Name: Aislamiento concomitante de astrocitos primarios y microglia para la infección por parásitos protozoos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a aislar astrocitos y microglia primarios de cortezas de ratón recién nacido para estudiar infecciones por protozoos en el SNC. Este método optimiza el uso de animales y permite análisis comparativos de respuestas inmunes.

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Nos gustaría dar las gracias al profesor Dr. Renato A. Mortara, de la Universidad Federal de Sao Paulo (UNIFESP), por mAb 2C2 anti-Ssp-4. Esta obra fue apoyada por subvenciones de la Fundación de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, subvención 2017/25942-0 a K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 402100/2016-6 a K.R.B., Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Vacinas (INCTV/CNPq) y Coordena-o de Aperfei-oamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código De Finanzas 001). M.P.A. recibe beca de CNPq, A.L.O.P. recibe beca de CAPES, e I.S.F y L.Z.M.F.B. reciben beca de FAPESP.

Todos los procedimientos experimentales relacionados con ratones fueron llevados a cabo de acuerdo con la Ley Nacional de Brasil (11.794/2008) y aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Federal de Sao Paulo (UNIFESP).
1. Extracción, Mantenimiento y Disociación de Células Glial
NOTA: El número de ratones utilizados para la extracción de células gliales depende de la cantidad de células necesarias para realizar los experimentos deseados. En este protocolo, se obtuvieron un total de 2,7 x 107 astrocitos y 4 x 106 microglia de seis ratones C57BL/6 neonatales. Todos los procedimientos se realizaron en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de clase II.
<ol><li>Día 1
	<ol>
<li>Preparar la solución salina equilibrada (HBSS) y hbss de Hank pura + 10% del suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Preparar el medio de águila modificado (DMEM) /F12 de Dulbecco complementado (10% FBS + 0,08 mM penicilina + 0,09 mM de estreptomicina + 12,5 mM HEPES + 30 mM de bicarbonato sódico, pH 7,2) y filtrarlo con un filtro de 0,22 mM (ver Tabla de Materiales). NOTA: Todos los medios de cultivo deben almacenarse a 4 oC, pero es necesario precalentarlos a 37 oC durante 20 minutos antes de iniciar el experimento.</li>
		<li>Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos (tijeras, espátulas y pinzas) en un autoclave y utilice 70% de etanol durante el procedimiento.</li>
		<li>Coloque ratones recién nacidos (hasta 3 días de edad) en una cámara sellada que contenga algodón empapado con isoflurano durante 5 minutos para una anestesia profunda.</li>
		<li>Rocíe el cachorro de ratón con 70% de etanol y decapita al animal con tijeras.</li>
		<li>Hacer corte sagital (de adelante a anterior) con tijeras a lo largo del cráneo para abrirlo y exponer el cerebro. Separe el cráneo del cerebro usando pinzas. Retire el cerebro usando una micro espátula para mantener la integridad del cerebro.</li>
		<li>Coloque el cerebro en una placa De Petri seca (6 cm de diámetro). Retire la bombilla olfativa y el cerebelo con una micro espátula. Mueva la corteza a otra placa de Petri (6 cm de diámetro) que contenga HBSS + 10% FBS (2 mL/Petri dish).</li>
		<li>Cortar el tejido cerebral en trozos pequeños con tijeras estériles y usando una micropipeta p1000 transferir cada tejido cerebral con HBSS + 10% FBS a diferentes tubos cónicos de 15 ml. Asegúrese de que el volumen final es de 2 ml/tubo. Si no es así, complete con HBSS + 10% FBS. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Si es así, los tubos cónicos con tejido sNC deben colocarse en hielo hasta 1 h.</li>
		<li>Lavar el tejido cerebral cortado con 3 ml de HBSS + 10% FBS (por tubo) y después de la decantación. Retire con cuidado el sobrenadante. Repita este paso 3 veces. NOTA: Este paso tiene como objetivo eliminar los desechos y recuperar el tejido extraído.</li>
		<li>Lavar el tejido cerebral cortado con 3 ml de HBSS puro (por tubo) y después de la decantación, retirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso 3 veces. NOTA: Este paso tiene como objetivo eliminar el suero restante de los lavados anteriores, ya que las células se trippsinizarán en el siguiente paso.</li>
		<li>Añadir 3 ml de trippsina por tubo y colocar en un baño de agua a 37 oC durante 30 minutos, agitando suavemente los tubos cada 5 minutos. Evitar burbujas invirtiendo o mezclando abruptamente los tubos. NOTA: Este paso tiene como objetivo digerir el tejido recogido.</li>
		<li>Para desactivar la tripsina, lave el tejido con 3 ml por tubo de HBSS + 10% FBS y, después de la decantación del tejido, retire cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso 3 veces.</li>
		<li>Lavar el tejido con 3 ml por tubo de HBSS puro y retirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso 2 veces.</li>
		<li>Añadir 7 ml por tubo de HBSS puro y homogeneizar el tejido a través de conductos sucesivos en pipetas: primero con la pipeta serológica de 10 ml, seguido de los 5 ml y finalmente con la micropipeta p1000.</li>
		<li>Después de la homogeneización, los tubos centrífugos a 450 x g durante 5 min a 4 oC.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 4 ml de HBSS + 10% FBS por tubo.</li>
		<li>Transfiera las células a un matraz T-75 pretratado para una óptima adhesión al cultivo celular (ver Tabla de Materiales). NOTA: Procesar el tejido de cada animal por matraz.</li>
