Name: Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprende a detectar supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales usando Nicotiana bethamiana. Este método de cribado rápido y preciso facilita el estudio de las interacciones planta-patógeno.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del "Programa Shuguang" de la Fundación para el Desarrollo Educativo de Shanghái y la Comisión Municipal de Educación de Shanghái, el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China Programa Nacional de I+D Clave de China ( 2018YFD0201500), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.o 31571696 y 31660510), el Programa de Mil Talentos para Jóvenes Profesionales de China, y la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (18DZ2260500).

NOTA: Todos los pasos del procedimiento deben realizarse a temperatura ambiente (RT).
ADVERTENCIA: Depositar todos los medios que contengan microbios patógenos, así como las plantas y el tejido vegetal utilizados en el ensayo, en los contenedores de residuos y autoclave apropiados antes de desechar.
1. Preparación de construcciones de plásmidos que contengan efectos putativos
<ol><li>Seleccione los efectores secretos putativos que están altamente expresados durante la infección, según lo determinado por la secuenciación de ARN (RNA-Seq), y más por la técnica cuantitativa de PCR en tiempo real (qRT-PCR).</li>
	<li>Determinar el sitio de escisión del péptido de señal de cada efector utilizando una herramienta de software como SignalP18.</li>
	<li>Diseñar imprimaciones y realizar PCR para amplificar el gen que codifica el efector de interés utilizando polimerasa de ADN de alta fidelidad. Realice la electroforesis de gel de agarosa para comprobar el producto PCR, luego clone el amplificador en el vector de entrada Gateway pQBV3 utilizando el kit de clonación libre de ligaduras (Tabla de materiales), y posteriormente en el vector de expresión de destino pEG100 utilizando la reacción de recombinación LR19.</li>
	<li>Transformar 3 x 5 l de mezcla de reacción LR en 100 l de células competentes de E. coli (p. ej., TOP10, DH5, esparcir las células bacterianas transformadas en el medio de agar Luria-Bertani (LB) complementado con canamicina de 50 g/ml e incubar a 37 oC durante 16 x 20 h. NOTA: Los transformadores positivos pueden ser identificados por la colonia PCR20 y analizados más por mini-preparación y secuenciación plásmidos.</li>
	<li>Introducir 50 a 100 ng de plásmidos recombinantes que transportan proteína efector en 100 ml de células A. tumefaciens químicamente competentes (p. ej., GV3101 o C58C1), mezclar suavemente y luego congelar en nitrógeno líquido durante 1 min. Descongelar las células en un baño de agua de 37 oC durante 5 min.</li>
	<li>Añadir 500 éL de caldo lb e incubar a 30 oC durante 4 x 6 h con un suave temblor, y luego transferir y esparcir todas las células agrobacterianas en el medio de agar LB complementado con kanamicina de 50 g/ml y rifampicina de 50 g/ml a 30 oC durante 2 días. NOTA: Los clones positivos pueden ser verificados por la PCR de colonia.</li>
	<li>Utilice una sola colonia transformada para experimentos de agroinfiltración a menos que se indique lo contrario. NOTA: En la presente investigación, ninguno de los genes efectores probados contenía intrones predichas; cada uno de los genes se amplificó directamente a partir del ADN genómico de un aislado de Phytophthora sojae. Se recomienda un vector de expresión de planta gateway sin ninguna etiqueta, pero no es necesario.</li>
</ol>2. Preparación de plantas de N. benthamiana 16c
<ol><li>Preparar mezclas de tierra de maceta que consisten en (por volumen) 50% musgo de turba, 30% perlita, y 20% vermiculita, y autoclave a 120 oC durante 20 min.</li>
	<li>Remoje las mezclas de suelo autoclavedas con la solución de fertilizante vegetal (1 g/L) y subempaquetelas en macetas más pequeñas (80 mm x 80 mm x 75 mm) almacenadas en una bandeja más grande (540 mm x 285 mm x 60 mm).</li>
	<li>Sembrar una o dos semillas de N. benthamiana 16c sobre la superficie del suelo de cada maceta. Cubra la bandeja con una cúpula de plástico y deje que las semillas germinen.</li>
