Name: Ex Vivo Presurizado Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparación para Estudio Funcional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a aislar arteriolas y capilares del hipocampo de ratón para estudios de miografía de presión e inmunofluorescencia. Este método ex vivo permite analizar la señalización vascular sin efectos de tejidos circundantes.

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Los autores quieren agradecer a Jules Morin por comentarios perspicaces sobre el manuscrito. Esta investigación fue financiada por premios de la organización sin fines de lucro CADASIL Together We Have Hope, el Center for Women's Health and Research y el NHLBI R01HL136636 (FD).

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Colorado, Anschutz Medical Campus y se realizaron de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Soluciones
<ol><li>Utilice la solución salina con búfer MOPS para la disección y para mantener las muestras a 4 oC antes de su utilización. No gasgaste la solución. Preparar solución salina tamponada MOPS con la siguiente composición: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM de glucosa, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM de piruvato, 10 mg/mL de albúmina bovina, pH 7,3 a 4 oC.</li>
	<li>Utilice líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) como solución de baño y solución de pipeta. Gas tanto aCSF como Ca2+-free aCSF con 5% CO2, 20% O2y N2 balance. Preparar la solución con la siguiente composición: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 mM de glucosa, 2 mM CaCl2,pH 7.3 (con aireación con 5% CO2, 20% O2y N2 de balance).</li>
	<li>Obtenga la dilatación máxima en ACSF nominalmente Ca2+(0 mM [Ca2+]o, 5 mM EGTA).</li>
</ol>2. Preparación de la cámara de órganos
<ol><li>Inserte los capilares de vidrio borosilicato (diámetro exterior de 1,2 mm; diámetro interior a 0,69 mm; longitud a 10 cm) en un tirador de vidrio. Tire del capilar para hacer una punta larga y delgada en un extremo.</li>
	<li>A un lado de la cámara, agregue una cánula que se pueda conectar a una bomba peristáltica en miniatura para presurizar luminalmente el recipiente. Bajo un microscopio de disección, rompa la punta de la cánula para que sea lo suficientemente pequeña como para caber en el recipiente de interés, pero lo suficientemente grande como para permitir que las soluciones fluyan a través de la punta. Asegúrese de que la punta tenga aproximadamente 10-15 m de diámetro.</li>
	<li>Llene la cánula con una jeringa con un filtro de 0,22 m con aCSF oxigenado. Asegúrese de que no haya burbujas de aire o escombros en la cánula.</li>
	<li>Agregue dos cánulas más al lado opuesto de la cámara. No rompas sus consejos.</li>
</ol>3. Disección y aislamiento del hipocampo
<ol><li>Eutanasia y decapita un ratón. Para este experimento, utilice un ratón C57BL6/J de 8 semanas de edad para comparar las diferencias entre machos y hembras. Inyectar el ratón con pentobarbital y decapitar con tijeras quirúrgicas.</li>
	<li>Usando tijeras de disección pequeñas, corta la piel a lo largo de la línea media en la parte superior de su cabeza. Mueva la piel hacia los lados.</li>
	<li>Comenzando en el lado caudal del cráneo, corta el cráneo a lo largo de la línea media hasta que se alcancen las bombillas olfativas. Retire las porciones del cráneo hasta que el cerebro esté expuesto.</li>
	<li>Retire lentamente el cerebro, comenzando cerca de la nariz del ratón. Separe el cerebro de los bulbos olfativos, los nervios craneales y la médula espinal cortando las estructuras con las tijeras de disección pequeñas.</li>
	<li>Coloque el cerebro en una placa de disección con suficiente solución MOPS para sumergirlo por completo. Usando un microscopio de disección, coloque el cerebro en el centro de la placa de disección con el lado ventral hacia abajo.</li>
	<li>Usando una cuchilla de afeitar, corta el cerebro por la mitad a lo largo de la fisura longitudinal. Sujete la hoja de modo que el borde afilado sea paralelo a la parte inferior de la placa de disección. Presione la hoja a través del cerebro de un solo golpe. Mueva un hemisferio a un lado de la placa.</li>
	<li>Realice los siguientes pasos para cada hemisferio por separado o en paralelo.<ol>
<li>Coloque un hemisferio en el centro de la placa para que la línea media esté orientada hacia abajo. A continuación, utilice la cuchilla de afeitar para cortar a lo largo de la fisura transversal para eliminar el cerebelo y el tallo cerebral. Empuje la hoja directamente a través del tejido.</li>
		<li>Gire el hemisferio de modo que el lado medial esté mirando hacia arriba(Figura 1A). Usa una espátula para mantener el cerebro en su lugar. Usando una segunda espátula, inserte la punta debajo del cuerpo calloso y la cuchara debajo para eliminar el tálamo, el tabique y el hipotálamo, cubriendo el hipocampo(Figura 1B).</li>
		<li>Asegúrese de que el hipocampo sea ahora visible como una estructura curva cerca del lado posterior del cerebro. Usando una espátula para mantener el cerebrum en su lugar, utilice la segunda espátula para sacar el hipocampo del cerebro(Figura 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfiera el hipocampo a una nueva placa de disección llena a la mitad con la solución MOPS. Descarta el resto del cerebro.</li>
</ol>4. Aislamiento de arteriolas hipocampales
<ol><li>Complete los siguientes pasos para cada hipocampo.<ol>
