ANÁLISis de metilación de LINE-1 en células madre mesenquimales tratadas con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma

La metilación del ADN es una de las firmas epigenéticas más estudiadas. Muchos tipos de cáncer se caracterizan por cambios en los niveles de metilación del ADN, que se asocian con la expresión génica aberrante y otras anomalías genómicas. Los elementos nucleares intercalados largos son secuencias genómicas transponibles repetitivas que normalmente tienen altos niveles de metilación.

Sin embargo, a menudo se hipermetilan en el cáncer, que resulta en su activación y conduce a la inestabilidad cromosómica. En este estudio, tratamos las células madre mesenquimales con vesículas extracelulares derivadas de osteosarcoma para ver si los vehículos eléctricos contra el cáncer pueden afectar la metilación LINE-1 en los MEC. El suero bovino fetal, que es un componente integral de los medios de cultivo celular de mamíferos, contiene un gran número de vehículos eléctricos derivados de la bovino.

Estos Evs interferirán con el análisis de Evs de células de nuestro interés, por lo tanto, cuando se cultivan células para el aislamiento EV, es importante utilizar FBS agotado por EV. Tome FBS en tubos de ultracentrífuga y colóquelos en cubos de ultracentrífuga. Equilibre los cubos dentro de 10 miligramos entre sí antes de cargarlos en un rotor oscilante.

Coloque el rotor en la ultracentrífuga y corra a 100.000 G durante 19 horas a cuatro grados centígrados. Después de la carrera, recoja cuidadosamente la capa superior de color claro del sobrenadante y transfiéralo a un tubo de 50 mililitros. No moleste ni enlocar el pellet de color marrón oscuro, ya que contiene VEHÍCULOs eléctricos de FBS.

Pase el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras en un nuevo tubo de 50 mililitros. Este FBS esterilizado por filtro y agotado por EV ahora se puede agregar a los medios de cultivo celular al crecer células para el aislamiento EV. Recoger medios condicionados de células de osteosarcoma cultivadas en medios agotados por EV.

Para eliminar las células y los desechos celulares, centrifuga los medios acondicionados a 2500 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga y equilibre como antes. Centrifugar los tubos a 100.000 G durante dos horas a cuatro grados centígrados.

Deseche cuidadosamente el sobrenadante dejando alrededor de un mililitro en la parte inferior. Añadir alrededor de 20 mililitros de PBS al tubo y pipetear suavemente con el fin de lavar y volver a suspender el pellet EV. Equilibre los tubos y realice otra ronda de ultracentrifugación con los mismos ajustes.

Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet EV en 200 microlitros de PBS mediante pipeteo suave. Almacene los vehículos eléctricos en tubos de baja unión. Los vehículos eléctricos purificados se caracterizan por la hinchazón occidental, el análisis de seguimiento de nanopartículas y la microscopía electrónica de transmisión.

Placa 15.000 MSC por pozo en una placa de 24 pozos. Después de 24 horas, retire los medios antiguos, lave las células con PBS y cambie a medios agotados por EV. Tratar celdas con OS-EVs en los puntos de tiempo programados.

Después de interrumpir el tratamiento con EV, extraiga el ADN de las células utilizando un método adecuado. Para el análisis de metilación, utilizamos un método de amplificación de sonda específico de metilación hecho a medida. Diseñe las sondas LINE-1 personalizadas, como se hizo anteriormente, por Pavicic y otros.

Para las sondas de metilación, seleccione tres secuencias que contengan el sitio de restricción de HhaI dentro de la región del promotor. Para los sondeos de control, seleccione siete secuencias que carezcan del sitio de restricción HhaI del resto de la secuencia LINE-1. Diluir 70 nanogramos de muestra de ADN en tampón TE a cinco microlitros.

Calienta las muestras durante 10 minutos a 98 grados Centígrados y luego enfríe a 25 grados centígrados. Agregue tres microlitros de mezcla de hibridación de sonda a cada muestra y ejecute el termociclo para permitir que las sondas se hibridan en el ADN. A temperatura ambiente, añada 30 microlitros de mezcla post-hibridación a cada muestra.