	<li>Coloque la bandeja bajo cámaras de crecimiento de luz y temperatura controlada con una temperatura de 23 a 25 oC, una humedad relativa del 50 a 60 % y un fotoperiodo de día largo (14 h de luz/10 h de oscuridad, con iluminación de 130 a 150 oC-2s-1).</li>
	<li>Quítese la cúpula de plástico después de que las semillas germinen (3 x 4 días) y permita que las plántulas crezcan en las mismas condiciones utilizadas para el paso de germinación.</li>
	<li>Añadir una cantidad adecuada de agua, manteniendo el suelo húmedo pero no empapado, cada 2 x 3 días; añadir fertilizante cada 10 días para promover un mayor crecimiento. Mantener las plantas de N. benthamiana 16c en condiciones normales hasta que estén listas para su uso; en esta etapa la planta debe tener al menos cinco hojas verdaderas completamente desarrolladas y no visible axilar o brotes de flores, y las hojas deben tener un aspecto verde saludable).</li>
	<li>Utilice hojas de 3 a 4 semanas de n. benthamiana 16c para ensayos locales de silenciamiento de ARN, y plantas jóvenes de N. benthamiana 16c (10-14 días de edad) para ensayos sistémicos de silenciamiento de ARN. NOTA: Las condiciones e instalaciones de crecimiento de las plantas varían según los laboratorios; elegir hojas sanas, bien desarrolladas y completamente expandidas para la infiltración.</li>
</ol>3. Preparación del cultivo de Agrobacterium para la infiltración
<ol><li>Escoge una colonia positiva de la placa LB e inocula las células en un tubo de vidrio que contiene 5 ml de medio LB complementado con kanamicina de 50 g/ml y rifampicina de 50 g/ml. Cultivar las células a 30 oC con agitación a 200 rpm durante 24 x 48 h.</li>
	<li>Transferir 100 l de cultivo a 5 ml de medio de LB suplementado con los mismos antibióticos, 10 mM 2-(N-morpholino) ácido etanosulfónico (MES; pH 5.6) y 20 m acetosyringone (AS). Cultivar bacterias a 30 oC con agitación a 200 rpm durante 16 x 20 h.</li>
	<li>Células centrífugas a 4.000 x g durante 10 min. Vierta el sobrenadante y resuspenda el pellet en 2 ml de tampón MgCl2 de 10 mM.</li>
	<li>Repita el paso 3.3 para asegurar la eliminación completa de antibióticos.</li>
	<li>Determinar la densidad del cultivo de Agrobacterium midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD600). Ajustar a un OD600 de 1.5 x 2.0 con 10 mM MgCl2 tampón.</li>
	<li>Añadir 10 mM MES (pH 5.6) y 150 m AS a los cultivos de suspensión final e incubar las células a RT durante al menos 3 horas sin agitar. NOTA: No deje los cultivos de suspensión final durante la noche.</li>
</ol>4. Co-infiltración N. hojas de benthamiana
<ol><li>Mezclar volúmenes iguales de un cultivo de Agrobacterium que contiene 35S-GFP con un cultivo de Agrobacterium que contiene 35S- supresor de virus de mosaico de pepino 2b (CMV2b), efector putativo, o vector vacío (EV).</li>
	<li>Infíldese cuidadosamente y lentamente las suspensiones mixtas de agrobacterium en los lados abaxiales de las hojas de N. benthamiana 16c utilizando una jeringa sin aguja de 1 ml.</li>
	<li>Retire la suspensión bacteriana restante de las hojas con limpiaparabrisas de tejido blando y circule los márgenes de los parches infiltrados con una pluma de fabricante.</li>
	<li>Deje las plantas infiltradas en la cámara de crecimiento en las mismas condiciones de crecimiento. NOTA: Por razones de seguridad y salud, se deben usar gafas protectoras y una máscara durante la infiltración. Para evitar la contaminación cruzada, los guantes deben cambiarse o esterilizarse con etanol entre infiltraciones. Normalmente se necesita al menos 1 ml de suspensiones de agrobacterium por hoja para la infiltración. Para el silenciamiento sistémico, se requerirán al menos dos hojas para la infiltración.</li>
</ol>5. Análisis de imágenes GFP
<ol><li>Detectar visualmente la fluorescencia GFP en hojas recién cultivadas de plantas enteras 2 semanas después de la infiltración (para el silenciamiento sistémico del ARN) o parches infiltrados de hojas de 3 x 4 ppp utilizando una lámpara ultravioleta de onda larga (UV) sin colección de hojas.</li>