<li>Anclar uno de los hipocampi usando pequeños pines en cada extremo de la sección. La arteria del hipocampo está mirando hacia arriba.</li>
		<li>Usando fórceps muy afilados, estira suavemente pequeñas secciones del hipocampo. Esto aflojará el tejido que rodea las arterias, lo que facilita su disección.</li>
		<li>Buscar a través del tejido del hipocampo dorsal para identificar la arteria transversal externa (Figura 1C)16,27.</li>
		<li>Agarre suavemente la arteria transversal externa y tire lentamente del tejido para recoger las arterias y capilares que perfunden la región CA3 del hipocampo.</li>
		<li>Una vez que no haya más vasos que extraer del tejido, deseche el hipocampo. Mantenga los recipientes sobre hielo en placas mientras no estén en uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Canyulación arterioscular capilar-parenquimal hipocampo
<ol><li>Encuentra una arteriola con una rama que termina con capilares. Transfiéralo a la cámara de órganos. Asegúrese de que la arteriola esté a unos 15-30 m cuando esté completamente dilatada(Figura 1D).</li>
	<li>Monte cuidadosamente el vaso sanguíneo empujando la punta de la cánula a través de la pared arteriola por debajo del área objetivo. Deslice cuidadosamente el vaso sobre la cánula hasta que haya suficiente tejido para colocar la corbata.</li>
	<li>Haga un nudo suelto con 12-0 suturas de nylon para que quepa sobre el vaso sanguíneo y la cánula. Usa un nudo de medio enganche para asegurar las corbatas. A continuación, tire de los extremos para apretar el nudo y fijar la arteriola a la cánula. Retire las ramas extrañas del recipiente debajo de la corbata tirando suavemente de ellas con fórceps.</li>
	<li>Haz otra corbata y asegúrate en el otro extremo de la arteriola para sellarla.</li>
	<li>Baje la cánula con el recipiente adjunto hasta que quede plana contra el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara. Tenga cuidado de no bajar demasiado la cánula o se romperá.</li>
	<li>Usando una cánula en el lado opuesto de la cámara, bájala de modo que el punto de la misma aros hacia abajo de la corbata en el extremo de la arteria.</li>
	<li>Utilice la tercera cánula para fijar la rama capilar hasta el cubreobjetos. Coloque la punta cerca del extremo de la rama mientras deja los extremos de los capilares expuestos (no debajo de la cánula).</li>
</ol>6. Miografía de presión
<ol><li>Mueva la cámara del visor de disección al microscopio con el software de grabación.</li>
	<li>Conecte el tubo de entrada y salida a la cámara para perfusión. Iniciar la perfusión con aCSF calentado (37 oC) a un caudal de 4 ml/min.</li>
	<li>Fije la cánula presurizante a una bomba peristáltica emparejada con un transductor de presión y lleve la presión interna a 20 mm Hg.</li>
	<li>Inicie el software de grabación. Ajuste los ajustes del microscopio y de la imagen para lograr la imagen más clara posible. Comience la grabación una vez que los ajustes estén optimizados para el software de detección.</li>
	<li>Aumente la presión del recipiente hasta 40 mm Hg mientras registra el diámetro arterial con un software de detección de bordes.</li>
	<li>Permita que lave la solución MOPS de 15-20 minutos fuera de la cámara con aCSF, y deje que la preparación HiCaPA equilibre y desarrolle el tono miogénico.</li>
	<li>Para probar la viabilidad de un recipiente, aplique 1 solución NS309 a la perfusión de baño (consulte la Figura 2A,B y la sección Resultados representativos). El segmento arteriolar debe dilatarse, demostrando alrededor de 30-40% tono miogénico como se describió anteriormente3,14,20.</li>
</ol>7. Estimulación focal de los extremos capilares
<ol><li>Una vez establecido el tono basal para la arteriola y evaluado la función endotelial, pruebe la respuesta de la estimulación capilar.</li>
	<li>Usando un tirador de vidrio, haga las cánulas para que haya un punto fino en un extremo. Romper la punta de una cánula para que el medicamento probado puede fluir a través de la punta suavemente a 5 psi.</li>
	<li>Llene la cánula con la solución de fármaco de interés y agréguela a un micromanipulador de 3 ejes unido al microscopio. Conecte el tubo del sistema de eyección de presión a la cánula.</li>
	<li>Baje lentamente la cánula en el baño cerca de los capilares, teniendo cuidado de no golpear ninguna parte del recipiente o hardware en la cámara. Maniobra la punta de la cánula junto a los extremos de los capilares sin tocarlos. Mantenga la punta de la cánula justo fuera de la cubierta para evitar que el vaso se estimule si la cánula tiene fugas.</li>
	<li>Cuando esté listo para estimular los capilares, baje la cánula hasta la cubierta y justo al lado de los capilares. Active el sistema de eyección de presión con el tiempo de eyección deseado (aquí 20 s). Una vez finalizada la estimulación, levante ligeramente la cánula para evitar más estimulación.</li>
	<li>Repita la estimulación según sea necesario. Cambie la cánula del sistema de eyección de presión para probar diferentes compuestos farmacológicos.</li>
	<li>Para confirmar que sólo se están estimulando los capilares, llene la cánula con una solución NS309 de 1 M y repita los pasos anteriores. NOTA: Las células endoteliales capilares no expresan canales K+ activados por NS309, por lo que la arteriola no debe responder a la estimulación. Si la arteriola se dilata, entonces la cánula tendrá que ser reposicionada o el diámetro del agujero tendrá que ser más pequeño (ver Figura 2A,B y la sección Resultados Representativos).</li>
</ol>

