Protocolo de Electroporación Universal y Eficiente para la Ingeniería Genética de Organoides Gastrointestinales
18 de febrero de 2020
Este protocolo describe un método de electroporación eficiente para la transfección de cuatro entidades organoides gastrointestinales diferentes con plásmidos más grandes (hasta una extensión de 10 kB). Se puede realizar en el plazo de un día y no necesita una preparación extensa o amortiguadores de electroporación especiales y costosos.
Este método permite la transfección eficiente de cultivos celulares 3D como organoides. Se pueden facilitar varias aplicaciones de la ingeniería genética. El protocolo es universal y se puede realizar en el plazo de un día.
No necesita una preparación extensiva ni tampones de electroporación especiales y costosos. Este método de transfección se demostró en tumores y organoides sanos, pero también se puede ajustar a esferoides y cultivo celular 2D. Si realiza este protocolo por primera vez, es importante manejar los organoides con cuidado debido a su proliferación individual y reacción a la disociación.
Monitoríelos microscópicamente durante todo el procedimiento. Comience por precalentar placas de 48 pozos a 37 grados Celsius para la siembra posterior a la electroporación, luego prepare medios específicos de cultivo basal y organoide de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cultivar cinco pozos de organoides por muestra de electroporación en una placa de 48 pozos, preparar 230 microlitros de reactivo de disociación con 10 micromolares Y-27632 por pozo.
Monitoree los organoides bajo un microscopio. Retirar el medio de cultivo de los pozos y disociar los organoides mecánicamente en la mezcla de disociación preparada. Acote cinco pozos por muestra de electroporación en un tubo de 15 mililitros.
Mezclar el contenido del tubo por vórtice e incubarlo durante cinco a 15 minutos a 37 grados Celsius hasta que se produzcan racimos de 10 a 15 células, comprobando la disociación con un microscopio. Detenga la digestión añadiendo hasta 10 mililitros de medio basal sin antibióticos. Centrifugar el tubo a 450 veces g durante cinco minutos, desechar el sobrenadante y lavar las células dos veces con cuatro mililitros de tampón de electroporación.
Centrifugar y desechar el sobrenadante después de cada lavado. Después de los lavados, resuspender el pellet organoide en 100 microlitros de tampón de electroporación con 30 microgramos de ADN plásmido. Dispensar la mezcla completa de ADN-organoide en una cubeta de electroporación.
Asegúrese de evitar las burbujas de aire. Establezca los parámetros de electroporación como se describe en el manuscrito de texto y toque la cubeta con un dedo para mezclar suavemente las células. Coloque la cubeta en la cámara de la cubeta y presione el botón de impedancia en el electroporador para tomar nota del valor de impedancia.
Pulse el botón Inicio para iniciar el programa de electroporación y controlar los valores de las corrientes, voltajes y energías mostradas. Después de la electroporación, añadir inmediatamente 500 microlitros de medio de cultivo sin antibióticos a las células y mezclar por pipetear hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la muestra a un nuevo tubo de 15 mililitros y enjuague la cubeta con medio basal para recoger las células restantes, luego incubar las células a temperatura ambiente durante 40 minutos.
Centrifugar las células a 450 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 100 microlitros de matriz de sótano y gotas de semilla de 20 microlitro en una placa precalentada de 48 pozos. Incubar la placa durante 10 minutos a 37 grados Celsius para polimerización y añadir 250 microlitros de medio de cultivo complementados con Y-27632 y CHIR99021 por pozo.
Para determinar la eficiencia de la transfección, compruebe la fluorescencia en el control de transfección bajo el microscopio después de 24 a 48 horas. Para el análisis FACS, cosecha las células como se describió anteriormente y digiere durante 10 a 20 minutos hasta que las células individuales estén presentes. Añadir hasta 10 mililitros de PBS y centrifugar las células a 450 veces g durante cinco minutos, luego aspirar y desechar el sobrenadante.
Para discriminar por las células vivas, resuspender el pellet en un mililitro de PBS y añadir un anticuerpo adecuado o yoduro de propidium. Mezclar suavemente las células tocando e incubarlas a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, lavar las células con 10 mililitros de PBS, luego centrifugar y desechar el sobrenadante.
Resuspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS y filtrar la suspensión a través de un colador de 100 micrómetros en un tubo FACS. Analice las células con una máquina FACS utilizando la estrategia de medición adecuada y determine la eficiencia de la transfección. Los organoides de cuatro entidades cancerosas diferentes fueron electroporados al menos tres veces utilizando 30 microgramos de un pequeño plásmido o plásmido grande.