		<li>Colocar el matraz en la incubadora a 37oC y 5%CO2 durante 30 min para adherencia.</li>
		<li>Añadir 10 ml de DMEM/F12 suplementado por matraz e incubar a 37oC y 5%CO2. NOTA: El volumen final es de 14 ml por matraz.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 3
	<ol>
<li>Retire 7 ml de medio de cultivo del matraz T-75 y añada 7 ml de DMEM/F12 recién suplementado. NOTA: Los matraces contendrán una gran cantidad de residuos celulares y un aspecto turbio.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 5
	<ol>
<li>Retire todo el medio del matraz T-75 y añada 14 ml de DMEM/F12 recién suplementado. NOTA: El medio se sustituye de los matraces para eliminar los residuos y las células no adherentes.</li>
		<li>Después de cada 48 h, quitar 6 ml del sobrenadante y añadir 7 ml de medio DMEM/F12 recién suplementado hasta el día 14 del cultivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 14
	<ol>
<li>Después de quitar 6 ml del sobrenadante y añadir 7 ml de medio DMEM/F12 complementado fresco, cierre firmemente los matraces T-75.</li>
		<li>Colóquelos en el agitador orbital del suelo a 200 rpm y 37 oC durante la noche para disociar mecánicamente la microglia de los astrocitos.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 15
	<ol><li>Tome los frascos de la coctelera y lávelos vigorosamente con su propio medio para optimizar la disociación celular y cosechar el número máximo de microglia. A continuación, recoja el sobrenadante (que contiene microglia) y transfiera a un tubo cónico de 50 ml.</li>
		<li>A continuación, añadir 4 ml de trippsina en cada matraz e incubar durante 5 min a 37 oC para separar los astrocitos.</li>
		<li>Añadir 5 ml por matraz de DMEM/F12 suplementado para inactivar la trippsina. Lavar los matraces con su propio medio y transferir el contenido a un tubo cónico de 50 ml.</li>
		<li>Centrifugar todos los tubos que contengan microglia disociada y astrocitos a 450 x g durante 5 min a 4oC.</li>
		<li>Descarta el sobrenadante. Resuspenda el pellet de microglia en 1 ml y los astrocitos en 10 ml de DMEM/F12 complementado.</li>
		<li>Proceda al conteo celular en una cámara Neubauer o en un contador de celdas automático. Placar las células con DMEM /F12 suplementado a la densidad deseada en una placa de cultivo de celda inferior plana adecuada (pretratada para un accesorio celular óptimo; ver Tabla de materiales). Incubar células a 37oC y 5% deCO2 durante 24 h para permitir que se adhieran. NOTA: Reserve 1.5 x 106 de cada población celular para confirmar su pureza por citometría de flujo.</li>
		<li>Realice un análisis citométrico de flujo para verificar la pureza de las poblaciones celulares. NOTA: Consideramos microglia CD11b+/CD45+/GFAP- y astrocitos CD11b-/CD45-/GFAP+. Podría considerarse la tinción Iba1 y TMEM119 para caracterizar plenamente la microglia22.</li>
		<li>Agregue un FMO (Fluorescence Minus One)23 y una muestra no manchada para cada población celular (astrocitos y microglia) como controles del ensayo de citometría de flujo.</li>
		<li>Para cada población celular, reserve 5 x 105 células por cada muestra manchada y no manchada. Para FMO, reserve otros dos tubos de microglia que contengan 2,5 x 105 células cada uno y también reserve otro tubo de 5 x 105 astrocitos. NOTA: Dado que los números de microglia pueden ser un factor limitante, es posible utilizar menos celdas para controles de FMO y no manchados.</li>
		<li>Centrifugar todos los microtubos a 450 x g durante 5 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 500 l/microtubo de tampón FACS (solución salina con fosfato (PBS) + 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7,2).</li>
		<li>Centrifugar todos los microtubos a 450 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 100 l/microtubo de anti-CD16/CD32 (clon 93) (1:50) diluido en el búfer FACS. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir 500 l/microtubo de tampón FACS en todos los microtubos y centrifugar a 450 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspenda los tubos de tinción de astrocitos y microglia y también el tubo FMO de astrocitos con mezcla de 50 l/microtubo de marcadores de superficie: anti-CD45 (PE, clon 30-F11) y anti-CD11b (eFluor 450, clon M1/70) (ambos diluidos a 1: 100 en búfer FACS).</li>
		<li>Para las celdas no manchadas, resuspenda con el mismo volumen del búfer FACS. Para la microglia FMO, incubar cada tubo de microglia con anti-CD45 o anti-CD11b. Incubar todas las muestras a 4 oC durante 20 minutos en la oscuridad.</li>
		<li>Añadir 500 l de tampón FACS por microtubo. Centrífuga a 450 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 100 l/microtubo de tampón de fijación (ver Tabla de materiales)durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
		<li>Añadir 500 l/microtubo de tampón de permeabilización 1x (ver Tabla de Materiales)e incubar a 4 oC durante 5 minutos en la oscuridad.</li>
		<li>Centrifugar todos los microtubos a 450 x g a 4 oC durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspenda los tubos de tinción de astrocitos y microglia y también los tubos de microglia FMO con 50 l/microtubo de anticuerpos intracelulares anti-GFAP (APC, clon GA5) en una dilución 1:100 en 1x tampón de permeabilización. Para las células no manchadas y la FMO astrocito, resuspenda las celdas con el mismo volumen de búfer FACS. Incubar todas las muestras a 4oC durante 30 min en la oscuridad.</li>
