Combinación de dispositivos fluidos con microscopía y citometría de flujo para estudiar el transporte microbiano en medios porosos a través de escalas espaciales

El estudio del transporte de bacterias en sistemas porosos es importante en lo que respecta a la contaminación, la propagación de enfermedades y la biorremediación. Para estos experimentos en modelos matemáticos que operan en la célula única, se requiere la población y el nivel de la comunidad microbiana. Aquí presentamos herramientas para estudiar el transporte bacteriano utilizando dispositivos microfluídicos y microscopía, así como dispositivos más grandes en combinación con la citometría de flujo.

La combinación de dispositivos microfluídicos con microscopía y citometría de flujo ofrece una gama de posibilidades para estudiar fenómenos de transporte bacteriano a diferentes escalas espaciales. Con el fin de explorar completamente este protocolo, se sugiere tener experiencia previa en microscopía, procesamiento básico de imágenes, diseño de dispositivos microfluídicos y masterización de la citometría de flujo. Este video describe dos métodos para estudiar el transporte bacteriano a diferentes escalas espaciales.

El primer método, basado en dispositivos microfluídicos, se basa en la microscopía para contar células individuales. Este sistema se puede utilizar para estudiar el transporte bacteriano a través de múltiples escalas espaciales desde el poro hasta toda la escala del sistema poroso. El segundo método, utilizando dispositivos fluidos más grandes acoplados a un dispensador automatizado y citometría de flujo, se puede utilizar para estudiar el fenómeno del transporte bacteriano a escala de sistemas porosos enteros.

Estos métodos también se pueden implementar en estudios de columnas a escala de laboratorio, así como pequeñas encuestas de campo. Para empezar, diseñe la geometría porosa deseada que consta de una matriz de círculos. En función de la geometría elegida, prepare un molde utilizando una fotolitografía SU-8 estándar.

Preparar 50 gramos de PDMS añadiendo el 90% de elastómero al 10% del agente de curado al 90% del elastómero en peso en un recipiente desechable limpio y mezclar los dos reactivos con una herramienta limpia. Aplicar un vacío de 100 milibar durante 30 minutos para eliminar el aire disuelto y las burbujas. Coloque el molde en una placa De Petri y vierta el PDMS sobre el molde a la altura deseada entre dos y cinco milímetros.

Cubra el plato de Petri con una tapa y manténgalo a 60 grados centígrados durante al menos cuatro horas. Después de eso, deje que el dispositivo microfluídico se enfríe a temperatura ambiente. Una vez enfriado, retire cuidadosamente la porción deseada de PDMS con un bisturí.

Selle temporalmente la parte inferior del canal PDMS con cinta. Con un perforador de 0,5 milímetros de diámetro, perfora los canales para crear una entrada y una salida. Retire la cinta del canal PDMS y coloque el canal con el lado poroso hacia arriba.

Trate el portaobjetos de vidrio y las superficies PDMS con plasma durante unos 45 segundos cada una a temperatura ambiente. Coloque el canal PDMS pretratado en el portaobjetos de vidrio pretratado y caliente a 100 grados centígrados durante 30 minutos en una placa caliente, luego retire el dispositivo microfluídico de la placa caliente y enfríe hasta la temperatura ambiente. Aplique vacío durante 30 minutos para eliminar el aire de PDMS.

Para producir la base que contiene el compartimiento de poros, utilice micro fresado de alta precisión para eliminar 0,5 milímetros de la capa PMMA base y fresar una ranura del tamaño de 1,1 por 1,1 milímetros para una junta tórica de goma. Taladre dos orificios roscados para una entrada y salida en la parte superior del dispositivo fluido y 12 orificios para tornillos. Esto sirve como tapa del dispositivo fluido.

Después de limpiar el dispositivo fluido, atornille la base y la tapa con los 12 orificios roscados. Retire el microfluídico del vacío y colóquelo en la etapa del microscopio. Utilice la bomba de jeringa para saturarla con tampón de motilidad.

Con la microscopía Brightfield o el contraste de fase, ajuste el aumento para visualizar las células bacterianas individuales y concéntrese en el centro del canal de observación. Cambie los ajustes de la trayectoria de la luz a la microscopía de fluorescencia. Ajuste el enfoque a través de un desplazamiento y el tiempo de exposición de la cámara para resolver las células bacterianas individuales.

En este caso, 100 milisegundos. A continuación, inserte el tubo de entrada en un tubo de dos mililitros que contenga la suspensión bacteriana. Invierta la dirección de la bomba y comience a retirar la suspensión a un caudal de un microlitro por minuto.

Escanee la sección transversal de todo el canal de observación, grabando una imagen cada minuto. Importe imágenes a una plataforma de software deseada. Grabe el fondo como el promedio de las primeras imágenes cuando no se hayan grabado partículas.

Restar el fondo de cada imagen para eliminar el ruido de la cámara y la aberración óptica. Recorte las imágenes a una región de interés. Identifique un valor de umbral igual a la intensidad de píxeles de fluorescencia de celda para que los valores superiores al umbral incluyan celdas bacterianas.