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<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li>
<li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis%2C+potentially+impacting+cognitive+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La preparación presurizada HiCaPA (arteriola capilar-parénquimal del hipocampo) descrita en el presente manuscrito es una extensión de nuestro procedimiento bien establecido para aislar, presurizar y estudiar arteriolas parénquimas29. Recientemente informamos que los canales Kir2.1 en las células endoteliales capilares cerebrales detectan aumentos en [K+]o asociados con la activación neuronal, y generan una señal de hiperpolarización ascendente que dilata los arteriolas aguas...

La circulación pial en la superficie del cerebro ha sido objeto de mucho estudio, en parte debido a su accesibilidad experimental. Sin embargo, la topología de la vasculatura cerebral crea regiones distintas. A diferencia de la robusta red pial rica en anastomosas con capacidad sustancial para redirigir el flujo sanguíneo, las arteriolas parénquimas intracerebrales (PA) presentan un suministro colateral limitado, cada uno de ellos perdiendo un volumen discreto de tejido nervioso1,2. Esto crea un efecto cuello de botella en el flujo sanguíneo que, combinado con características fisiológicas únicas3,4,5,6,7,8, hace que las arterias intracerebrales un sitio crucial para la regulación del flujo sanguíneo cerebral (CBF)9,10. A pesar de los desafíos técnicos inherentes al aislamiento y la cannulación de los PA, en la última década se ha visto un mayor interés en los estudios funcionales ex vivo utilizando recipientes presurizados11,12,13,14,15,16,17. Una de las razones de este mayor interés es el considerable esfuerzo de investigación realizado en el acoplamiento neurovascular (NVC), el mecanismo que sostiene la hiperemia funcional cerebral18.
Regionalmente, CBF puede aumentar rápidamente después de la activación neuronal local19. Los mecanismos celulares y las propiedades de señalización que controlan NVC se entienden incompletamente. Sin embargo, identificamos un papel previamente imprevisto para los capilares cerebrales durante la nCV en la observación de la actividad neuronal y traduciéndolo en una señal eléctrica hiperpolarizadora para dilatar las arterias aguas arriba20,21,22. Potenciales de acción23,24 y apertura de canales de gran conducta ca2+-activados K+ (BK) en los pies de extremo astrocíticos25,26 aumentan la concentración de iones de potasio intersticial [K+] o ,loque resulta en la activación de fuertes canales rectificadores internos K+ (Kir) en el endotelio vascular de los capilares. Este canal es activado por K+ externo, pero también por hiperpolarización en sí. La corriente hiperpolarizante se regenera en las células endoteliales capilares adyacentes hasta la arteriola, donde provoca relajación de los miocitos y aumento de la CBF20,21. El estudio de este mecanismo nos llevó a desarrollar una preparación capilar-parénquimal presurizada (CaPA) para medir el diámetro arteriolar durante la estimulación capilar con agentes vasoactivos. La preparación de CaPA se compone de un segmento de arteriolas intracerebrales canulados con una ramificación capilar intacta y aguas abajo. Los extremos capilares se comprimen contra el fondo del cristal de la cámara mediante un micropipeta, que ocluye y estabilice toda la formación vascular20,21.
Anteriormente realizamos innovaciones instrumentales mediante la toma de imágenes de los preparativos de CaPA a partir de la corteza del ratón20,21 y arterioles de la amígdala de rata13 y el hipocampo16,17. A medida que la vasculatura del hipocampo recibe más atención debido a su susceptibilidad a las condiciones patológicas, aquí proporcionamos un método paso a paso para la preparación de CaPA desde el hipocampo de ratón (HiCaPA) que no sólo se puede utilizar en estudios funcionales de NVC, sino también en biología molecular, inmunoquímica y electrofisiología.

<table><tbody><tr><td>0.22 y micro; m Filtros de jeringa</td><td>CELLTREAT Productos Científicos</td><td>229751</td><td></td></tr><tr><td>12-0 Nylon (12cm) Negro</td><td>Microsurgery Instruments, Inc</td><td>S12-0 NYLON</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura automático</td> Warner <td>Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato Diámetro exterior: 1,2 mm, diámetro interior: 0,68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZ11</td><td></td></tr><tr><td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &mdash; bomba completa con accionamiento y cabezal MS/CA 4-12</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1090</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de agua en línea</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Integra&trade; Miltex&comercio; Pinza de tejido</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ML 133 clorhidrato</td><td>Tocris</td><td>4549</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NS309</td><td>Tocris</td><td>3895</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III - Sistemas de Dispensación de Microinyección Intracelular, 2 canales</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Servocontrolador de Presión con Bomba Peristáltica Living Systems</td><td>Instrumentación</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td> <td>SuperfinasFine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas - afiladas-romas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas vertical</td><td>Narishige</td><td>PP-83</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo presurizado hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparación para estudio funcional