Transfiera 10 microlitros a un segundo tubo. Coloque ambos conjuntos de tubos en el termociclador e incubar a 48 grados centígrados durante al menos un minuto. Mientras que las muestras están a 48 grados Celsius, añadir 10 microlitros de mezcla de ligadura al primer conjunto de tubos y 10 microlitros de mezcla ligadura-digestión al segundo conjunto de tubos.

Ejecute el siguiente programa de termociclismo. A continuación, gire hacia abajo los tubos y simultáneamente ajuste el termociclador a 72 grados Celsius. Añadir cinco microlitros de mezcla de polimerasa a cada tubo y colocar los tubos en el termociclo.

Ejecute el programa PCR. Mientras se ejecuta el programa PCR, prepare una solución de formaamida de un mililitro que contenga 2,5 microlitros de tamaño estándar. Pipet 10 microlitros de esta solución a cada fila de una placa óptica de 96 pozos.

Después de la PCR, diluir las muestras no digeridas y digeridas a una a cien y doscientas, respectivamente en agua ultra pura. Añadir dos microlitros de producto PCR diluido a la placa de 96 pozos. Centrifugar la placa a 200 G durante 15 a 20 segundos para eliminar las burbujas de aire.

Realizar análisis de fragmentos de muestras por electroforesis capilar. Abra los resultados de la electroforesis capilar en un software de análisis de electroferogramas. Seleccione una muestra y establezca el panel en MLPA en el menú.

Haga clic en el panel y pulse el control D para aplicar esta configuración a todas las muestras. De forma similar, establezca el método de análisis en microsatélite predeterminado para todas las muestras. Seleccione todas las muestras y haga clic en el botón verde de reproducción para ejecutar el análisis, luego seleccione todas las muestras y haga clic en el botón de gráfico para visualizar los picos de la sonda.

Amplíe la región de pico para obtener una resolución más alta de los picos individuales. Asegúrese de que los 10 picos correspondientes a las sondas de la mezcla de sondas LINE-1 estén etiquetados. En la pestaña genotipos, exporte los resultados en formato CSV.

Abra el archivo CSV en un software de análisis de datos y ordene los datos en columnas. Etiquete los tres picos del sitio de metilación en función de sus tamaños. Los siete picos restantes corresponden a las sondas de control.

Aquí estamos usando los picos de sonda LINE-1 2M que tienen un tamaño de aproximadamente 117 pares base. Para cada muestra, calcule el área de pico de suma de los siete picos de control. Divida el área de pico de cada sonda LINE-1 por esta suma.

Para cada muestra, divida el valor de la muestra digerida por el de la muestra no digerida para obtener la proporción de dosificación de metilación. El análisis de hinchazón occidental confirmó la presencia de OS-EV con señales observadas para TSG101, HSP70 y CD63. La ausencia de señal de calnexina indicaba que la muestra EV era pura.

Se observó una indicación adicional de pureza con TEM con vesículas intactas de varios tamaños presentes en la muestra OS-EV. La concentración de partículas OS-EV y la distribución del tamaño se midieron por NTA. El 80% de los vehículos eléctricos estaban en el rango de tamaño de 50 a 200 nanómetros.

Aquí podemos ver las proporciones de dosificación de metilación de LINE-1 de MSCs en diferentes puntos de tiempo del tratamiento EV. La línea gris representa el nivel de metilación de línea base desde el punto de tiempo cero. En el punto de tiempo tres, hay una disminución en la proporción media de dosis de metilación después de la administración de EV, lo que indica hipermetilación.

Este efecto hipermetilador de los vehículos eléctricos es menos pronunciado en el punto de tiempo siete. Aquí hemos mostrado una técnica simple, altamente sensible y robusta para el análisis de metilación. Requiere una baja cantidad de ADN sin conversión de bisulfito implicada y también es adecuado para ADN aislado de muestras incrustadas en parafina.

Todo el método, con las partes experimentales y analíticas, toma alrededor de dos días. Debido a un alto número de copia de LINE-1 en el genoma, la metilación basal de LINE-1 es alta en muestras normales. Por lo tanto, las diferencias en los niveles de metilación de las muestras, como se observa con este método, pueden ser sutiles.