Name: Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende el trazado retrógrado de neuronas motoras en Drosophila utilizando colorantes lipofílicos fluorescentes. Esta técnica permite visualizar la morfología y conectividad neuronal en etapas embrionarias, larvarias y adultas.

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Agradecemos a los miembros del Laboratorio Kamiyama por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un NIH R01 NS107558 (a M.I., K.B. y D.K.).

1. Equipos y suministros
<ol><li>Materiales para recoger embriones y entrenar a adultos para poner óvulos<ol>
<li>Preparar el aparato de filtración cortando un tubo de 50 ml y cortando abrir un agujero en la tapa para fijar un filtro de malla con poros de 100 m(Tabla de materiales)entre el tubo y la tapa. NOTA: Alternativamente, los coladores celulares con poros de 100 m(Tabla de Materiales)se pueden utilizar para el paso de filtración de la recolección de embriones.</li>
		<li>Hacer platos de agar con premezcla de agar de uva(Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones enumeradas. Revuelva brevemente 1 paquete de la mezcla de polvo en 500 ml de temperatura ambiente (RT, 23 oC) dH2O y microonda la mezcla disuelta a hervir vigorosamente. Después de enfriar a 70 o75 oC, vierta la mezcla en los platos de Petri (60 mm). Después de solidificarse el agar, guarde las placas a 4oC.</li>
		<li>Preparar la pasta de levadura mezclando levadura seca activa(Tabla de Materiales)y agua a una consistencia de pasta, y manténgala a 4oC.</li>
		<li>Utilice jaulas de recolección de huevos (para plato Petri de 60 mm, Tabla de materiales)que proporcionen suficiente flujo de aire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de agujas de disección y micropipetas de inyección de tinte<ol>
<li>Preparar micropipette de inyección de tinte y aguja de disección del mismo tubo capilar con un diámetro interior de 0,6 mm y un diámetro exterior de 1,2 mm(Tabla de materiales). Tire del tubo capilar por un tirador de micropipeta al 7% de la salida máxima de 170 V(Tabla de materiales)para crear una aguja afilada con un cónico de 0,4 cm de longitud.</li>
		<li>Para la inyección de tinte, ajuste el micropipeta con un beveler de micropipeta(Tabla de materiales)mediante una técnica de biselado de burbujas descrita en el manual del instrumento.<ol>
<li>En resumen, remoje la amoladora con un agente humectante(Tabla de Materiales)para evitar que el agua 'arrastre' la punta de la aguja. Coloque la aguja en la abrazadera de micropipeta a 25 x 30o y baje la punta en dos tercios del radio desde el centro de la superficie biselada. Moler la aguja mientras una jeringa con tubo empuja el aire dentro de la aguja, para asegurarse de que el micropipeta estará libre de virutas de vidrio.</li>
			<li>Marque el micropipeta con un marcador permanente de punta fina para indicar la posición de la abertura en la punta después del biselado, ya que es difícil localizar la abertura estrecha de la micropipeta que se forma en un ángulo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación para la recogida de embriones
<ol><li>Asegúrese de que las moscas adultas (20-40 de tipo salvaje Canton-S o moscas blancas), machos y hembras, se mantengan en condiciones jóvenes (<7 días) y saludables para la recolección ideal de huevos. NOTA: Para estimular la puesta de huevos, las moscas son entrenadas en su jaula de recolección de huevos un par de días antes de la recolección de huevos en placas de agar rayadas con pasta de levadura al menos una vez al día.</li>
</ol>3. Escenificación de embriones
<ol><li>Permita que las moscas pongan huevos durante la noche (o al menos 15 h) en RT para recoger los embriones a 15 h AEL, es decir, etapa 1618,para ver la dendritogénesis de las neuronas motoras aCC y RP3. Por la mañana, recoge el plato con los huevos. NOTA: Los embriones a 15 h AEL tendrán un intestino de 4 cámarasdistinto 18. Para obtener imágenes, las diferentes etapas siguen sus criterios morfológicos específicos y las condiciones de envejecimiento.</li>
