o un software análogo para identificar alteraciones específicas. Podemos enumerar los genes que fueron identificados por la microsecuenciación resultaron como un simple archivo delineado de pestaña utilizando símbolos genéticos aceptados estándar.
Agregue el signo de libra a la línea de encabezado de la lista para asegurarse de que el encabezado de la tabla se transfiere al nivel de ruta U del software. Cargue el archivo haciendo clic en la pestaña de navegación correspondiente. Asigne un solo icono para representar los datos subyacentes haciendo clic en el icono de su elección y, a continuación, haciendo clic en la pestaña Finalizar.
Una vez que se cargan los archivos de un paciente, obtenga una vista previa de la página para identificar una columna que muestra el número de genes anotados por ruta. Esta es la última columna a la derecha. Utilice un filtro de vía en la parte superior izquierda de la ventana principal para restringir el número de vías mostradas a las que contienen los genes de interés.
Para identificar vías que tienen más genes anotados de lo que se esperaría por casualidad, utilice una función ubicada debajo de la pestaña de enriquecimiento. A continuación, se agrega una columna a la tabla principal que muestra el valor p correspondiente de la prueba exacta de Fisher. Seleccione la base de datos para mostrar posibles genes farmacológicas a partir de anotaciones predefinidas comprobando un icono apropiado a la izquierda de la ventana principal.
Para seleccionar una ruta para la visualización, haga clic en su nombre que se muestra en la página del visor de rutas. Los iconos que representan cada conjunto de anotaciones se muestran junto al gen asociado. Al hacer clic en cualquier gen de la vía se abrirá la página correspondiente de tarjetas genéticas.
Seleccione las vías que mostraron genes anotados de interés y golpes para fármacos potenciales para su posterior análisis. Realizar el trabajo de tejido en una campana de flujo laminar para mantener condiciones estériles. Poner el tejido tumoral en un plato que contenga PBS frío o medios de cultivo de tejidos, como RPMI, DMEM, que contienen antibióticos.
Identificar y aislar material tumoral viable del tejido normal y necrótico adyacente con la ayuda de un patólogo. Utilice fórceps estériles y bisturí para eliminar el material necrótico señalado por un patólogo. Para realizar el injerto subcutáneo, corte el tejido tumoral con fórceps estériles, bisturí o tijeras quirúrgicas en pequeños fragmentos, aproximadamente 2 x 2 x 2 milímetros de tamaño.
Transfiera el tejido fragmentado a una placa de petri pre-refrigerada sobre hielo. Dejar en frío el matrielón en el plato con el tejido fragmentado, aproximadamente 200 microlitros por cada 10 trozos de tejido. Mezclar bien y dejar que los fragmentos de tejido se empapen en el matrigel durante 10 minutos.
Utilice tijeras quirúrgicas estériles y fórceps para hacer una incisión de piel vertical de 5-10 milímetros en ambos flancos de un ratón. Inserte los fórceps rectos suavemente en el espacio subcutáneo para crear un bolsillo lo suficientemente grande como para que un fragmento de tumor se coloque debajo de la almohadilla de grasa. Utilice fórceps rectos estériles para insertar fragmentos de tumores en el bolsillo previamente preparado en cada uno de los cinco ratones.
Cierre la incisión de la piel usando pegamento tisú. Después de la implantación, para inhibir la proliferación de linfocitos, inyectar cada ratón con 100 microlitros de rituximab. Prepare el ratón para el gavage oral pellizcando la piel de la espalda y doblándola hacia atrás para que la cabeza y los labios del ratón estén inmovilizados.
Inserte la sonda gavage por la parte posterior de la garganta del ratón hasta que la sonda llegue al esófago. Asegúrese de que la sonda no se inserte demasiado lejos, ya que los pulmones del ratón pueden perforar causando la muerte. La carroza representativa del genoma ilustra el paisaje de los cambios genómicos en un tumor.
Típico de los tumores serosubtipos de alto grado, múltiples ganancias de líneas azules y líneas rojas pérdidas, se identificaron indicando altos niveles de inestabilidad genómica. La principal alteración de la tendencia para la intervención terapéutica en el tumor OC101 fue una amplificación en el cromosoma 17, que involucró a ERBB2, un gen que codifica para el receptor HER2. Para validar los resultados a nivel de ADN, se diseñaron varios conjuntos de imprimaciones específicas para los bordes de la región amplificada.
Y pcR se llevó a cabo. No se absorbió ningún producto de amplificación cuando se utilizó el control del ADN humano. Se identificaron bandas específicas para el ADN tumoral OC101.
En otro tumor variante, T14, se observaron numerosas ganancias de ADN. Esos incluyeron AKT2 en genes RICTOR. La validación realizada a nivel proteico, utilizando inmunoblotting mostró altos niveles de AKT en RICTOR.
Se observó una reducción significativa de la carga tumoral en el grupo tratado con quimioterapia al final de la semana seis. Hubo un beneficio adicional sobre la quimioterapia solo en los grupos que recibieron un tratamiento combinado. Se recogió tejido tumoral para el análisis molecular de la respuesta al tratamiento al final del ensayo de tratamiento.