	<li>Fotografía recogida plantas y / o hojas separadas con una cámara digital equipada con filtros UV y amarillos. NOTA: Para los ensayos de supresión de silenciamiento local, investigue parches infiltrados de hojas de N. benthamiana 16c, mientras que para la actividad de supresión de silenciamiento sistémico, investigue las hojas recién cultivadas. La actividad de supresión del silenciamiento del ARN puede variar según los efectores individuales. Por lo tanto, observe los parches o hojas durante unos días a partir de 3 dpi. Utilice CMV2b y EV como controles positivos y negativos, respectivamente.</li>
</ol>6. Análisis de la mancha del norte de los niveles de ARNm de la PFP en las hojas infiltradas
<ol><li>Aislamiento del ARN total del tejido de la hoja utilizando el reactivo de aislamiento de ARN(Tabla de materiales)<ol>
<li>Recoger los tejidos de las hojas de parches infiltrados de N. benthamiana 16c a 4 x 7 dpi, pulverizar en nitrógeno líquido a un polvo fino, y transferir el polvo a un tubo estéril de 2 ml.</li>
		<li>Añadir el reactivo de aislamiento de ARN (1 ml/100 mg de tejido) inmediatamente al tubo muestreado en una campana, agitar vigorosamente para homogeneizar e incubar a RT durante 5 min.</li>
		<li>Añadir cloroformo (reactivo de aislamiento de ARN de 200 L/1 ml) a cada tubo de una campana, agitar vigorosamente durante 15 s e incubar a RT durante 5 min. Centrifuge el homogeneato a 12.000 x g durante 15 min a 4 oC.</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo libre de RNase y deseche el pellet. Añadir 0,7 volumen de isopropanol al sobrenadante, invertir suavemente varias veces e incubar la mezcla a RT durante 10 min.</li>
		<li>Precipitar el pellet de ARN por centrifugación a 12.000 x g durante 15 min a 4oC.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante, lave el pellet con 70% de etanol y seque al aire el pellet en una campana. Disolver el ARN en agua tratada con piropenato (DEPC) incubando en un baño de agua de 65 oC durante 10 a 20 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de la mancha del norte del nivel de ARNm de la FPG en las hojas infiltradas<ol>
<li>Preparar un gel de agarosa desnaturalante de formaldehdehida del 1,2% en 1 búfer de carrera MOPS.</li>
		<li>Mezclar el ARN 1:1 con el tinte de carga de ARN y la desnaturalidad por incubación a 65 oC durante 10 min, enfriar inmediatamente las muestras desnaturalizadas sobre hielo durante 1 min.</li>
		<li>Cargue las muestras en el gel y electroforrese a 100 V durante 50 minutos hasta que el ARN esté bien separado.</li>
		<li>Enjuague el gel en 20x tampón de citrato salino-sódico (SSC) para eliminar el formaldehído y transferir el gel a la membrana de nylon por transferencia capilar en 20x tampón SSC durante la noche. Sumerja la membrana en 2x SSC y fije el ARN a la membrana exponiendo la membrana húmeda a la unión uv..</li>
		<li>Añadir la cantidad adecuada de tampón de hibridación (10 ml por membrana de 100 cm2; Tabla de Materiales) en un tubo de hibridación y agitar a 60 oC en un horno de hibridación.</li>
		<li>Poner la membrana en el tubo de hibridación e incubar durante 60 min a 60oC. Diluir una sonda de ADN con etiqueta 5'DIG (concentración final, 50 ng/ml) en la solución de hibridación que contiene un búfer de hibridación precalentado.</li>
		<li>Deseche el búfer de prehibridación y sustitúyalo inmediatamente por una solución de hibridación precalentada que contenga la sonda con la etiqueta DIG. Incubar la mancha con sonda a 60oC durante la noche, con una agitación suave.</li>
		<li>Después de la hibridación, lavar la membrana dos veces en tampones de creciente rigente a 60 oC durante 20 minutos cada uno. Limpie suavemente la membrana para eliminar el tampón de lavado adicional y añadir los reactivos como se sugiere en el kit de hibridación y detección quimioluminiscente(Tabla de materiales).</li>
		<li>Detectar señales hibridadas por reacción quimioluminiscente combinada con el sistema de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El silenciamiento de ARN es un mecanismo de defensa clave empleado por las plantas para combatir patógenos virales, bacterianos, oomycete y hongos. A su vez, estos microbios han evolucionado las proteínas supresoras de silenciamiento para contrarrestar el silenciamiento antiviral, y estos RSS interfieren con diferentes pasos de la vía de silenciamiento del ARN22,23. Se han desarrollado varios ensayos de cribado para identificar los RSS10.<...

