Análisis de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica mediante travesía microbiana a través de células endoteliales microvasculares
14 de febrero de 2020
La barrera hematoencefálica humana previene selectivamente la penetración de moléculas hidrófilas y patógenos en el cerebro. Varias patologías, incluyendo meningitis y delirio postoperatorio, se asocian con una mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Aquí, describimos un modelo de cultivo celular endotelial para probar la permeabilidad de barrera por travesía microbiana.
Este método permite analizar la barrera hematoencefálica humana midiendo el traversal bacteriano en diferentes tratamientos. Puede ayudar a descubrir la patogénesis de la meningitis bacteriana y delirio postoperatorio. Es un método sencillo y los efectos del tratamiento están representados directamente por el número de bacterias.
Se puede modificar para permitir un análisis de alto rendimiento de compuestos en las células endoteliales. Comience por ensamblar la placa de 12 pozos en un armario de seguridad biológica. Desembale la placa y cada plaquita, luego use fórceps esterilizados para agarrar las plaquitas en su base y ponerlas en los pozos.
Recubrir la membrana porosa de cada plaquita con 90 microlitros de 10 microgramos por microlitro colágeno IV y mezcla de fibronectina e incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius durante 24 horas. Después de la incubación, lave las plaquitas dos veces pipeteando un mililitro de PBS en cada plaquita y aspirando con una bomba de vacío. A continuación, equilibre las membranas pipeteando el medio DMEM F12 precalentado en las cámaras superior e inferior e incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Para sembrar las células endoteliales microvasculares humanas, aspirar el medio del matraz de cultivo celular y lavar las células con 10 mililitros de PBS. Cubra las células completamente con cinco mililitros de trippsina EDTA e incubar el matraz durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Transfiera cinco mililitros de las células a un tubo de 15 mililitros y agregue cinco mililitros de FCS que contengan un medio para detener la reacción enzimática.
Centrifugar la suspensión durante tres minutos a 210 veces g, quitar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en cinco mililitros de medio. Añadir 10 microlitros de la suspensión celular a 10 microlitros de 0.4%trypan mancha azul, luego añadir 10 microlitros de la mezcla a una cámara de conteo. Coloque la cámara de conteo en el contador de celdas e inicie el programa adecuado asegurándose de que el contador esté enfocado.
Después de contar, sembrar 200.000 células en cada cámara superior en la placa de 12 pozos e incubar la placa a 37 grados Cent celsius durante 14 días cambiando los medios en la cámara superior e inferior cada dos a tres días. Después de 14 días, asegúrese de que la confluencia celular sea 100% mediante imágenes con un microscopio. Un día antes de la medición de la permeabilidad, poner una colonia de cepa de E.coli GM2163 en tres mililitros de medio LB.
Cultivo de las células a 37 grados Celsius durante 24 horas en un agitador de incubación. Para tratar las células con un compuesto de interés, diluirla a su concentración final en el medio DMEM F12 y añadir esta mezcla en las cámaras superior e inferior en la placa de 12 pozos, luego incubar la placa en una incubadora de cultivo celular. Después de la incubación, cambie el medio completo por medio libre de antibióticos.
Determinar la concentración del cultivo bacteriano durante la noche midiendo su densidad óptica a 600 nanómetros, luego diluirlo a un OD600 de 0.5 en un tubo Falcon de 50 mililitros. En un gabinete de seguridad biológica, agregue 450 microlitros de la solución bacteriana en cada cámara superior de la placa de 12 pozos, luego incubar la placa durante seis horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire el inserto con fórceps y muestree 50 microlitros del medio de cada cámara inferior teniendo cuidado de no derramar el medio de las cámaras superiores en las inferiores.
Es importante separar estrictamente los medios de la cámara superior e inferior, ya que un derrame de bacterias de la cámara superior conduciría a resultados falsos positivos. Suelte cada muestra en una placa de agar separada y raye la solución con un esparcidor celular. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas, luego contar las colonias.
Para investigar el efecto de la glicación en el traversal microbiano a través de la barrera hematoencefálica, las células se trataron con una solución de glioxal de 0,5 y 0,15 mililitrolares durante una hora con células no tratadas que sirven como control. La glicación se detectó entonces a través de inmunoblotting con anticuerpos anti-AGE. Las colonias bacterianas obtenidas fueron contadas y representadas como el número absoluto de colonias o el número relativo de colonias normalizadas al control.
Las muestras tratadas con glioxal mostraron un mayor número de colonias que indicaron que el tratamiento tiene un efecto sobre la densidad de la barrera celular. Para investigar la glicación proteica inducida por glucosa, se cultivaron THBMECs en glucosa normal y medio de glucosa alto. El número absoluto de colonias y el número relativo de colonias normalizadas al control indicaron que la glucosa no tuvo ningún efecto significativo en la integridad de la barrera hematoencefálica.
Las células endoteliales tratadas se pueden analizar más a fondo mediante enfoques proteómicos, por ejemplo espectrometría de masas, para analizar los cambios en el proteomo. Esta técnica ayuda a entender la barrera hematoencefálica humana y el travesancia bacteriana. Se puede utilizar para descubrir aspectos del envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer.
