Protocolo de Electroporación Universal y Eficiente para la Ingeniería Genética de Organoides Gastrointestinales

Este método permite la transfección eficiente de cultivos celulares 3D como organoides. Se pueden facilitar varias aplicaciones de la ingeniería genética. El protocolo es universal y se puede realizar en el plazo de un día.

No necesita una preparación extensiva ni tampones de electroporación especiales y costosos. Este método de transfección se demostró en tumores y organoides sanos, pero también se puede ajustar a esferoides y cultivo celular 2D. Si realiza este protocolo por primera vez, es importante manejar los organoides con cuidado debido a su proliferación individual y reacción a la disociación.

Monitoríelos microscópicamente durante todo el procedimiento. Comience por precalentar placas de 48 pozos a 37 grados Celsius para la siembra posterior a la electroporación, luego prepare medios específicos de cultivo basal y organoide de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cultivar cinco pozos de organoides por muestra de electroporación en una placa de 48 pozos, preparar 230 microlitros de reactivo de disociación con 10 micromolares Y-27632 por pozo.

Monitoree los organoides bajo un microscopio. Retirar el medio de cultivo de los pozos y disociar los organoides mecánicamente en la mezcla de disociación preparada. Acote cinco pozos por muestra de electroporación en un tubo de 15 mililitros.

Mezclar el contenido del tubo por vórtice e incubarlo durante cinco a 15 minutos a 37 grados Celsius hasta que se produzcan racimos de 10 a 15 células, comprobando la disociación con un microscopio. Detenga la digestión añadiendo hasta 10 mililitros de medio basal sin antibióticos. Centrifugar el tubo a 450 veces g durante cinco minutos, desechar el sobrenadante y lavar las células dos veces con cuatro mililitros de tampón de electroporación.

Centrifugar y desechar el sobrenadante después de cada lavado. Después de los lavados, resuspender el pellet organoide en 100 microlitros de tampón de electroporación con 30 microgramos de ADN plásmido. Dispensar la mezcla completa de ADN-organoide en una cubeta de electroporación.

Asegúrese de evitar las burbujas de aire. Establezca los parámetros de electroporación como se describe en el manuscrito de texto y toque la cubeta con un dedo para mezclar suavemente las células. Coloque la cubeta en la cámara de la cubeta y presione el botón de impedancia en el electroporador para tomar nota del valor de impedancia.

Pulse el botón Inicio para iniciar el programa de electroporación y controlar los valores de las corrientes, voltajes y energías mostradas. Después de la electroporación, añadir inmediatamente 500 microlitros de medio de cultivo sin antibióticos a las células y mezclar por pipetear hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la muestra a un nuevo tubo de 15 mililitros y enjuague la cubeta con medio basal para recoger las células restantes, luego incubar las células a temperatura ambiente durante 40 minutos.

Centrifugar las células a 450 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 100 microlitros de matriz de sótano y gotas de semilla de 20 microlitro en una placa precalentada de 48 pozos. Incubar la placa durante 10 minutos a 37 grados Celsius para polimerización y añadir 250 microlitros de medio de cultivo complementados con Y-27632 y CHIR99021 por pozo.

Para determinar la eficiencia de la transfección, compruebe la fluorescencia en el control de transfección bajo el microscopio después de 24 a 48 horas. Para el análisis FACS, cosecha las células como se describió anteriormente y digiere durante 10 a 20 minutos hasta que las células individuales estén presentes. Añadir hasta 10 mililitros de PBS y centrifugar las células a 450 veces g durante cinco minutos, luego aspirar y desechar el sobrenadante.

Para discriminar por las células vivas, resuspender el pellet en un mililitro de PBS y añadir un anticuerpo adecuado o yoduro de propidium. Mezclar suavemente las células tocando e incubarlas a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, lavar las células con 10 mililitros de PBS, luego centrifugar y desechar el sobrenadante.

Resuspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS y filtrar la suspensión a través de un colador de 100 micrómetros en un tubo FACS. Analice las células con una máquina FACS utilizando la estrategia de medición adecuada y determine la eficiencia de la transfección. Los organoides de cuatro entidades cancerosas diferentes fueron electroporados al menos tres veces utilizando 30 microgramos de un pequeño plásmido o plásmido grande.

Se analizaron con citometría de flujo 48 horas después de la electroporación y se seleccionaron para la forma celular, células individuales, células vivas y expresión de eGFP. En las cuatro entidades organoides, el pequeño plásmido fue transfectado con mayor eficiencia que el más grande. La transfección más eficiente del plásmido pequeño se alcanzó en organoides PDAC con 92,1% células GFP positivas, mientras que el gran plásmido fue transfectado con una eficiencia del 46,7%El plásmido más grande se transc infectó más eficientemente en organoides CRC con una eficiencia media del 53,4%, mientras que el pequeño plásmido fue transfectado con una eficiencia media del 84,3% La entidad más difícil de transfeccionar eran organoides del cáncer gástrico , lo que demostró la menor eficiencia de transfección para ambos plásmidos.

Como prueba de concepto, los organoides estomacales normales humanos fueron electroporados con una codificación de plásmido para Cas9, GFP y 2sgRNAs dirigidos a TP53. Los clones fueron seleccionados por la administración de Nutlin3 y el nocaut TP53 fue confirmado por la secuenciación de los alelos. Como demostramos con los organoides estomacales humanos, la electroporación eficiente permite varias manipulaciones de la base CRISPR Cas9 de cultivos organoides, como nocaut o knockins, por lo que se pueden modelar diferentes enfermedades.