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Desde alteraciones conductuales sutiles hasta demencia en etapa sorpresa, el deterioro cognitivo vascular generalmente se desarrolla después de la isquemia cerebral. El accidente cerebrovascular y el paro cardíaco son enfermedades notablemente dimórficas sexualmente, y ambas inducen isquemia cerebral. Sin embargo, el progreso en la comprensión del deterioro cognitivo vascular, y luego el desarrollo de tratamientos específicos del sexo, se ha visto en parte limitado por los desafíos en la investigación de la microcirculación cerebral de los modelos de ratón en estudios funcionales. Aquí, presentamos un enfoque para examinar la señalización capilar-a-arteriola en una preparación ex vivo del arteriolo capilar-parenquimal del hipocampo (HiCaPA) del cerebro del ratón. Describimos cómo aislar, canalizar y presurizar la microcirculación para medir el diámetro arteriolar en respuesta a la estimulación capilar. Mostramos qué controles funcionales apropiados se pueden utilizar para validar la integridad de la preparación hiCaPA y mostrar resultados típicos, incluyendo la prueba de potasio como un agente de acoplamiento neurovascular y el efecto del inhibidor recientemente caracterizado de la familia de canales de potasio de retificación interna Kir2, ML133. Además, comparamos las respuestas en los preparados obtenidos de ratones machos y hembras. Si bien estos datos reflejan investigaciones funcionales, nuestro enfoque también se puede utilizar en estudios de biología molecular, inmunoquímica y electrofisiología.

Los canales Endoteliales de pequeña conductancia (SK) e intermedio de conductividad (IK) Ca2+-sensibles K+ ejercen una influencia dilatoria sobre el diámetro de los PA. Aplicación de baño de 1 M NS309, un agonista sintético del canal IK y SK, causado cerca de la dilatación máxima(Figura 2A, B). Sin embargo, las células endoteliales capilares carecen de canales IK y SK y no hiperpolarizan en respuesta a NS309<sup class="x...

El presente manuscrito detalla cómo aislar las arterias y capilares del hipocampo del cerebro del ratón y cómo presurizarlas para miografía a presión, inmunofluorescencia, bioquímica y estudios moleculares.

Ex Vivo Presurizado Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparación para Estudio Funcional