	<li>Para recoger los embriones, deschorionar los huevos puestos en el plato con 50% de lejía durante 5 min.</li>
	<li>Una vez que los coros se hayan despejado, vierta el contenido de la placa a través del aparato de filtración o colador celular para aislar los embriones. Usando una botella de agua, diluir la lejía que queda en la placa y recoger tantos embriones como sea posible decantando la mezcla en el filtro.</li>
	<li>Lavar los embriones en el filtro de 3 x 4 x con más agua o hasta que el olor de lejía se disipate. Retire el filtro del aparato y lave los embriones en otra placa limpia con agua. Decantar el agua de la nueva placa en la que están los embriones.</li>
	<li>Preparar una diapositiva de vidrio cubriéndola con dos capas de cinta de vinilo en el centro, formando un rectángulo. Corte una piscina rectangular de la cinta con una cuchilla de afeitar. Coloque una tira delgada de cinta adhesiva de doble cara hacia el extremo superior de la piscina, aquí es donde se colocarán los embriones como se muestra en la Figura 1.</li>
	<li>Usando fórceps finos, seleccione individualmente 5 x 10 embriones a 15 h AEL y colóquelos en la cinta de doble cara con el lado dorsal hacia arriba. Añadir la salina de insectos Ringer19 a la piscina de disección para proteger los embriones de la desecación(Figura 1).</li>
</ol>4. Disección y tinción
<ol><li>Usando una aguja de vidrio bajo un microscopio de disección(Tabla de Materiales), corta a través de la línea media de un solo embrión en su superficie desde su extremo posterior a su extremo anterior. A continuación, arrastre el embrión fuera de la membrana vitelina de la cinta al vidrio (en caja en la Figura 1). Tenga cuidado de no dañar los tejidos interiores del embrión.</li>
	<li>Voltear los tejidos epiteliales desde el centro y fijar el borde epidérmico en la superficie de la diapositiva de vidrio(Figura 1, recuadro).</li>
	<li>Usando una aguja conectada a un tubo con una abertura de punta de 300 m (preparada rompiendo la punta delgada de una aguja de disección), aspirar o soplar aire para separar y eliminar los troncos tracatos longitudinales dorsales, así como los intestinos restantes.</li>
	<li>Utilice un 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina con fosfato (PBS) para fijar los embriones durante 5 minutos en RT. Lavar los embriones 3 veces con PBS.</li>
	<li>Manchar los embriones con 1 l de anticuerpo anti-caballo peroxidasa conjugado con tinte cianina 3 (anti-HRP Cy3)(Tabla de Materiales)en 200 éL de PBS durante 1 h. Lavar los embriones con PBS 3x después de la tinción. NOTA: El tinte de anti-HRP se puede cambiar en función de los tintes lipofílicos de elección para la inyección.</li>
</ol>5. Relleno de la micropipeta de inyección
<ol><li>Caliente los colorantes lipofílicos (5 mg/ml de DiO o DiD, Tabla de Materiales)a 60oC en una mezcla de 1:10 de etanol:aceite vegetal antes de su uso.</li>
	<li>Prepare un portaobjetos de colorante disuelto con aceite para la micropipeta de inyección. Coloque el micropipeta en el soporte capilar(Figura 2,#1). Usando el micromanipulador(Tabla de Materiales),ajuste el micropipeta para que esté sobre el tobogán de tinte. A continuación, ajuste el escenario para colocar el micropipeta en el tinte(Figura 2,#2).</li>
	<li>Para llenar el micropipeta, utilice un microinyector(Tabla de materiales)(Figura 2,#3). Recoja el tinte en el micropités ajustando el Pi (presión de inyección) entre 200-500 hPa (hectopascal), el Ti (tiempo de inyección) entre 0,1 x 0,5 s y Pc (presión de compensación) a 0 hPa durante 5 min(figura 2, #4).</li>
	<li>Una vez recogido el tinte, retire el tobogán de colorante y coloque la muestra en la etapa del microscopio. A continuación, aumente el Pc a un rango de 20 a 60 hPa antes de bajar el micropipeta en la muestra para evitar la contaminación de PBS por acción capilar.</li>
</ol>6. Inyección de tinte en las neuronas
<ol><li>Localice el embrión en el centro utilizando el microscopio con una lente objetivo 10x(Tabla de Materiales)y alinee la micropipeta con el embrión. NOTA: El tamaño de la gota de tinte se puede ajustar cambiando la Pi o el tamaño de la abertura de la punta del micropipeta. La gota debe ser de 10 a 20 m, que es aproximadamente el ancho de 1 músculo.</li>
