Aislamiento concomitante de astrocitos primarios y microglia para la infección por parásitos protozoos
18 de marzo de 2020
El objetivo general de este protocolo es instruir cómo extraer, mantener y disociar las células de astrocitos murinoy y microglia del sistema nervioso central, seguida de una infección con parásitos protozoos.
Este protocolo describe un método que se centra en extraer en paralelo las dos poblaciones de células gliales más abundantes, astrocitos y microglia, de ratones postnatales. Nuestro método se diferencia de otros protocolos previamente descritos para el aislamiento de astrocitos y microglia porque nos centramos en obtener y aislar ambos tipos celulares en la misma extracción en la misma condición, optimizando así el uso de animales experimentales y mejorando el estudio de roles relativos para estas células en contextos inmunológicos. Este protocolo puede ser útil para investigar mejor los roles de microglia y astrocitos en muchos contextos y enfermedades en el sistema nervioso central como el Alzheimer, el Parkinson y las infecciones por ejemplo protozoos parásitos o virus.
Es deseable obtener y aislar ambos tipos de células de la misma extracción para evaluar el papel comparativo de cada subconjunto celular de contextos inmunológicos como la infección o la inflamación. La gente debe tener cuidado especialmente durante la extirpación del cerebro y lavados de tejido nervioso, pero creo que con este protocolo y la toma de vídeo, la gente no tendrá problemas. Este protocolo puede ser largo dependiendo del número de animales para extraer los cortices así que prepárate para pasar unas cuatro horas o más.
En el primer día, prepare HBSS y HBSS puros más 10% FBS inactivados por calor. Prepare DMEM F12 suplementado y filtre con un filtro de 0,22 micras. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un autoclave y utilice 70% de etanol durante el procedimiento.
Poner ratones recién nacidos en una cámara sellada que contenga algodón empapado con isoflurano durante cinco minutos para anestesia profunda. Rocía el cachorro de ratón con 70%etanol y decapita al animal con tijeras. Haz un corte sagital con tijeras a lo largo del cráneo para abrirlo y exponer el cerebro.
Retire el cerebro usando una micro espátula para mantener la integridad cerebral. Coloque el cerebro en un plato seco de seis centímetros de diámetro. Con una micro espátula, retire el bulbo olfativo y el cerebelo.
Mueva la corteza a otra placa de Petri que contenga dos mililitros de HBSS más 10%FBS. Cortar el tejido cerebral en trozos pequeños con tijeras estériles y usando una micropipeta P1000, transferir cada tejido cerebral con HBSS más 10%FBS a diferentes tubos cónicos de 15 mililitros. Si es necesario, utilice HBSS más 10%FBS para llenar el volumen final a dos mililitros.
Lave el tejido cerebral cortado con tres mililitros de HBSS más 10%FBS para cada tubo. Después de la decantación, retire cuidadosamente el sobrenadante. Repita el lavado con HBSS más 10%FBS tres veces más.
A continuación, lave con tres mililitros de HBSS puro tres veces. Después de la decantación, retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, agregue tres mililitros de trippsina y coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 minutos agitando suavemente los tubos cada cinco minutos.
Esto digiere el tejido recogido. Evita las burbujas. Para inactivar la tripina, lave el tejido con tres mililitros de HBSS más 10%FBS y después de la decantación del tejido, retire cuidadosamente el sobrenadante.
Repita este lavado tres veces. A continuación, lave el tejido con tres mililitros de HBSS puro y repita dos veces adicionales. Después de la decantación del tejido, retire cuidadosamente el sobrenadante.
Añadir siete mililitros de HBSS puro y homogeneizar el tejido a través de pasajes sucesivos en pipetas, primero con una pipeta serológica de 10 mililitros, seguida de una pipeta de cinco mililitros, y finalmente con una micropipeta P1000. Después de la homogeneización, centrifugar los tubos a 450 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet con cuatro mililitros de HBSS más 10%FBS para cada tubo.
Transfiera las células a un matraz T75 pretratado comercialmente para una adhesión óptima al cultivo celular. Coloque el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados al 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos para su adherencia. A continuación, añadir 10 mililitros de DMEM F12 suplementado al matraz e incubar a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante dos noches.
En el tercer día, retire siete mililitros de medio de cultivo del matraz T75 y agregue siete mililitros de DMEM F12 con suplemento fresco. Devuelva el matraz a la incubadora. En el día cinco, para eliminar escombros y células no adherentes, cambie todo el medio del matraz T75 con 14 mililitros de DMEM F12 fresco suplementado.