En las últimas dos décadas, la aceleración en la secuenciación del genoma de microorganismos que causan enfermedades vegetales ha dado lugar a una brecha de conocimiento cada vez mayor entre la información de secuencia y las funciones biológicas de las proteínas codificadas1. Entre las moléculas reveladas por proyectos de secuenciación se encuentran moléculas efectoras que suprimen la inmunidad innata y facilitan la colonización del huésped; estos factores son secretados por patógenos vegetales destructivos, incluyendo bacterias, nematodos y microbios filamentosos. Para responder a estas amenazas, las plantas anfitrionas han desarrollado nuevos receptores que reconocen a estos efectores, permitiendo la restauración de la respuesta inmune. Por lo tanto, los efectores están sujetos a diversas presiones selectivas, lo que conduce a la diversificación de los repertorios de efectores entre los linajes de patógenos2. En los últimos años, se ha demostrado que los efectores putativos de patógenos vegetales de patógenos vegetales interrumpen la inmunidad innata de las plantas al impedir los procesos celulares del huésped para beneficiar a los microbios de diversas maneras, incluyendo la desregulación de las vías de señalización, transcripción, transporte intracelular, estabilidad del citoesqueleto, tráfico de vesículas y silenciamiento de ARN3,4,5. Sin embargo, la gran mayoría de los efectores patógenos, particularmente los de patógenos filamentosos, han permanecido enigmáticos.
El silenciamiento de ARN es una maquinaria de inactivación genética mediada por homología que se conserva entre los eucariotas. El proceso se desencadena por el ARN de doble cadena (dsRNA) y se dirige al ARN homólogo de una sola cadena (ssRNA) de una manera específica de la secuencia, y manipula una amplia gama de procesos biológicos, incluida la defensa antiviral6. Para superar las respuestas inmunitarias innatas del huésped, algunos virus han evolucionado para compensar el silenciamiento del ARN, incluida la capacidad de replicarse dentro de compartimentos intracelulares o escapar de la señal reorganizada de silenciamiento. Sin embargo, la estrategia más general mediante la cual los virus protegen sus genomas contra la pérdida dependiente del ARN dependiente del silenciamiento de la función génica es codificar proteínas específicas que suprimen el silenciamiento del ARN7,8. Se han establecido varios enfoques mecanicistas diferentes para examinar y caracterizar los supresores virales del silenciamiento de ARN (VSR), incluyendo la coinfiltración de cultivos de Agrobacterium tumefaciens, plantas transgénicas que expresan supresores putativos, injertos y cultivo celular9,10,11,12,13.
Cada uno de estos ensayos tiene ventajas y desventajas, e identifica vsR de su propia manera distinta. Uno de los enfoques más comunes se basa en la co-infiltración de cultivos individuales de A. tmuefaciens que albergan la proteína viral potencial y un gen reportero (típicamente proteína fluorescente verde [GFP]) en las plantas de Nicotiana benthamiana 16c que constituyen la expresión de GFP bajo el control del virus de mosaico de coliflor 35S promotor. En ausencia de un supresor de silenciamiento viral activo, GFP es identificado como exógeno por las células huésped y se silencia dentro de los 3 días después de la infiltración (dpi). Por el contrario, si la proteína viral posee actividad de supresión, el nivel de expresión de GFP se mantiene estable más allá de 3 a 9 ppp9. Este ensayo de co-infiltración es simple y rápido; sin embargo, no es altamente estable ni sensible. No obstante, el ensayo ha identificado numerosos VSR con diversas secuencias y estructuras proteicas en muchos virus de ARN7,8.
Recientemente, varias proteínas efectoras que pueden inhibir la actividad de silenciamiento del ARN celular se han caracterizado por patógenos de plantas bacterianas, oomycete y hongos14,15,16. Estos hallazgos implican que la supresión del silenciamiento del ARN es una estrategia común para facilitar la infección que es utilizada por patógenos en la mayoría de los reinos. En teoría, muchos, si no todos, de los efectores podrían codificar los supresores de silenciamiento de ARN (RSS); hasta la fecha, sin embargo, sólo unos pocos han sido identificados, principalmente debido a la escasez de la estrategia de cribado fiable y general. Además, no se han investigado supresores de silenciamiento de ARN en la gran mayoría de los patógenos vegetales17.