		<li>Lave todos los tubos añadiendo 500 l/microtubo de 1 tampón de permeabilización. Centrifugar todos los microtubos a 450 x g,durante 5 min a 4oC. Resuspenda cada microtubo en 200 ml de tampón FACS. Adquirir 1 x 105 eventos/muestra en el catómetro de flujo.</li>
		<li>Para el análisis, las celdas deben ser cerradas primero en CD11b x CD45 y luego el histograma GFAP. NOTA: Los controles no manchados y FMO son útiles para determinar las puertas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Infección y evaluación de las tasas de infección
<ol><li>Infección de células gliales con T. gondii
	<ol>
<li>Placa 3 x 104 microglia o astrocitos con DMEM/F12 suplementado a 37oC y 5%CO2 para 24 h en una placa plana pretratada de 96 pocillos (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Infectar cada población celular con taquizoitos de T. cepa gondii RH que expresa proteína fluorescente amarilla (YFP) a una multiplicidad de infección (MOI) de 1:1 (parásito:célula) diluida en 200 l/pozo de RPMI suplementada (3% FBS + 0,16 mM penicilina + 0,18 mM de estreptomicina + 12,5 mM de HEPES + 30 mM de bicarbonato de sodio, pH 7.2) (ver Tabla de Materiales). Incubar a 37oC y 5%CO2 durante 48 h.</li>
		<li>A continuación, deseche el sobrenadante y fije las células agregando 100 l/pozo de 1% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS a 4 oC durante 24 h.</li>
		<li>Sustituya el PFA por 100 l/pozo de PBS a pH 7.2.</li>
		<li>Retire cuidadosamente los núcleos de las células de sobrenadant y mancha pipeteando 50 l/pozo de DAPI (5 mg/ml) diluidos en PBS pH 7.2 (1:1,000) durante 1 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
		<li>Sustituya la solución de tinción DAPI por 100 l/pozo de PBS (pH 7.2) y analícela mediante microscopía de fluorescencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Infección de células gliales con T. cruzi
	<ol>
<li>Placa 3 x 104 microglia o astrocitos con DMEM/F12 suplementado a 37oC y 5%CO2 para 24 h en una placa plana pretratada de 96 pocillos (ver Tabla de Materiales). NOTA: Para cada punto de inflamación, utilice una placa diferente.</li>
		<li>Infectar las células gliales con trippomastigotes de cepa T. cruzi Y a un MOI de 5:1 (parásitos:célula) diluido en 200 l/pozo de RPMI suplementada e incubar a 37 oC y 5% deCO2 durante 2 h. NOTA: Este paso es importante para la invasión celular por el parásito.</li>
		<li>Retire todos los sobrenadantes y lave los pozos añadiendo 200 l/bien de RPMI suplementada para eliminar todos los parásitos extracelulares. Retire el sobrenadante y agregue 200 l/bien de RPMI suplementada fresca. NOTA: Este paso tiene la intención de eliminar todos los parásitos que no invadieron las células adherentes.</li>
		<li>Incubar células infectadas durante 2 h, 48 h y 96 h para evaluar la replicación de T. cruzi en células gliales11.</li>
		<li>Después de cada punto de tiempo, retire el sobrenadante y fije las células con 100 l/pozo de metanol durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego reemplace el metanol por 100 l/bien de PBS (pH 7.2).</li>
		<li>Después de la fijación, prepare las células para el ensayo de inmunofluorescencia de la siguiente manera.<ol>
<li>Para evitar la autofluorescencia, trate las células con 100 ml/pozo de 50 mM NH4Cl diluidos en PBS (pH 8.0) durante 15 minutos.</li>
			<li>A continuación, permeabilizar las células agregando 100 l/pozo de 0.5% De tritón diluido en PBS durante 15 minutos.</li>
			<li>A continuación, incubar el cultivo celular con 100 l/pozo de solución de bloqueo (5% de leche sin grasa + 2% de BSA diluido en PBS [pH 7.2]) durante 1 h a temperatura ambiente. Lave las células añadiendo 100 l/bien de PBS y retírelas inmediatamente (repita este paso 3 veces).</li>
			<li>Para manchar alostigotes, incubar con 30 l/pozo de anticuerpo monoclonal no comercial (mAb) 2C2 proteína anti-Ssp-4 (1:200) diluida en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
			<li>Lave las células añadiendo 100 l/bien de PBS y retírelas inmediatamente (repita este paso 3 veces). Incubar la placa con 30 l/pozo de anticuerpo antiratón secundario (1:500) diluido en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. NOTA: La proteína no comercial mAb 2C2 anti-Ssp-4 fue un regalo amable del Prof. Dr. Renato A. Mortara del Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología de la Universidad Federal de Sao Paulo.</li>
			<li>Retire cuidadosamente los núcleos de sobrenadant y mancha añadiendo 50 l/pozo de DAPI (5 mg/ml) diluido en PBS pH 7.2 (1:1,000) durante 1 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
			<li>Sustituya la solución de tinción DAPI por 100 l/pozo de PBS pH 7.2 y analícela mediante microscopía de fluorescencia.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).</li>
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<li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3814(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La importancia de estudiar las funciones aisladas de las células gliales en contextos biológicos distintos se ha ido ampliando en las últimas dos décadas. Comprender el SNC más allá de las neuronas sigue siendo un campo creciente en la biología celular, especialmente en infecciones o condiciones inflamatorias8,9,24. Las células gliales son cruciales no sólo para el soporte físico de las neuronas (como se conocía anteriormente), ...