Luego, cada 48 horas, retire seis mililitros del sobrenadante y agregue siete mililitros de nuevo suplemento DMEM F12 medio hasta el día 14 de cultivo. En el día 14, después de retirar seis mililitros de sobrenadante y añadir siete mililitros de medio DMEM F12 fresco suplementado, cierre los matraces T75 firmemente con envoltura de plástico. Colóquelos en el agitador orbital del suelo a 200 RPM y 37 grados Celsius durante la noche para disociar mecánicamente la microglia de los astrocitos.
El día 15, tome los matraces de la coctelera y lávelos vigorosamente con su propio medio para optimizar la disociación celular y cosechar el máximo número de microglia. A continuación, recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, añadir cuatro mililitros de trippsina a cada matraz e incubar durante cinco minutos a 37 grados Celsius con el fin de separar los astrocitos.
A continuación, agregue cinco mililitros de DMEM F12 suplementado para inactivar la trippsina. Lave los frascos con su propio medio y transfiera el contenido a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar todos los tubos que contengan microglia disociada o astrocitos a 450 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet de microglia en un mililitro de DMEM F12 suplementado y los astrocitos en 10 mililitros de DMEM F12 suplementado. Proceda al conteo celular en una cámara Neubauer o en un contador automático de celdas.
Placar las células con DMEM F12 suplementado en la densidad deseada en una placa de cultivo celular inferior plana pretratada. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para permitir que se adhieran. En el día 14, el cultivo celular glial se sometió a una disociación mecánica.
Se observó con una pureza del 89,5% para la población de astrocitos y del 96,6% para la población de microglia. Los astrocitos y la microglia de los ratones C57BL6 se infectaron con T.cruzi Y.Después de dos horas, 48 horas y 96 horas, las cámaras se fijaron con metanol y se tiñeron con el marcador de nucleasa celular DAPI y anti-GFAP. El uso de parásitos modificados genéticamente que expresan reporteros fluorescentes o parásitos etiquetados con anticuerpos fluorescentes específicos mejoró la microscopía de inmunofluorescencia, ya que se distinguen mejor del núcleo celular.
Aquí se presentan dos ejemplos. T.gondii RH cepa que expresa constitutivamente YFP y T.cruzi Y cepa teñida con anticuerpo monoclonal no comercial 2C2 anti-SSP4 proteína. Es importante lavar cuidadosamente las células para no perder ningún agregado celular.
Después de la infección de las células gliales, se pueden evaluar otros parámetros como ELISA para la producción de citoquinas presente en el sobrenadante, la hinchazón occidental para la expresión de proteínas y la PCR cuantitativa en tiempo real para la evaluación de la transcripción del ARN. Muchas preguntas relacionadas con la función de las células gliales, por ejemplo su metabolismo, la respuesta inmunitaria y la biología celular en sí pueden ser abordadas y beneficiadas por esta técnica. Todos los parásitos protozoos son capaces de infectar las células humanas, así como las células del ratón de cultivo por lo que es importante tener cuidado al manejar este parásito.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para la extracción, cultivo e infección paralelas de astrocitos y microglía murinos primarios a partir de cortezas de ratones recién nacidos. El método permite a los investigadores obtener ambos tipos de células gliales a partir de la misma extracción, facilitando estudios comparativos sobre sus funciones en infecciones del sistema nervioso central (SNC), particularmente con parásitos protozoarios como Trypanosoma cruzi y Toxoplasma gondii. El protocolo incluye pasos para el aislamiento celular, mantenimiento del cultivo, fenotipificación, infección y análisis de las tasas de infección mediante microscopía de fluorescencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neuroinmunología
- Biología celular
- Parasitología
Antecedentes
- Los astrocitos y la microglía son las células gliales más abundantes en el SNC, esenciales para el soporte fisiológico y la homeostasis.
- Ambos tipos celulares desempeñan funciones importantes en la respuesta inmunitaria frente a infecciones del SNC.
- Se necesitan métodos mejorados para aislar y estudiar estas células con el fin de comprender mejor sus respuestas frente a patógenos.
- Las infecciones protozoarias, como las causadas por T. cruzi y T. gondii, pueden afectar significativamente la función del SNC.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo reproducible y eficiente para la extracción y cultivo simultáneos de astrocitos y microglía a partir de cortezas de ratón.
- Permitir estudios comparativos de las respuestas de las células gliales a infecciones protozoarias.
- Facilitar análisis posteriores de la función de las células gliales durante la infección.
Métodos Utilizados
- Extracción de cortezas de ratones recién nacidos en condiciones estériles.
- Disociación enzimática y mecánica del tejido cerebral para obtener suspensiones de células individuales.
- Cultivo in vitro de células gliales con reemplazo periódico del medio durante 14 días.
- Disociación mecánica para separar microglía de astrocitos.
- Fenotipificación de poblaciones celulares mediante citometría de flujo.
- Infección de células cultivadas con parásitos T. cruzi y T. gondii.
- Evaluación de las tasas de infección mediante microscopía de fluorescencia con parásitos modificados genéticamente o marcados con anticuerpos.