En este informe, presentamos un protocolo optimizado y general para identificar los efectores de patógenos vegetales que pueden suprimir el silenciamiento de ARN local y sistémico utilizando el ensayo de infiltración agroindustrial. El objetivo principal de este estudio fue enfatizar los aspectos clave del protocolo y describir los pasos en detalle, proporcionando así un ensayo de cribado que es adecuado para casi todos los efectores de patógenos vegetales.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES)</td><td>Biofroxx</td><td>1086GR500</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>2xTaq Master Mix</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P112-AA</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3-(N-morfolino) ácido propanosulfónico (MOPS)</td><td>Amresco</td><td>0264C507-1KG</td><td>MOPS Tampón</td></tr><tr><td>acetosiringona (AS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Inducción de</td></tr><tr><td>agar</td> <td>AgrobacteriumSigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td>LB medio</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Biofroxx</td><td>1110GR100</td><td>Electroforesis</td></tr><tr><td>Amersham Hybond -N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303 B</td><td>Nothern blot</td></tr><tr><td>Amersham Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>Amersham Imager 600</td><td>Image</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>LB medio</td></tr><tr><td>Bacto Extracción</td> <td>de levaduraBD Biosciences</td><td>212750</td><td>LB</td></tr><tr><td>Cámara</td> mediana <td>Nikon</td><td>D5100</td><td>Fotografía</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Sistema de imagen</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Módulo de detección quimioluminiscente componente de los kits dafa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td>Detección de luminiscencia</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>ClonExpress II Kit de clonación en un solo paso</td><td>Vazyme Biotech</td><td>C112-01</td><td>Ligadura</td></tr><tr><td>DIG Easy Hyb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11603558001</td><td>Tampón de hibridación</td></tr><tr><td>Easypure Kit de minipreparación de plásmidos</td><td>TransGen Biotech</td><td>EM101-02</td><td>Extracción de plásmidos</td></tr><tr><td>EasyPure Kit de extracción rápida de gel</td><td>TransGen Biotech</td><td>EG101-02</td><td>Extracción de gel</td></tr><tr><td>EDTA sal disódica dihidratada</td><td>Amresco/VWR</td><td>0105-1KG</td><td>MOPS Fuente</td>de</tr><tr><td>alimentación de electroforesis</td> de tampón <td>LiuYi</td><td>DYY6D</td><td>Electroforesis de ácido nucleico.</td></tr><tr><td>FastDigest EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0304</td><td>Digestión vectorial</td></tr><tr><td>Sistema de imagen en gel Tanon</td><td></td><td>Tanon3500</td><td>Imagen</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Amresco</td><td>0304-5G</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1914</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>LR Enzima clonasa II</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>Reacción</td></tr> <tr><td>LRNitrocelulosa Membrana secante 0.45um</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td>Northern</td></tr><tr><td>NORTH2south Kit de etiquetado de ADN de primera calidad aleatorio de biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075</td> PCR de <td>etiquetado de biotina</td></tr><tr><td>Termocicladores</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Turba</td><td>PINDSTRUP</td><td>Oro oscuro + arcilla</td><td>Plantas</td></tr><tr><td>Peters Fertilizante soluble en agua</td><td>ICE</td><td>Peter Fertilizante profesional 20-20-20</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max ADN polimerasa de superfidelidad</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P505-d1</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>rifampicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>219549005</td><td>antibióticos</td></tr><tr><td>Tinte de carga de gel de ARN (2X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>Tinte de carga de gel de ARN</td></tr><tr><td>Acetato de sodio Tampón</td><td>Amresco/VWR</td><td>0530-1KG</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Amresco</td><td>0241-10KG</td><td>LB medio</td></tr><tr><td>Citrato trisódico</td><td>Amresco</td><td>0101-1KG</td><td>SSC Tampón</td></tr><tr><td>Trizol Reactivo</td><td>Invitrogen 15596018</td><td></td><td>reactivo de aislamiento de ARN</td></tr><tr><td></td><td>Analytik Jena</td><td>UVP B-100AP</td><td>Observación</td></tr><tr><td>UVP Horno Hybrilinker</td><td>Analytik Jena</td><td>OV2000</td><td>Northern</td></tr></tbody></table>