Descripción general
Este estudio presenta un método para analizar la barrera hematoencefálica humana (BHE) mediante la medición del tránsito bacteriano bajo diversos tratamientos. Tiene como objetivo mejorar la comprensión de afecciones como la meningitis bacteriana y el delirio posoperatorio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Microbiología
Antecedentes
- La BHE restringe selectivamente la entrada de moléculas hidrófilas y patógenos al cerebro.
- El aumento de la permeabilidad de la BHE está relacionado con diversas patologías.
- Comprender la permeabilidad de la BHE puede ayudar a descubrir la patogénesis de ciertas enfermedades.
- Los modelos de cultivo de células endoteliales son esenciales para estudiar las propiedades de la BHE.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo confiable para evaluar la permeabilidad de la BHE.
- Investigar los efectos de los tratamientos sobre el tránsito microbiano.
- Explorar las implicaciones para enfermedades asociadas con disfunción de la BHE.
Métodos Utilizados
- Recubrimiento de insertos con colágeno IV y fibronectina para cultivo celular.
- Siembra de células endoteliales microvasculares humanas y mantenimiento durante 14 días.
- Medición del tránsito bacteriano utilizando E. coli y análisis de los resultados mediante recuento de colonias.
- Estudio de los efectos de la glicación en el tránsito microbiano mediante tratamiento con glioxal.
Resultados principales
- El tratamiento con glioxal aumentó el número de colonias bacterianas, lo que indica una densidad de barrera alterada.
- Las condiciones de alta glucosa no afectaron significativamente la integridad de la BHE.
- Los enfoques de proteómica pueden analizar más a fondo las células endoteliales tratadas.
- El método permite el análisis de alto rendimiento de compuestos que afectan la BHE.
Conclusiones
- El modelo desarrollado es eficaz para estudiar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la patogénesis de las enfermedades neurológicas.
- Investigaciones futuras pueden utilizar este método para explorar el envejecimiento y las afecciones neurodegenerativas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la evaluación cuantitativa de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica mediante la travesía microbiana, proporcionando una lectura funcional para la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos para el SNC. Al vincular la integridad de la barrera con fenotipos relevantes para la enfermedad, como meningitis y delirio, apoya la reducción mecanicista de riesgos en hipótesis terapéuticas. El formato del ensayo permite el cribado de compuestos que modulan la función de la barrera endotelial, lo que contribuye a la identificación de compuestos líder y a la confianza predictiva en modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas relacionadas con la permeabilidad de la barrera y los mecanismos de travesía de patógenos.
- Valor operativo: Proporciona una lectura cuantitativa basada en el recuento de colonias para la validación funcional de objetivos.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar compuestos que modifican la densidad de la barrera con relevancia para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor Científico: Genera sistemas biológicos validados para el cribado de compuestos y la evaluación de permeabilidad posteriores.
- Valor Operativo: Permite la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante un cultivo definido de células endoteliales sobre colágeno IV/fibronectina.
- Escalabilidad: Permite el análisis de alto rendimiento de los efectos de compuestos sobre células endoteliales, como se indica en el protocolo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia traslacional: Modela el paso microbiano asociado a patologías como la meningitis, permitiendo la evaluación de sistemas con relevancia para la enfermedad.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite analizar factores celulares endógenos y los efectos de la glucosilación sobre la integridad de la barrera.
- Continuidad preclínica: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de la permeabilidad in vitro con la patogénesis in vivo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El ensayo se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y la evaluación preclínica, especialmente para terapéuticos dirigidos al sistema nervioso central, donde la penetración de barreras es un parámetro crítico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función de barrera y la aclaración de vías mediante modelos de glucosilación y tratamiento con glucosa.
- Selección: Ofrece preparación para ensayos y resultados cuantitativos para evaluar los efectos de compuestos sobre la permeabilidad endotelial.
- Análisis: Proporciona variables dependientes mensurables (recuentos de colonias) que permiten comparaciones entre diferentes condiciones de tratamiento.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización del tránsito bacteriano relevante para infecciones y procesos inflamatorios neurológicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar la modulación de la BHE en múltiples bibliotecas de compuestos y modelos de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la función de barrera.
- Valor operativo: Garantiza estandarización, reproducibilidad y escalabilidad mediante el cultivo celular definido y la medición del tránsito.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al identificar compuestos moduladores de la barrera en fases tempranas, reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo basada en perfiles de permeabilidad de la BHE vinculados a mecanismos de enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, técnica estéril y manipulación microbiana dentro de una cabina de seguridad biológica.
- Depende de instrumentación para el conteo celular, incubación y cuantificación de colonias.
- Necesita estandarización entre equipos en los flujos de trabajo de biología y microbiología para prevenir artefactos de contaminación cruzada.
- Requiere consideraciones de adaptación al extenderse a otras cepas bacterianas o modelos patógenos.
- Las limitaciones prácticas incluyen la ventana de incubación de seis horas y la necesidad de separación estricta de cámaras para evitar falsos positivos.