	<li>Cambie la lente objetivo a una lente 40x de inmersión en agua(Tabla de materiales)y sumerja la lente en PBS para ver el embrión.<ol>
<li>Utilice la microscopía de fluorescencia para comprobar la morfología neuronal marcada por anti-HRP Cy3 y determinar el lugar de inyección.</li>
		<li>Durante la inyección, utilice la microscopía de campo brillante para ver la gota de tinte. Cuando el embrión esté enfocado, cambie la posición del micropipeta para establecer un contacto suave con la punta del axón de interés (por ejemplo, aCC, RP3).</li>
		<li>Suelte el tinte en un hemi-segmento abdominal derecho (A2-A6) en la unión neuromuscular de aCC o RP3(Figura 3)con DiD o DiO, utilizando las neuronas marcadas por anti-HRP Cy3. Uso del control manual (ratón; Figura 2, 5) liberar el tinte y quitar el micropipeta después de dejar caer el tinte con el micromanipulador y pasar al siguiente lugar de inyección. NOTA: A diferencia de otros tintes (por ejemplo, amarillo Lucifer, calceína) que se propagan a las células vecinas a través de uniones de separación, los tintes lipofílicos se asocian con las membranas celulares y no se transfieren a los vecinos. Debido al tamaño relativamente grande de la gota de tinte, sin embargo, esta técnica también resulta en el etiquetado de los músculos asociados(Figura 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar la muestra a RT durante 1 h después de la gota de tinte antes de la toma de imágenes. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí antes del montaje, y la muestra se puede mantener a 4 oC durante la noche. Los disteéticos lipofílicos también se pueden administrar utilizando iontoforesis, si un amplificador intracelular de acoplamiento directo (DC) está disponible20.</li>
</ol>7. Imágenes con un microscopio confocal
<ol><li>Retire la cinta de doble cara y la cinta de vinilo de la corredera de vidrio con la ayuda de fórceps.</li>
	<li>Preparar un resbalón de la cubierta (22 x 22 mm2 Vidrio de cubierta No.1) con una pequeña cantidad de grasa al vacío(Tabla de Materiales)en las cuatro esquinas y colocar cuidadosamente en la muestra, evitando las burbujas de aire. Elimine cualquier exceso de PBS con limpiaparabrisas de tareas.</li>
	<li>Empuje hacia abajo el deslizamiento de la cubierta para ajustar la distancia de trabajo entre la lente objetivo y la muestra. Selle completamente los bordes del deslizamiento de la cubierta con esmalte de uñas.</li>
	<li>Imagen a 10x y 100x aumento utilizando un microscopio confocal.</li>
	<li>Utilice el software ImageJ para procesar imágenes raw desde el microscopio(Tabla de materiales). NOTA: La observación debe comenzar dentro de los 10 minutos después del montaje para obtener las mejores imágenes. De lo contrario, en RT, el tinte se extenderá a sitios adyacentes al lugar de inyección creando fondo no deseado para la toma de imágenes. Para ralentizar la difusión del tinte, la muestra se puede almacenar a 4 oC durante un par de horas.</li>
</ol>

<ol><li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li>
<li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%3A+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62(2012).</li>
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<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150(2013).</li>
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<li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robo+and+Frazzled%2FDCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso del etiquetado de tintes para estudiar la morfología neuronal tiene varias ventajas sobre las técnicas genéticas de etiquetado celular. La técnica de etiquetado de tintes puede minimizar la cantidad de tiempo necesario para etiquetar e tomar imágenes de las morfologías de las neuronas motoras. El proceso de etiquetado del tinte es bastante rápido, ya que toma menos de 2 h y nos permite definir el contorno de las proyecciones neuronales. Como alternativa, se puede visualizar la neurona motora aCC eligiendo una líne...