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Nuestro método permite el estudio de los vasos sanguíneos ubicados en estructuras que de otro modo serían difíciles de imaginar en Vivo, como el hipocampo. Debido a que los vasos sanguíneos se extraen del tejido cerebral, la señalización entre los capilares y la arteriola se puede estudiar sin efectos fuera del objetivo en el tejido circundante. Para aislar el hipocampo, usa pequeñas tijeras de disección para cortar la piel a lo largo de la línea media en la parte superior de la cabeza del ratón y mover la piel hacia los lados.Comenzando en el lado caudal del cráneo, corte el cráneo a lo largo de la línea media hasta que se alcancen los bulbos olfativos y retire partes del cráneo hasta que el cerebro esté expuesto. Comenzando cerca de la nariz del ratón, retire lentamente el cerebro, usando las tijeras para cortar a través de los bulbos olfativos, los nervios craneales y la médula espinal. Sumerja el cerebro, el lado ventral hacia abajo en MOPS Buffered Saline, en el centro de una placa de disección, y coloque la placa debajo de un microscopio de disección.Sosteniendo el borde afilado paralelo a la parte inferior de la placa, utilice cuchilla de afeitar para cortar el cerebro por la mitad a lo largo de la fisura longitudinal en un solo golpe. Coloque un hemisferio en el centro de la placa con la línea media hacia abajo y empuje la cuchilla de afeitar directamente a través del tejido a lo largo de la fisura transversal para eliminar el cerebelo y el tallo cerebral. Gire el hemisferio de modo que el lado medial esté mirando hacia arriba y use una espátula para mantener el cerebro en su lugar.Inserte la punta de una segunda espátula debajo del cuerpo calloso, recogiendo debajo del tejido para extraer el tálamo, el tabique y el hipotálamo del hipocampo. El hipocampo ahora debe ser visible como una estructura curva cerca del lado posterior del cerebro. Usando una espátula para mantener el cerebro en su lugar, usa la segunda espátula para sacar el hipocampo del cerebro.A continuación, transfiera el hipocampo a una nueva placa de disección, llena a mitad de camino con una solución MOP fresca. Para el aislamiento de arteriole hipocampal, coloque pequeños alfileres en cada extremo de un hipocampo para asegurar la muestra de la arteria hipocampal hacia arriba. Usando fórceps muy afilados, estira suavemente pequeñas secciones del hipocampo para aflojar el tejido que rodea las arterias.Y busque a través de los tejidos del hipocampo dorsal para identificar las arterias transversales externas. Cuando la arteria haya sido localizable, agarra la arteria transversal externa del hipocampo y aparta lentamente del tejido para recoger las arterias y capilares. La arteria de cada hipocampo se extrae por separado.Cuando no haya más vasos que extraer, coloque las muestras sobre hielo y deseche el tejido del hipocampo restante. Para la cánulación de las arterias, localice y arteriole con una rama que termina con capilares y coloque la arteriola en una cámara de órganos. Empuje con cuidado la punta de la cánula a través de la pared de la arteria debajo del área objetivo para montar el vaso sanguíneo.Luego, deslice cuidadosamente el recipiente sobre la cánula hasta que haya suficiente tejido en el que colocar la corbata. Usa 12-0 suturas de nylon para hacer un nudo suelto que que quepa sobre el vaso sanguíneo y la cánula, y usa un nudo de medio enganche para asegurar las ataduras, tira de los extremos para apretar el nudo para asegurar la arteria a la cánula. Asegure otra corbata en el otro extremo de la arteria para sellarla.En el lado opuesto de la cámara, baje una segunda cánula hasta que el punto de la cánula pin abajo la corbata en el extremo de la arteriola. A continuación, utilice una tercera cánula para fijar la rama capilar al cubreobjetos, colocando la punta cerca del final de la rama, dejando los extremos de los capilares expuestos. Como la microcirculación cerebral es exquisitamente frágil, asegúrese de minimizar el estiramiento y el manejo de los vasos durante el procedimiento de canulación para asegurar la supervivencia de las arteriolas.Para el análisis de la mimografía por presión, transfiera la cámara a una etapa de microscopio de luz con