Resultados principales
- El protocolo produce poblaciones de alta pureza: aproximadamente 89,5 % de astrocitos y 96,6 % de microglía.
- Ambos tipos celulares pueden infectarse eficientemente con parásitos protozoarios in vitro.
- La microscopía de fluorescencia permite la visualización y cuantificación claras de las tasas de infección en múltiples puntos temporales.
- El método permite análisis adicionales, como ELISA, inmunotransferencia (Western blot) y qPCR, para estudios funcionales.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un enfoque sencillo, rentable y eficiente para aislar y estudiar astrocitos y microglía murinos primarios.
- Permite la comparación directa de las respuestas de las células gliales a infecciones del SNC.
- La técnica abre nuevas vías para la investigación neuroinmunológica sobre la función de las células gliales durante infecciones y enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite a los equipos de I+D de biofármacos aislar simultáneamente astrocitos primarios y microglía de cortezas murinas, facilitando el análisis comparativo de células gliales en modelos de infección del sistema nervioso central. Al optimizar el uso de animales y proporcionar un procedimiento estandarizado para fenotipado e infección, el método mejora la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación de neuroinmunología y enfermedades infecciosas. El enfoque apoya los esfuerzos iniciales de descubrimiento centrados en el control de patógenos mediado por células gliales y en las interacciones huésped-patógeno.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las respuestas de las células gliales a parásitos protozoarios como T. cruzi y T. gondii para aclarar los mecanismos patógenos en infecciones del sistema nervioso central.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos al permitir la comparación directa de las tasas de infección de astrocitos y microglía, así como del control del parásito.
- Confianza predictiva: Facilita la selección fenotípica de respuestas inmunitarias mediadas por células gliales para reducir el riesgo de objetivos en programas contra enfermedades neurodegenerativas e infecciosas.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayos: Genera poblaciones purificadas de células gliales con una pureza de >89% en astrocitos y >96% en microglía, lo que permite ensayos de infección reproducibles.
- Resultados cuantitativos: Permite la cuantificación de la tasa de infección mediante microscopía de fluorescencia en múltiples puntos temporales para análisis dependientes de la dosis y del tiempo.
- Escalabilidad: Utiliza equipos y reactivos de cultivo celular estándar, lo que permite su adaptación a formatos de placas multipocillo para cribado de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Sistema relevante para la enfermedad: Proporciona un modelo de células gliales murinas para estudiar infecciones protozoarias relevantes para el sistema nervioso central, con aplicabilidad traslacional a condiciones neuroinflamatorias humanas.
- Reducción mecanicista de riesgos: Permite evaluar la contribución de las células gliales en la eliminación del patógeno, favoreciendo el descubrimiento de biomarcadores y el análisis de vías moleculares.
- Continuidad preclínica: Permite el seguimiento longitudinal de la infección desde 2 hasta 96 horas, alineándose con las ventanas de evaluación preclínica de candidatos terapéuticos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar células gliales validadas para la modelización de infecciones, el desarrollo de ensayos y estudios mecanicistas antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los roles específicos de las células gliales en la invasión y replicación de patógenos dentro del sistema nervioso central.
- Selección: Proporciona células gliales estandarizadas y fenotipadas, listas para ensayos de infección con parásitos marcados con fluorescencia o con anticuerpos.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa de la tasa de infección mediante microscopía de fluorescencia y el análisis posterior de la expresión de citoquinas, proteínas y ARN.
- Investigación Traducional: Relaciona las respuestas de infección glial con mecanismos neuroinmunitarios más amplios, relevantes para modelos preclínicos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de aislamiento de células gliales aplicable en programas de enfermedades virales, parasitarias y neurodegenerativas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la función de las células gliales durante la infección al permitir la comparación directa de astrocitos y microglía procedentes del mismo animal.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante un protocolo unificado de extracción que minimiza la variabilidad entre animales.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar un enfoque al proporcionar datos predictivos tempranos sobre el control del patógeno mediado por células gliales en modelos de infección del sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en la respuesta de las células gliales ante un desafío con protozoos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección de tejidos aséptica, digestión enzimática y técnicas de disociación mecánica.
- Depende del acceso a centrífugas, incubadoras, agitadores orbitales y microscopía de fluorescencia para la cuantificación de infecciones.
- Necesita la estandarización de los cambios de medio, pasos de lavado y tiempos de disociación entre lotes para obtener rendimientos consistentes de células gliales.
- Implica consideraciones de adaptación al extender el protocolo a otros subtipos de células gliales o modelos de enfermedades distintos a la infección por protozoos.
- Está limitado por la línea temporal de cultivo de 14 días y el paso de disociación mecánica, lo cual podría afectar la escalabilidad para aplicaciones de alto rendimiento.