El SNC se compone principalmente de neuronas y células gliales1,2,3. La microglia y los astrocitos son las células glias más abundantes del SNC. Microglia, el macrófago residente, es el inmunocompetente y la célula glia fagocítica en el SNC3,4, mientras que los astrocitos son responsables de mantener la homeostasis y ejercer funciones de apoyo5.
A pesar de que las células gliales son clásicamente conocidos por ser responsables del apoyo y la protección de las neuronas6,7, las funciones emergentes de estas células se han descrito en la literatura reciente, incluyendo sus respuestas a las infecciones8,9,10,11. Por lo tanto, hay un empujón para desarrollar métodos para aislar estas células gliales para entender sus funciones individualmente.
Existen algunos modelos alternativos para estudiar células gliales en lugar de cultivos primarios, como linajes celulares inmortalizados y modelos in vivo. Sin embargo, las células inmortalizadas son más propensas a sufrir cambios genéticos y morfológicos, mientras que los estudios in vivo imponen condiciones de manipulación limitadas. Por el contrario, los cultivos primarios son fáciles de manejar, se asemejan mejor a las células in vivo y también nos permiten controlar los factores experimentales12,,13. Aquí, describimos pautas sobre cómo extraer, mantener y disociar astrocitos murinos y células primarias de microglia en el mismo protocolo. Además, también proporcionamos ejemplos sobre cómo trabajar con la infección protozoa en estos cultivos.
Las células del SNC extraídas de ratones neonatales (hasta 3 días de edad) se cultivaron durante 14 días en medios diferenciales que permiten el crecimiento preferencial de astrocitos y células de microglia. Dado que la microglia descansa por encima de los astrocitos adjuntos, las poblaciones celulares se disociaron mecánicamente en una incubadora orbital. A continuación, recogimos todo el sobrenadante que contiene microglia y añadimos trippsina para separar los astrocitos. Las células gliales aisladas fueron evaluadas fenotípicamente por citometría de flujo y chapadas de acuerdo con el experimento deseado.
También proporcionamos ejemplos sobre cómo infectar a estas microglias aisladas y astrocitos con parásitos protozoos. T. gondii es un protozoo altamente neurotrópico responsable de la toxoplasmosis14,mientras que T. cruzi es responsable de la enfermedad de Chagas que puede conduce al desarrollo de trastornos neurológicos en el SNC15,,16. Además, también se ha informado de que la infección por T. gondii17,18 o T. cruzi19,20,21 fueron la causa presumible de muerte en pacientes inmunocomprometidos. Por lo tanto, el esclarecimiento del papel inmunológico de las células gliales del SNC en el control de las infecciones protozoarias es de gran importancia.