El sistema de neuronas motoras embrionarias de Drosophila ofrece un potente modelo experimental para analizar los mecanismos subyacentes al desarrollo del sistema nervioso central (SNC)1,2,3. El sistema de neuronas motoras es susceptible de técnicas bioquímicas, genéticas, de imágenes y electrofisiológicas. Utilizando las técnicas, las manipulaciones genéticas y los análisis funcionales se pueden llevar a cabo a nivel de neuronas motoras individuales2,4,5,6.
Durante el desarrollo temprano del sistema nervioso, los neuroblastos se dividen y generan un gran número de glia y neuronas. La relación espaciotemporal entre la delaminación y el perfil de expresión génica de los neuroblastos se ha investigado previamente en detalle7,8,9. En el caso del sistema de neuronas motoras, la formación de unión neuromuscular embrionaria (NMJ) se ha estudiado ampliamente utilizando el aCC (célula de esquina anterior), RP2 (camarón crudo 2), y las neuronas motoras RP52,10. Por ejemplo, cuando la neurona motora RP5 forma una unión sináptica naciente, la filopodia presináptica y postsináptica se entremezclanitora 11,12,13. Dicha comunicación celular directa es vital para iniciar la formación de NMJ. Contrariamente a lo que sabemos sobre las ramas nerviosas periféricas, nuestro conocimiento de cómo las dendritas motoras inician la conectividad sináptica dentro del SNC sigue siendo primitivo.
En este informe, presentamos una técnica que permite el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en embriones mediante la administración mediada por micropipette de colorantes lipofílicos. Esta técnica nos permite rastrear las 38 neuronas motoras que inertan cada uno de los 30 músculos de la pared corporal en un hemisegmento a las 15 h después de la puesta de huevos (AEL)14. Mediante el uso de esta técnica, nuestro grupo ha investigado a fondo numerosos alelos de ganancia de función/pérdida de función15,16,17. Recientemente hemos desentrañado los mecanismos moleculares que impulsan el inicio de la conectividad de dendrita motora y hemos demostrado que una interacción Dscam1-Dock-Pak define el sitio de crecimiento de dendrita en la neurona motora aCC17. En general, esta técnica es adaptable para el análisis fenotípico de cualquier neurona motora embrionaria en cepas de tipo salvaje o mutantes, mejorando nuestra capacidad de proporcionar nuevos conocimientos sobre el diseño funcional del sistema nervioso Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Lente de objetivo 10x</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan</td></tr><tr><td>Lente de inmersión en agua de 40x</td><td>Nikon</td><td></td><td>NIR Apo</td></tr><tr><td>Tubo capilar</td><td>Frederick Haer& Co</td><td>27-31-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td>Dragonfly Unidad confocal de disco giratorio</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Corning</td><td></td><td>22x22 mm Cuadrado #1</td></tr><tr><td>DiD</td><td>ThermoFisher</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>ThermoFisher</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>ThermoFisher</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>SMZ-U</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Grasa de alto vacío</td><td>Fisher Sci.</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Jaula de recolección de huevos</td><td>FlyStuff</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 5247</td><td>Eppendorf</td><td>descatalogado</td><td>FemtoJet 4i (n.º de cat 5252000021)</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Software de procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Biseladora de micropipetas</td><td>Sutter</td><td>BV-10-B</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de agujas</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Agar de uva Polvo Paquetes de premezcla</td><td>FlyStuff</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de red de nailon</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 16%, grado EM</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica 15710</td><td></td><td>Cualquier grado</td></tr><tr><td>EM PBS</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td>Vendido en sigmaaldrich, solución 10x</td></tr><tr><td>en caja Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>146 4510</td><td>Agente humectante</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia vertical</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Eclipse Ci con una fuente de luz LED</td></tr><tr><td>Cinta aislante de vinilo</td><td>Scotch</td><td>6143</td><td></td></tr><tr><td>VWR Coladores de celdas VWR</td><td></td><td>10199-659</td><td></td></tr><tr><td>Levadura</td><td>FlyStuff</td><td>62-103</td><td>Levadura seca activa (RED STAR)</td></tr></tbody></table>

seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Describimos una técnica para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en Drosophila. Usamos un tinte lipofílico disuelto con aceite y entregamos una pequeña gota a una preparación de filete embrionario por un microinyector. Cada neurona motora cuya membrana es contactada por la gota puede entonces ser etiquetada rápidamente. Las neuronas motoras individuales se etiquetan continuamente, lo que permite visualizar claramente los detalles estructurales finos. Dado que los colorantes lipofílicos vienen en varios colores, la técnica también proporciona un medio para conseguir neuronas adyacentes etiquetadas en multicolor. Esta técnica de rastreo es por lo tanto útil para el estudio de la morfogénesis neuronal y la conectividad sináptica en el sistema de neuronas motoras de Drosophila.