Se analizaron con citometría de flujo 48 horas después de la electroporación y se seleccionaron para la forma celular, células individuales, células vivas y expresión de eGFP. En las cuatro entidades organoides, el pequeño plásmido fue transfectado con mayor eficiencia que el más grande. La transfección más eficiente del plásmido pequeño se alcanzó en organoides PDAC con 92,1% células GFP positivas, mientras que el gran plásmido fue transfectado con una eficiencia del 46,7%El plásmido más grande se transc infectó más eficientemente en organoides CRC con una eficiencia media del 53,4%, mientras que el pequeño plásmido fue transfectado con una eficiencia media del 84,3% La entidad más difícil de transfeccionar eran organoides del cáncer gástrico , lo que demostró la menor eficiencia de transfección para ambos plásmidos.
Como prueba de concepto, los organoides estomacales normales humanos fueron electroporados con una codificación de plásmido para Cas9, GFP y 2sgRNAs dirigidos a TP53. Los clones fueron seleccionados por la administración de Nutlin3 y el nocaut TP53 fue confirmado por la secuenciación de los alelos. Como demostramos con los organoides estomacales humanos, la electroporación eficiente permite varias manipulaciones de la base CRISPR Cas9 de cultivos organoides, como nocaut o knockins, por lo que se pueden modelar diferentes enfermedades.
Visión general
Este protocolo describe un método eficiente de electroporación para transfectar organoides gastrointestinales con plásmidos más grandes. El método es rápido, no requiere preparación extensa ni tampones costosos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Ingeniería genética
Fundamentos
- La transfección de cultivos celulares 3D como organoides es un desafío.
- Se necesitan métodos eficientes para la manipulación genética.
- Este protocolo es aplicable a varios tipos de organoides.
- El manejo cuidadoso de los organoides es crucial durante el procedimiento.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método confiable de electroporación para organoides.
- Facilitar aplicaciones de ingeniería genética en cultivos de organoides.
- Evaluar la eficiencia de transfección en diferentes tipos de organoides.
Métodos utilizados
- Disociación de organoides y preparación de mezclas de electroporación.
- Electroporación con parámetros específicos para ADN plasmídico.
- Monitoreo de la eficiencia de transfección mediante análisis de fluorescencia y FACS.
- Aplicación de CRISPR-Cas9 para edición genética en organoides.
Resultados principales
- Mayor eficiencia de transfección observada con plásmidos más pequeños.
- Los organoides PDAC mostraron la mayor eficiencia para plásmidos pequeños.
- Los organoides de cáncer gástrico tuvieron las tasas de transfección más bajas.
- Edición genética exitosa demostrada en organoides normales de estómago.
Conclusiones
- El método de electroporación es efectivo para varios tipos de organoides.
- Permite una manipulación genética eficiente para modelado de enfermedades.
- Las aplicaciones futuras pueden incluir técnicas más amplias basadas en CRISPR.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Efficient genetic engineering of patient-derived gastrointestinal organoids is critical for translational disease modeling and target validation in early drug discovery. This universal electroporation protocol enables rapid, reproducible transfection of diverse organoid types, supporting high-confidence functional genomics and CRISPR-based manipulation. The method streamlines genetic perturbation workflows, reducing technical barriers and accelerating preclinical hypothesis testing across oncology and regenerative medicine portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust genetic perturbation of organoids for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by facilitating CRISPR-mediated knockout and knockin studies.
- Improves predictive confidence in disease-relevant 3D models for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, genetically modified organoids for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible transfection efficiencies quantified by FACS, supporting assay reliability.
- Facilitates scalable preparation of engineered organoid systems for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of patient-specific mutations and disease states in organoid cultures.
- Provides continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports alignment with translational biomarkers through precise genome editing.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless transition from genetic hypothesis testing to functional validation in disease-relevant organoid systems.
- Discovery Biology: Facilitates rapid null hypothesis testing and pathway interrogation in 3D models.
- Screening: Provides reproducible, quantitative transfection outputs for assay development.
- Analytics: Delivers FACS-based efficiency metrics for cross-condition comparison and optimization.
- Translational Research: Bridges engineered organoid models to preclinical disease studies and biomarker exploration.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse organoid and spheroid systems across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with minimal preparation and no need for specialized buffers.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling rapid genetic manipulation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture and handling to ensure viability and reproducibility.
- Needs access to standard electroporation equipment and FACS analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gating strategies and transfection efficiency metrics.
- Adaptable to various organoid types and potentially to spheroids and 2D cultures with protocol adjustments.
- Efficiency may vary by organoid entity and plasmid size, requiring empirical optimization.