<table><tbody><tr><td>70% Etanol</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea</td><td>Cat: 2231</td><td>Esterilizar</td></tr><tr><td>75 cm2 Matraz</td><td>Corning</td><td>Cat: 430720U</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Greiner Cellstar</td><td>Cat: 655090</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio (NH4Cl)</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea</td><td>Cat: C10337.01.AH</td> Eliminar el <td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-GFAP</td> de autofluorescencia <td>Abcam</td><td>Cat.: ab49874</td><td>Inmunofluorescencia antidoby</td></tr><tr><td>Bottle Top Filter 0.22 &mu; mm CA</td><td>Corning</td><td>Cat: 430513</td><td>Filtro de medio de cultivo</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Gato: A7906</td><td>FACS Preparación de tampón</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td><td>BD Pharmigen</td><td>Cat.: 553310</td><td>Anticuerpo de citometría de flujo</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 12-0451-83</td><td>Centrífuga de anticuerpos contra citometría</td></tr><tr><td>de</td> flujo <td>Eppendorf</td><td>Cat: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>Centrifugación</td></tr><tr><td>Clase II cabina de bioseguridad</td><td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>Cabina de bioseguridad para procedimientos estériles</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>ThermoScientific</td><td>Modelo: 3110</td><td>Mantenimiento de células primarias</td></tr><tr><td>Tubos cónicos 15 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 430766</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Tubos cónicos 50 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 352070</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: C10281</td><td>Contador de células</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: D1306</td><td>Inmunofluorescencia antidoby</td></tr><tr><td>Cámara de microscopio digital</td><td>Nikon</td><td>Cat: DS-RI1 Captura de</td><td>imágenes en el microscopio</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat: 12800-058</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Gato: E9884</td><td>FACS Preparación tampón</td></tr><tr><td>F12 Mezcla de nutrientes</td><td>Gibco</td><td>Cat: 21700-026</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>Citómetro de flujo no disponible</td><td>Suero</td></tr><tr><td>fetal bovino (FBS)</td><td>LGC Biotechnology</td><td>Cat: 10-bio500-1</td><td>Suplemento de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Flow Jo (software)</td><td>Flow Jo</td><td>Versión: Flow Jo_9.9.4</td><td>Análisis de datos</td></tr><tr><td>Fluorescencia intensa</td><td>Nikon</td><td>Cat: C-HGFI</td><td>Fuente de fluorescencia</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 50-9892-82</td><td>Anticuerpo de citometría</td>de flujo</tr><tr><td>Cabra - anti-ratón IgG (FITC)</td><td>Kirkeegood& Perry Lab (KPL)</td><td>Cat.: 172-1806</td><td>Inmunofluorescencia antidoby</td></tr><tr><td>HBSS - Solución salina equilibrada de Hank</td><td>Gibco</td><td>Cat: 14175079</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: H4034</td><td>Suplemento de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Tampón de fijación IC Invitrogen</td><td></td><td>Cat: 00-8222-49</td><td>Fijación celular para citometría de flujo</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Modelo: ECLIPSE TS100</td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Crist&aacute; lia</td><td>Cat: 21.2665</td><td>Anestésico inhalado</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Synth Cat</td><td>: 01A1085.01.BJ</td><td>Fijación para Inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Micro espátula</td><td>ABC inoxidable</td><td>Inservible</td><td>Material quirúrgico</td></tr><tr><td>Microtubo 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>Cat: MCT-150-C</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal (mAb) 2C2 anti-Ssp-4</td><td>No comercial</td><td>No comercial</td><td>Inmunofluorescencia antidoby</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (p200)</td><td>Corning</td><td>Cat: 751630124</td><td>Reactivos de pipeta</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>Versión 4.0</td><td>Adquisición y análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Leche descremada</td><td>Nestl&eacute;</td><td>Cat: 9442405</td><td>Solución bloqueante para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Incubadora agitadora orbital</td><td>ThermoScientific</td><td>Modelo: 481 Gato: 11</td><td>Disociar la microglía de los astrocitos</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Gato: P6148</td><td>Fijación para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>PBS</td> No <td>comercial</td><td>No comercial</td><td>Tampón neutro</td></tr><tr><td>Penicilina G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P-7794</td><td>Suplemento de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Tampón de permeabilización (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8333-56</td><td>Permeabilización celular para citometría de flujo</td></tr><tr><td>Placa de Petri 60 mm x 15 mm (Desechable, estéril)</td><td>Prolab</td><td>Cat: 0303-8</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>Calibrar solución de pH</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Gibco</td><td>Gato: 31800-014</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>ABC inoxidable</td><td>Cat: LO9-W4</td><td>Material quirúrgico</td></tr><tr><td>Pipeta serológica 10 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4101</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Pipeta serológica 5 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4051</td><td>Material plástico</td></tr><tr><td>Pipeta monocanal (p1000)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123602</td><td>Reactivos de pipeta</td></tr><tr><td>individuales Pipeta de canal (p200)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123601</td><td>Reactivos de pipeta</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S6297</td><td>Suplemento de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Sal de sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S9137</td><td>Suplemento de medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: T9284</td><td>Permeabilización para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>Cat: 27250-018</td><td>Pinzas de enzima digestiva</td></tr><tr><td></td><td>ABC inoxidable</td><td>Cat: L28-P4-172</td><td>Material quirúrgico</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Novatecnica</td><td>Modelo: 09020095</td><td>Tejido Digeste a 37 &deg; C con tripsina</td></tr></tbody></table>