detección e identificación de supresores de silenciamiento de arn de efectos secretos de patógenos vegetales

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

El silenciamiento del ARN es un mecanismo de regulación genética evolutivamente conservado y específico de la secuencia en eucariotas. Varios patógenos vegetales han evolucionado proteínas con la capacidad de inhibir la vía de silenciamiento de ARN de la planta huésped. A diferencia de las proteínas efectoras del virus, sólo varias proteínas efectoras secretas han demostrado la capacidad de suprimir el silenciamiento de ARN en patógenos bacterianos, oomicécetos y fúngicos, y las funciones moleculares de la mayoría de los efectores siguen siendo en gran medida desconocidas. Aquí, describimos en detalle una versión ligeramente modificada del ensayo de coinfiltración que podría servir como un método general para observar el silenciamiento del ARN y para caracterizar las proteínas efectoras secretadas por patógenos vegetales. Los pasos clave del enfoque son elegir las hojas sanas y completamente desarrolladas, ajustar el cultivo de bacterias a la densidad óptica (OD) adecuada a 600 nm, y observar la fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) en el momento óptimo en el infiltrado hojas con el fin de evitar la omisión de efectos con una actividad de supresión débil. Este protocolo mejorado contribuirá a un cribado rápido, preciso y extenso de los supresores de silenciamiento de ARN y servirá como un excelente punto de partida para investigar las funciones moleculares de estas proteínas.

Arriba, describimos el procedimiento paso a paso para un ensayo de cribado mejorado para evaluar la actividad RSS de los efectores De P. sojae RxLR. En total, el experimento toma de 5 a 6 semanas. Posteriormente, los RSS identificados por el ensayo pueden caracterizarse aún más en términos de función y mecanismo molecular. Como ejemplo de nuestro enfoque, utilizamos el supresor Phytophthora de P. sojae RxLR effecto de silenciamiento de ARN 1 (PSR1), que se secreta y se e...

Aquí, presentamos un método de cribado modificado que se puede utilizar ampliamente para examinar rápidamente los supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales.

Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo examinar los supresores de silenciamiento de ARN secretados por patógenos vegetales. La principal ventaja de esta técnica es proporcionar un ensayo de cribado rápido, preciso y extenso para la identificación de supresores de silenciamiento de ARN. Preparar mezclas de tierra para macetas que consisten en 50%musgo de turba, 30% de perlita, y 20%vermiculita y autoclave a 120 grados Celsius durante 20 minutos.Remoje las mezclas de suelo autoclaves con la solución de fertilizante vegetal a un gramo por litro y las supaque en macetas más pequeñas almacenadas en una bandeja más grande. Siembre una o dos semillas de Nicotiana bethamiana 16c sobre la superficie del suelo de cada maceta. Cubra la bandeja con una cúpula de plástico y deje que las semillas germinen.Coloque la bandeja bajo cámaras de crecimiento ligeras y controladas por temperatura con una temperatura de 23 a 25 grados centígrados, 50 a 60% de humedad relativa y un fotoperiodo de largo día. Después de tres o cuatro días, las semillas germinan. Quite la cúpula de plástico y deje que las plántulas crezcan en las mismas condiciones utilizadas para el paso de germinación.Cada dos o tres días, añadir una cantidad adecuada de agua manteniendo el suelo húmedo pero no empapado. Cada 10 días, añadir fertilizante para promover un mayor crecimiento. Mantener las plantas de Nicotiana bethamiana 16c en condiciones normales hasta que las plantas tengan al menos cinco hojas verdaderas completamente desarrolladas sin cogollos axilares o florales visibles y las hojas tengan un aspecto verde saludable.Utilice plantas Nicotiana bethamiana 16c de 10 a 14 días de edad para ensayos de silenciamiento de ARN sistémico y hojas de tres a cuatro semanas de edad de Nicotiana bethamiana 16c para ensayos de silenciamiento de ARN local. Utilice una punta para recoger una colonia positiva de la placa LB e inocular las células en un tubo de vidrio que contenga cinco mililitros de medio LB complementado con 50 microgramos por mililitro Kanamicina y 50 microgramos por mililitro Rifampicina. Crecer las células a 30 grados Celsius con temblor a 200 RPM durante 24 a 48 horas.Transfiera 100 microlitros del cultivo a cinco mililitros de medio LB complementados con los mismos antibióticos, 10 MES mililolares a pH 5.6 y 20 micromolarES AS. Cultivar las bacterias a 30 grados celsius con temblores a 200 RPM durante 16 a 20 horas. Centrifugar las células a 4.000 g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet en dos mililitros de 10 tampones de cloruro de magnesio milimolar.Repita el lavado para garantizar la eliminación completa de los antibióticos. Determinar la densidad del cultivo de Agrobacterium midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros. Ajuste el cultivo celular con 10 tampón de cloruro de magnesio mililolar a un OD 600 de 1,5 a 2,0.Añadir 10 MES mililolares a pH 5,6 y 150 micromolarES AS al cultivo de suspensión final e incubar las células a temperatura ambiente durante al menos tres horas sin agitar. Mezclar volúmenes iguales de un cultivo de Agrobacterium que contenga proteína fluorescente verde 35S con un cultivo de Agrobacterium que contenga un supresor de virus de mosaico de pepino 35S 2b, efector putativo o vector vacío. Usando una jeringa sin aguja de un mililitro, infíltrate cuidadosamente y lentamente en las suspensiones mixtas de Agrobacterium en los lados abaxiales de las hojas de Nicotiana bethamiana 16c.Retire la suspensión bacteriana restante de las hojas con toallitas de tejido blando y circule los márgenes de los parches infiltrados con un rotulador. De tres a cuatro días después de la infiltración, utilice una lámpara ultravioleta de onda larga para detectar visualmente la fluorescencia de la GFP en los parches infiltrados de las hojas. Dos semanas después de la infiltración, utilizar la lámpara para detectar hojas recién cultivadas de toda la planta para el silenciamiento sistémico de ARN.Para aislar el ARN total del tejido de la hoja a los cuatro a siete días después de la infiltración, recoja los tejidos de las hojas de los parches de Nicotiana bethamiana 16c infiltrados en un mortero. Coloque nitrógeno líquido en el mortero y muele el tejido en un polvo fino con una varilla de molienda y transfiera el polvo a un tubo estéril de dos mililitros. Añadir inmediatamente el reactivo de aislamiento de ARN al volumen de un mililitro por cada 100 miligramos de tejido al tubo de muestra en una campana, vórtice vigorosamente para homogeneizar, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.Añadir cloroformo al volumen de 200 microlitros por mililitro de reactivo de aislamiento de ARN a cada tubo de la campana, agitar vigorosamente durante 15 segundos e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrifugar el homogeneizar a 12.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo libre de RNase y deseche el pellet.Añadir 0,7 volumen de isopropanol al sobrenadante, invertir suavemente varias veces e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Precipitar el pellet de ARN por centrifugación a 12.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante.Lavar el pellet con 70% etanol y secar al aire el pellet en una capucha. Disolver el ARN en agua tratada con pirocarbonato dietil incubando en un baño de agua de 65 grados Celsius durante 10 a 20 minutos. Para realizar el análisis de la mancha del norte de los niveles de ARN mensajero GFP, prepare un gel de agarosa desnaturalización de formaldehído del 1,2%en búfer de funcionamiento 1X MOPS.Mezcle el ARN uno a uno con el tinte de carga de ARN y desnaturalizar el ARN por incubación a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Enfríe inmediatamente las muestras desnaturaladas sobre hielo durante un minuto. Con una pipeta, cargue las muestras en los pozos del gel y electroforos a 100 voltios durante 50 minutos hasta que el ARN esté bien separado.Enjuague el gel en un tampón de citrato sódico 20X para eliminar el formaldehído. Realice la transferencia capilar durante la noche mediante la configuración de un tampón de citrato de sodio salino 20X, una capa de toalla de papel, dos capas de papel Whatman húmedo, una capa de gel, una capa de membrana de nylon, dos capas de papel Whatman húmedo, dos capas de papel Whatman seco, una placa de vidrio y un peso. Por la mañana, el ARN del gel se transfiere a la membrana de nylon.Remoje la membrana en citrato de sodio salino 2X y fije el ARN a la membrana exponiendo la membrana húmeda a la reticulación UV. Proceda según el manuscrito. Hojas completamente desarrolladas de tres a cuatro semanas de edad, nicotiana bethamiana 16c, fueron coin infiltradas en parches con mezclas de Agrobacterium que transportaban GFP 35S.A los cuatro días posteriores a la infiltración, la fluorescencia GFP de la zona infiltrada fue imán bajo luz natural y luz UV de onda larga. Northern blot reveló que el ARN mensajero GFP se acumuló más alto en las hojas que expresan 35S GFP más 35S CMV2b o 35S GFP más 35S PSR1 que en las hojas que expresan 35S GFP más EV. Se realizó un ensayo de agroinfiltración para evaluar la propagación de la señal de silenciamiento en las hojas de las plántulas Nicotiana bethamiana 16c de dos semanas de edad. A los 14 días posteriores a la infiltración, más del 98% del EV no exhibió señalización obvia de la GFP en las hojas sistémicas.Mientras que tanto CMV2b como PSR1 inhibió eficientemente la propagación sistémica de la señal de silenciamiento. La fluorescencia de la GFP se observó en aproximadamente el 80% de las plantas coin infiltradas y en el 20% restante de plantas infiltradas con sólo unas pocas venas rojas aparecieron en hojas recién emergidas. Esta técnica allana el camino para que los investigadores identifiquen nuevos supresores de silenciamiento de ARN secretados por muchos patógenos vegetales.La combinación de plantas y la OD adecuada es lo más importante a recordar al intentar este procedimiento. Después de este procedimiento, la caracterización funcional del supresor de silenciamiento de ARN se puede hacer para explorar el mecanismo de cómo estos supresores presionan el silenciamiento del ARN host y cuál es la salida. Por favor, use las gafas de seguridad cuando se infiltre en las plantas y también use los guantes de látex durante todos los pasos del experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Descripción de un virus inducida por silenciamiento génico (VIGS) método de derribo de la expresión génica...

Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) en Nicotiana benthamiana Y tomate

Fuente: Shi, J., et al. Cribado e identificación de supresores silenciadores de ARN a partir de efectores secretados de patógenos vegetales. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo muestra un ensayo de coinfiltración para identificar proteínas efectoras de patógenos que suprimen el silenciamiento de ARN en Nicotiana benthamiana 16c. Un reportero fluorescente y un gen efector candidato se introducen en las hojas de las plantas a través de Agrobacterium. Normalmente, el silenciamiento de ARN degrada los...

Ensayo de coinfiltración para detectar efectores de patógenos que suprimen el silenciamiento del ARN vegetal

Inducida por el virus de silenciamiento génico es una herramienta útil para la identificación de genes implicados en la resistencia de las plantas hospedantes. Se demuestra el uso de patógenos bacterianos que expresan GFPuv en la identificación de genes silenciados plantas susceptibles a los agentes patógenos no hospedantes. Este método es fácil, rápido y facilita la detección a gran escala y protocolo similar se puede aplicar al estudio de otras interacciones planta-microorganismo.

VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped

Aquí se describe una metodología para llevar a cabo un siRNA dirigidos pantalla "ubiquitome" para identificar nuevos ubiquitina y reguladores-ubiquitina de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia. Esto puede ser adaptado a cualquier vía biológica, donde una lectura robusta de la actividad del indicador está disponible.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

La cuantificación del crecimiento de patógenos es una poderosa herramienta para caracterizar diversas respuestas inmunitarias de Arabidopsis thaliana (en adelante: Arabidopsis). El método descrito aquí presenta un ensayo optimizado de infiltración de jeringas para cuantificar la Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 crecimiento en hojas adultas de Arabidopsis.

Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em&gt; Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em&gt; Patosistema

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Una canalización bioinformática, a saber, miRDeep-P2 (miRDP2 para abreviar), con criterios de miRNA de plantas actualizados y un algoritmo revisado, podría analizar con precisión y eficiencia transcriptometrías de microARN en plantas, especialmente para especies con genomas complejos y grandes.

Un gasoducto de bioinformática para analizar de forma precisa y eficiente los transcriptomes de microRNA en las plantas

Presentamos un protocolo detallado para el sistema de silenciamiento de microARN (VbMS) basado en el virus de la papa X (PVX) para caracterizar funcionalmente los microARN endógenos (miRNAs) en la papa. Las moléculas de imitación objetivo (TM) de miRNA de interés se integran en el vector PVX y se expresan transitoriamente en la papa para silenciar la familia objetivo de miRNA o miRNA.

Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.

Este método demuestra el uso de la técnica de hibridación del norte para detectar miRNAs a partir del extracto total de ARN.

Análisis de manchas de ARN para la detección y cuantificación de microARN de plantas

Aquí, presentamos un método detallado de remojo de interferencia de ARN en Bursaphelenchus xylophilus para facilitar el estudio de las funciones de los genes.

Aplicación de la interferencia de ARN en el nematodo de la madera de pino, Bursaphelenchus xylophilus

Describimos un método simple pero altamente reproducible para aislar el ARN extracelular de la superficie de la hoja y el apoplasto de las plantas de Arabidopsis.

Una guía paso a paso para el aislamiento y análisis de la superficie foliar y el ARN apoplásico utilizando rosetas de Arabidopsis

Aprende a detectar supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales usando Nicotiana bethamiana. Este método de cribado rápido y preciso facilita el estudio de las interacciones planta-patógeno.

Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales

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