Los niveles totales y fosforilados de S6, AKT y mTOR se determinaron mediante inmunobloqueo. La comparación de los niveles de estas proteínas en no tratadas, tratadas con quimioterapia y tratadas con inhibidores de AKT o mTOR mostró una marcada disminución para estas dos últimas. El enfoque presentado es muy útil para llevar a cabo el ensayo clínico en modelos PDX.
Aprovecha las características moleculares del tumor obtenidas por el perfil genómico para determinar la mejor opción de fármacos para el análisis.
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Información general
Este protocolo demuestra un algoritmo para probar la eficacia de terapias dirigidas basadas en la composición genómica de los tumores. Incluye la identificación de reordenamientos estructurales del ADN y el trasplante de tumores de pacientes en ratones para probar la respuesta a los medicamentos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Oncología
- Genómica
- Farmacología
Antecedentes
- Las terapias dirigidas se seleccionan según las alteraciones genómicas.
- Entender los reordenamientos del ADN puede informar las opciones de tratamiento.
- Los modelos in vivo son esenciales para probar la eficacia de los medicamentos.
- Se utilizan ratones inmunocomprometidos para el trasplante de tumores.
Propósito del estudio
- Validar la eficacia de los medicamentos seleccionados a través del análisis genómico.
- Establecer un protocolo para las pruebas in vivo de terapias dirigidas.
- Mejorar la comprensión de las respuestas tumorales a tratamientos específicos.
Métodos utilizados
- Secuenciación biológica completa del genoma de especímenes de tumores humanos.
- Identificación de alteraciones genómicas, incluyendo reordenamientos génicos.
- Selección de cambios potencialmente susceptibles a medicamentos según el análisis.
- Tratamiento in vivo de tumores en ratones inmunocomprometidos.
Principales resultados
- Identificación exitosa de reordenamientos estructurales del ADN.
- Validación de medicamentos seleccionados en modelos de ratones.
- Demostración de la eficacia del tratamiento basada en el análisis genómico.
- Perspectivas sobre el comportamiento del tumor en respuesta a terapias dirigidas.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un marco para probar terapias dirigidas.
- El análisis genómico es crucial para seleccionar tratamientos efectivos.
- Los modelos in vivo son valiosos para comprender las respuestas a los medicamentos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to evaluate targeted therapies using patient-derived xenograft models guided by genomic profiling, supporting hypothesis-driven drug selection and mechanistic de-risking in preclinical development. By linking structural DNA alterations to functional drug response, it enhances predictive confidence in target validation and informs go/no-go decisions for combination therapies. The approach is particularly relevant for tumors with high genomic instability where standard therapies fail and off-label drug use is considered.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking structural DNA alterations such as gene amplifications and rearrangements to druggable targets like ERBB2/HER2 and AKT2.
- Operational Value: Supports functional target validation in vivo using PDX models, reducing mechanistic ambiguity before lead optimization.
- Predictive Value: Demonstrates correlation between genomic predictions and observed tumor responses, aiding portfolio triage based on target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (PDX models) with characterized genomic profiles for reliable compound evaluation in downstream screening.
- Operational Value: Standardizes tumor engraftment and treatment protocols, improving reproducibility across studies and enabling scalable preclinical testing.
- Assay Readiness: Generates quantitative molecular readouts (e.g., phosphorylated S6, AKT, mTOR) via immunoblotting to assess pathway inhibition and treatment response.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses patient-derived tumors to maintain disease relevance, bridging genomic findings from human specimens to in vivo models.
- Preclinical Validation: Supports risk-adjusted advancement decisions by demonstrating tumor burden reduction and pathway-specific drug effects in vivo.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed efficacy is due to monotherapy or combination treatment, informing clinical trial design.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates genomic analysis with in vivo efficacy testing, positioning it between target identification and lead optimization in the discovery continuum to enable data-driven progression into preclinical development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by validating whether structurally altered genes are functionally druggable in vivo.
- Screening: Creates assay-ready PDX models with known genomic drivers, enabling reliable compound screening and combination therapy evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (tumor burden, protein phosphorylation) that allow teams to compare drug effects and assess target engagement.
- Translational Research: Maintains continuity from patient tumor to preclinical model, supporting biomarker alignment and predictive modeling of clinical response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for testing targeted therapies across tumor types, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming DNA-level alterations translate to functional drug sensitivity in vivo.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue processing, engraftment, and drug administration protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by prioritizing targets with demonstrated in vivo efficacy, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of drug candidates based on concordance between genomic prediction and PDX response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cancer genomics, pathology, and in vivo modeling to accurately isolate viable tumor tissue and interpret genomic alterations.
- Dependent on next-generation sequencing infrastructure and bioinformatics tools (e.g., Panda tool) for structural alteration analysis and pathway enrichment.
- Necessitates standardized procedures for sterile tumor fragmentation, Matrigel mixing, and subcutaneous engraftment to ensure engraftment success.
- Requires immunoblotting capabilities to assess downstream pathway modulation (e.g., AKT/mTOR/S6) as pharmacodynamic readouts.
- Limited by the time and resource intensity of PDX model generation, which may restrict throughput for large-scale screening campaigns.