aislamiento concomitante de astrocitos primarios y microglia para la infección por parásitos protozoos

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Los astrocitos y la microglia son las células gliales más abundantes. Son responsables del apoyo fisiológico y el mantenimiento de la homeostasis en el sistema nervioso central (SNC). Las crecientes evidencias de su participación en el control de enfermedades infecciosas justifican el interés emergente en la mejora de metodologías para aislar los astrocitos primarios y la microglia con el fin de evaluar sus respuestas a las infecciones que afectan al SNC. Teniendo en cuenta el impacto de la infección Trypanosoma cruzi (T. cruzi) y Toxoplasma gondii (T. gondii) en el SNC, aquí proporcionamos un método para extraer, mantener, disociar e infectar astrocitos murinos y células microglia con parásitos protozoos. Las células extraídas de cortices recién nacidos se mantienen in vitro durante 14 días con reemplazo diferencial periódico de medios. Los astrocitos y la microglia se obtienen del mismo protocolo de extracción por disociación mecánica. Después de fenotiar por citometría de flujo, las células se infectan con parásitos protozoos. La tasa de infección se determina mediante microscopía de fluorescencia en diferentes momentos, lo que permite la evaluación de la capacidad diferencial de las células gliales para controlar la invasión y replicación protozoaria. Estas técnicas representan métodos simples, baratos y eficientes para estudiar las respuestas de los astrocitos y la microglia a las infecciones, abriendo el campo para un análisis de neuroinmunología.