software de grabación y conecte el tubo de entrada y salida a la cámara para su profusión. Inicie la profusión con 37 grados Celsius Líquido cefalorraquídeo artificial a un caudal de cuatro mililitros por minuto, y conecte la cánula de presión a la bomba peristáltica emparejada con un transductor de presión. Lleve la presión interna a 20 milímetros de Mercury e inicie el software de grabación.Ajuste el microscopio y los ajustes de imagen para lograr la imagen más clara posible. Y utilice el software de detección de bordes para comprobar que la arteriola tiene entre 15 y 30 micrómetros de diámetro cuando está completamente dilatada. Una vez optimizados los ajustes, comience la grabación y aumente la presión intravascular en el recipiente hasta 40 milímetros de Mercurio, mientras registra el diámetro de la arteriola con el software de detección de bordes.A continuación, profuse la cámara durante 15 a 20 minutos para lavar la solución MOP. Para probar la viabilidad del recipiente, aplicar una solución de micromolar NS309 a la profusión del baño, el segmento arteriolar debe dilatarse, demostrando un tono miogénico de 30 a 40%. Una vez que se haya establecido el tono de referencia para la arteriola, utilice un tirador de vidrio para hacer cánulas con un punto fino en un extremo, y use fórceps para romper la punta de cada cánula, de modo que la droga de interés pueda fluir suavemente a través de la punta a cinco libras de presión por pulgada cuadrada.Llene la cánula con la droga de interés. Y cargue la cánula en un micromaniprógrafo de tres ejes unido al microscopio. Conecte el tubo del sistema de eyección de presión a la cánula, y baje lentamente la cánula en el baño cerca de los capilares, teniendo cuidado de no golpear ninguna parte del recipiente o la cámara.Para estimular los capilares, baje la cánula a la cubierta justo al lado de los capilares y active el sistema de eyección de presión con el tiempo de eyección deseado. Al final de la estimulación, levante ligeramente la cánula para evitar una mayor estimulación. Para confirmar que sólo se estaban estimulando los capilares, llene la nueva cánula con un micromolar de solución NS309 y estimule los capilares como se ha demostrado.A continuación, obtener la vasodilatación máxima mediante el baño de la preparación con la solución libre de calcio. La aplicación de baño de un micromolar NS309 causa una dilatación casi máxima de la arteriola debido a los canales de potasio sensibles al calcio en el endotelio. Células endoteliales capilares sin embargo, carecen de canales de conductancia intermedios y pequeños y no hiperpolarizan en respuesta al agonista, como resultado, estimulando los extremos capilares con NS309, no causa dilatación arteriolar aguas arriba, esto indica que NS309 no llegó a la arteria, y se puede utilizar como control para acceder a la restricción de spa del compuesto aplicado en los capilares por eyección de presión.Utilizando la preparación de arteriollado parénquimal capilar hipocampal como se demostró, la aplicación de un líquido cefalorraquídeo artificial complementado con 10 mililitros de potasio a los extremos capilares, da como resultado una dilatación arteriolar aguas arriba que no difiere entre las preparaciones de ratones machos y hembras. Además, la adición del inhibidor de Kir2 ML 133, prácticamente abolia la dilatación arteriolar inducida capilar, en respuesta a 10 mililitro de potasio en preparaciones de ratones machos y hembras. Al montar la vesssel de sangre, limite las interacciones directas con el vaso sanguíneo para minimizar el daño y aumentar la viabilidad del vaso.Una vez que el vaso sanguíneo ha sido aislado, diferentes compuestos farmacológicos pueden ser probados o el vaso sanguíneo se puede procesar más para la biología olecular, inmunoquímica, o estudios de electrofisiología.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se presenta un protocolo para cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales, que permite reproducir muchos aspectos de la lesión cerebral isquémica. Al estudiar los cambios en la neurovasculatura además de los cambios en las neuronas, este protocolo es una herramienta versátil para estudiar los cambios plásticos en el tejido neural después de una lesión.