Utilice el procesamiento de imágenes para restar el valor de umbral de cada imagen. Binarize la imagen resultante para que las células bacterianas tomen un valor de uno, mientras que el fondo toma un valor de cero. Elimine los grupos de píxeles con un área más pequeña que el tamaño de celda bacteriana más pequeño en píxeles.

Sume la imagen binarizada para obtener el número total de píxeles de los clústeres restantes. Divida el número de píxeles por el tamaño medio de una célula bacteriana en píxeles para obtener una estimación del número de celdas. Transforme los recuentos en concentración en partículas por mililitro.

Para identificar la concentración de la suspensión bacteriana inyectada, inyecte la suspensión bacteriana en el canal de observación de un dispositivo microfluídico limpio con una jeringa. Registre la imagen y calcule la concentración bacteriana influente como se muestra anteriormente. Visualice las curvas de ruptura normalizando la concentración bacteriana de efluentes C con la concentración bacteriana influente C0 y trazando C sobre C0 frente a tiempo.

Para analizar las velocidades y trayectorias locales de las bacterias transportadas a través de la matriz porosa, mueva la etapa del microscopio a una región de interés y ajuste el enfoque al centro del dispositivo microfluídico. Ajuste la configuración óptica a la microscopía de contraste de fase o fluorescencia. Grabe imágenes de lapso de tiempo y un tiempo de exposición lo suficientemente corto como para capturar el desplazamiento bacteriano.

En este caso, 50 milisegundos. Grabe imágenes durante un período de tiempo suficiente, por ejemplo tres minutos. Para eliminar el ruido de cada imagen, reste el fondo, que es el promedio de la suma de todas las imágenes grabadas.

Determine el módulo del degradado numérico y normalícese por su valor máximo. Busque y registre las coordenadas bacterianas y la hora de adquisición de la imagen en un archivo de tres columnas. Realice análisis de seguimiento de partículas para procesar los datos registrados y calcular las trayectorias.

Para obtener perfiles de deposición, registre una imagen compuesta de todo el canal poroso antes, que es el fondo, y después de la inyección de la suspensión bacteriana a través del dispositivo microfluídico. Retire el fondo de las imágenes grabadas después de la inyección bacteriana. Calcular el perfil de deposición D como la suma de la señal de fluorescencia bacteriana a lo largo de secciones transversales de longitud x del canal poroso.

Visualice el perfil de deposición como la señal de fluorescencia local frente a la longitud del canal poroso. Para configurar el dispensador automatizado, coloque el dispensador robótico cerca del dispositivo fluido. Conecte el dispensador robótico al ordenador que ejecuta BCNC e identifique el puerto com correcto.

En BCNC, haga clic en el botón de inicio para devolver el dispensador robótico a la posición inicial. Conecte la bomba peristáltica con la entrada utilizando tubos de 50 centímetros de largo, un milímetro de diámetro interior y la salida con el dispensador automatizado utilizando el mismo tubo. Bomba de medio de cultivo a través del dispositivo fluido.

Tenga en cuenta la llegada del medio en el tubo de salida fijado al dispensador robótico y coloque una placa de 96 pozos que recogerá la salida. Al mismo tiempo, active el dispensador robótico e inyecte la suspensión bacteriana a través del dispositivo fluido PMMA a un caudal de 0,2 mililitros por minuto. Inyectar suspensión bacteriana equivalente a varios volúmenes de poros.

Por ejemplo, 30 veces el volumen del dispositivo fluido. Después de la inyección, cambie al medio de cultivo estéril hasta el final del experimento. Una vez que se haya completado una placa de 96 pozos, cubra la placa y guárdela a cuatro grados Celsius hasta el análisis de citometría de flujo.

Analice muestras con citometría de flujo y visualice curvas de ruptura normalizando la concentración bacteriana de efluentes C con la concentración bacteriana influente C0 y trazando C sobre C0 frente al tiempo. En este estudio, utilizando Pseudomonas putida KT2440, tanto móviles como no móviles, se realizaron experimentos secuenciales en dispositivos microfluídicos PDMS con una matriz aleatoria de pilares. Aquí se muestran curvas de ruptura normalizadas a la concentración de células inyectadas, así como trayectorias bacterianas en la escala de poros.

También se realizaron experimentos con dispositivos fluidos a gran escala fresados a partir de PMMA. Se inyectaron Pseudomonas putida KT2440 móviles y no móviles en una matriz porosa espaciada regularmente. Sorprendentemente, en un ambiente poroso carente de biopelícula, Pseudomonas putida KT2440 móvil y no móvil mostró un comportamiento de transporte marcadamente diferente basado en curvas revolucionarias.

En una matriz porosa colonizada durante 48 horas con una compleja comunidad de biopelículas de flujo, estas diferencias en las curvas de ruptura entre las pseudomonas putida KT2440 móviles y no móviles desaparecieron. Utilizamos este sistema para estudiar el transporte bacteriano en las corrientes, pero estas herramientas se pueden ajustar fácilmente para estudiar fenómenos de transporte bacteriano en otros sistemas de ingeniería y ambientales. El transporte bacteriano a través de medios porosos hidratados encapsula los procesos a través de múltiples escalas espaciales.

La metodología aquí presentada permite vincular el desplazamiento local de bacterias a escala de poros con el transporte microscópico en todo el medio poroso.