En eldía 14, el cultivo de células gliales(Figura 1A)sufrió disociación mecánica. Las poblaciones de células aisladas fueron analizadas por citometría de flujo según los marcadores CD11b, CD45 y GFAP. Podríamos observar una pureza del 89,5% para la población de astrocitos y del 96,6% para la población de microglia(Figura 1B). Después del aislamiento, las células fueron chapadas en una placa plana de 96 pocillos y desp...

El objetivo general de este protocolo es instruir cómo extraer, mantener y disociar las células de astrocitos murinoy y microglia del sistema nervioso central, seguida de una infección con parásitos protozoos.

Aislamiento concomitante de astrocitos primarios y microglia para la infección por parásitos protozoos

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Este protocolo describe un método que se centra en extraer en paralelo las dos poblaciones de células gliales más abundantes, astrocitos y microglia, de ratones postnatales. Nuestro método se diferencia de otros protocolos previamente descritos para el aislamiento de astrocitos y microglia porque nos centramos en obtener y aislar ambos tipos celulares en la misma extracción en la misma condición, optimizando así el uso de animales experimentales y mejorando el estudio de roles relativos para estas células en contextos inmunológicos. Este protocolo puede ser útil para investigar mejor los roles de microglia y astrocitos en muchos contextos y enfermedades en el sistema nervioso central como el Alzheimer, el Parkinson y las infecciones por ejemplo protozoos parásitos o virus.Es deseable obtener y aislar ambos tipos de células de la misma extracción para evaluar el papel comparativo de cada subconjunto celular de contextos inmunológicos como la infección o la inflamación. La gente debe tener cuidado especialmente durante la extirpación del cerebro y lavados de tejido nervioso, pero creo que con este protocolo y la toma de vídeo, la gente no tendrá problemas. Este protocolo puede ser largo dependiendo del número de animales para extraer los cortices así que prepárate para pasar unas cuatro horas o más.En el primer día, prepare HBSS y HBSS puros más 10% FBS inactivados por calor. Prepare DMEM F12 suplementado y filtre con un filtro de 0,22 micras. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un autoclave y utilice 70% de etanol durante el procedimiento.Poner ratones recién nacidos en una cámara sellada que contenga algodón empapado con isoflurano durante cinco minutos para anestesia profunda. Rocía el cachorro de ratón con 70%etanol y decapita al animal con tijeras. Haz un corte sagital con tijeras a lo largo del cráneo para abrirlo y exponer el cerebro.Retire el cerebro usando una micro espátula para mantener la integridad cerebral. Coloque el cerebro en un plato seco de seis centímetros de diámetro. Con una micro espátula, retire el bulbo olfativo y el cerebelo.Mueva la corteza a otra placa de Petri que contenga dos mililitros de HBSS más 10%FBS. Cortar el tejido cerebral en trozos pequeños con tijeras estériles y usando una micropipeta P1000, transferir cada tejido cerebral con HBSS más 10%FBS a diferentes tubos cónicos de 15 mililitros. Si es necesario, utilice HBSS más 10%FBS para llenar el volumen final a dos mililitros.Lave el tejido cerebral cortado con tres mililitros de HBSS más 10%FBS para cada tubo. Después de la decantación, retire cuidadosamente el sobrenadante. Repita el lavado con HBSS más 10%FBS tres veces más.A continuación, lave con tres mililitros de HBSS puro tres veces. Después de la decantación, retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, agregue tres mililitros de trippsina y coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 minutos agitando suavemente los tubos cada cinco minutos.Esto digiere el tejido recogido. Evita las burbujas. Para inactivar la tripina, lave el tejido con tres mililitros de HBSS más 10%FBS y después de la decantación del tejido, retire cuidadosamente el sobrenadante.Repita este lavado tres veces. A continuación, lave el tejido con tres mililitros de HBSS puro y repita dos veces adicionales. Después de la decantación del tejido, retire cuidadosamente el sobrenadante.Añadir siete mililitros de HBSS puro y homogeneizar el tejido a través de pasajes sucesivos en pipetas, primero con una pipeta serológica de 10 mililitros, seguida de una pipeta de cinco mililitros, y finalmente con una micropipeta P1000. Después de la homogeneización, centrifugar los tubos a 450 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet con cuatro mililitros de HBSS más 10%FBS para cada tubo.Transfiera las células a un matraz T75 pretratado comercialmente para una adhesión óptima al cultivo celular. Coloque el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados al 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos para su