El análisis de la remodelación neurovascular en cultivos de cortes organotípicos entorinino-hipocampales

Este artículo describe un método mediante el cual se puede cuantificar la arquitectura vascular en el cerebro utilizando microscopía de dos fotones in vivo y ex vivo.

Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH

Este manuscrito describe un protocolo simple y reproducible para el aislamiento de arteriolas intracerebrales (un grupo de vasos sanguíneos que abarcan arteriolas parenquimatosas, arteriolas penetrantes y arteriolas precapilares) de ratones, para ser utilizado en miografía a presión, inmunofluorescencia, bioquímica y estudios moleculares.

El aislamiento y la canulación del parénquima cerebral arteriolas

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Tubos capilares del cerebro aislado de tejido de cerebro humano pueden utilizarse como un modelo preclínico para estudiar la función de barrera bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano fresco.

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Se presenta un método que puede proporcionar más información sobre los eventos principios subyacentes a la neurodegeneración y basado en la técnica de cerebro establecido ex vivo , combinando las ventajas de los experimentos en vivo y en vitro . Además, representa una oportunidad única para comparación directa del grupo tratado y no tratado en el mismo plano anatómico.

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Este manuscrito describe un protocolo simple para el aislamiento de las arteriolas de la retina de rata que puede utilizarse en, calcio presión y proyección de imagen de miografía estudios electrofisiológicos.

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La preparación intensiva de "tubos" endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

El protocolo aquí proporciona un muestreo dinámico detallado en tiempo real del líquido extracelular del hipocampo de ratas despiertas utilizando un sistema de microdiálisis.

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Aprende a aislar arteriolas y capilares del hipocampo de ratón para estudios de miografía de presión e inmunofluorescencia. Este método ex vivo permite analizar la señalización vascular sin efectos de tejidos circundantes.

Ex Vivo Presurizado Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparación para Estudio Funcional

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