adherencia. A continuación, añadir 10 mililitros de DMEM F12 suplementado al matraz e incubar a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante dos noches.En el tercer día, retire siete mililitros de medio de cultivo del matraz T75 y agregue siete mililitros de DMEM F12 con suplemento fresco. Devuelva el matraz a la incubadora. En el día cinco, para eliminar escombros y células no adherentes, cambie todo el medio del matraz T75 con 14 mililitros de DMEM F12 fresco suplementado.Luego, cada 48 horas, retire seis mililitros del sobrenadante y agregue siete mililitros de nuevo suplemento DMEM F12 medio hasta el día 14 de cultivo. En el día 14, después de retirar seis mililitros de sobrenadante y añadir siete mililitros de medio DMEM F12 fresco suplementado, cierre los matraces T75 firmemente con envoltura de plástico. Colóquelos en el agitador orbital del suelo a 200 RPM y 37 grados Celsius durante la noche para disociar mecánicamente la microglia de los astrocitos.El día 15, tome los matraces de la coctelera y lávelos vigorosamente con su propio medio para optimizar la disociación celular y cosechar el máximo número de microglia. A continuación, recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, añadir cuatro mililitros de trippsina a cada matraz e incubar durante cinco minutos a 37 grados Celsius con el fin de separar los astrocitos.A continuación, agregue cinco mililitros de DMEM F12 suplementado para inactivar la trippsina. Lave los frascos con su propio medio y transfiera el contenido a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar todos los tubos que contengan microglia disociada o astrocitos a 450 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet de microglia en un mililitro de DMEM F12 suplementado y los astrocitos en 10 mililitros de DMEM F12 suplementado. Proceda al conteo celular en una cámara Neubauer o en un contador automático de celdas.Placar las células con DMEM F12 suplementado en la densidad deseada en una placa de cultivo celular inferior plana pretratada. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para permitir que se adhieran. En el día 14, el cultivo celular glial se sometió a una disociación mecánica.Se observó con una pureza del 89,5% para la población de astrocitos y del 96,6% para la población de microglia. Los astrocitos y la microglia de los ratones C57BL6 se infectaron con T.cruzi Y.Después de dos horas, 48 horas y 96 horas, las cámaras se fijaron con metanol y se tiñeron con el marcador de nucleasa celular DAPI y anti-GFAP. El uso de parásitos modificados genéticamente que expresan reporteros fluorescentes o parásitos etiquetados con anticuerpos fluorescentes específicos mejoró la microscopía de inmunofluorescencia, ya que se distinguen mejor del núcleo celular.Aquí se presentan dos ejemplos. T.gondii RH cepa que expresa constitutivamente YFP y T.cruzi Y cepa teñida con anticuerpo monoclonal no comercial 2C2 anti-SSP4 proteína. Es importante lavar cuidadosamente las células para no perder ningún agregado celular.Después de la infección de las células gliales, se pueden evaluar otros parámetros como ELISA para la producción de citoquinas presente en el sobrenadante, la hinchazón occidental para la expresión de proteínas y la PCR cuantitativa en tiempo real para la evaluación de la transcripción del ARN. Muchas preguntas relacionadas con la función de las células gliales, por ejemplo su metabolismo, la respuesta inmunitaria y la biología celular en sí pueden ser abordadas y beneficiadas por esta técnica. Todos los parásitos protozoos son capaces de infectar las células humanas, así como las células del ratón de cultivo por lo que es importante tener cuidado al manejar este parásito.

concomitant-isolation-primary-astrocytes-microglia-for-protozoa

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Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

Las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSC) tienen potentes propiedades inmunomoduladoras útiles para tratar enfermedades asociadas con la inflamación. Demostramos cómo aislar y cultivar AdMSCs murinas y glía mixta primaria, estimular AdMSCs para que regulen al alza los genes antiinflamatorios y los factores de crecimiento, evaluar la migración de AdMSCs y co-cultivar AdMSCs con glia primaria infectada con priones mixtos.

Células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo cocultivadas con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Aprende a aislar astrocitos y microglia primarios de cortezas de ratón recién nacido para estudiar infecciones por protozoos en el SNC. Este método optimiza el uso de animales y permite análisis comparativos de respuestas inmunes.

Aislamiento concomitante de astrocitos primarios y microglia para la infección por parásitos protozoos

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