Una imagen representativa de las neuronas motoras aCC y RP3 se muestra en la Figura 3C para demostrar el etiquetado multicolor de las neuronas motoras a 15 h AEL. Sus morfologías dendríticas son en gran medida invariables entre embriones. El patrón de tinción obtenido con anticuerpos anti-HRP se muestra en gris. Una pequeña gota de DiO o DiD fue depositada en el NMJ del músculo 1 o 6/7, respectivamente. La Figura 4 demuestra la capacidad de medi...

Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

La técnica de rastreo descrita en este protocolo nos ayuda a estudiar la morfogénesis neuronal y a romper la conectividad en el sistema de neuronas motoras de Drosophila. El tinte lipofílico puede difundirse rápidamente en cada parte de la membrana celular con una densidad extremadamente alta. Esta es la razón por la que nuestro protocolo se resuelve eficientemente para encontrar estructuras de una neurona etiquetada.Si se puede acceder a un terminal de axón con una micropipeta de inyección, esta técnica podría aplicarse a cualquier neurona en las etapas larvarias y adultas de las moscas o en otros organismos. Si no tiene experiencia diseccionando o utilizando un microinyector preciso la operación en la muestra, puede ser difícil. Comprender la anatomía del embrión, ayudará con la orientación a la porción adecuada de herramientas para llevar a cabo la disección o una inyección.Para empezar, preparar y diseñar todos los materiales de recolección de embriones. Prepare el aparato de filtración cortando un tubo de 50 mililitros y abriendo un agujero en la tapa. A continuación, establezca un filtro de malla con poros de 100 micrómetros entre el tubo y la tapa.Prepare la micropipeta de inyección de tinte y la aguja de disección del mismo tubo capilar con un diámetro interior de 1,2 milímetros. Tire del tubo con una micropipeta, tire al 7% de la salida máxima de 170 voltios para crear una aguja afilada con un cónico de aproximadamente 0,4 centímetros de longitud. Para preparar la micropipeta de inyección de tinte, remoje la amoladora con un agente humectante y coloque la aguja en la abrazadera de micropipeta a 25 a 30 grados.A continuación, baje la punta en dos tercios del radio desde el centro de la superficie biselada. Moler la aguja mientras una jeringa con tubo empuja el aire hacia ella. Marque la micropipeta con un marcador permanente de punta fina para indicar la posición de la abertura en la punta después del biselado, ya que puede ser difícil localizar la abertura estrecha que se forma en un ángulo.Deje que las moscas pongan huevos durante la noche a temperatura ambiente y recoja la pipa con los huevos por la mañana. Para recoger los embriones, desclorina los huevos en la placa con 50% de lejía durante cinco minutos. Una vez que los cloriones se hayan despejado, vierta el contenido de la placa a través del aparato de filtración o colador celular para aislar los embriones.Utilice una botella de agua para diluir la lejía que queda en la placa y reunir tantos embriones como sea posible decantando la mezcla en el filtro. Lave los embriones de tres a cuatro veces con agua hasta que el olor a lejía se disipe. Retire el filtro del aparato y lávelo en otra placa limpia con agua.A continuación, decantar el agua de la nueva placa en la que están los embriones. Utilice fórceps finos para seleccionar de cinco a 10 embriones a las 15 horas después de la puesta del óvulo y colóquelos en cinta adhesiva de doble cara con el lado dorsal hacia arriba. Agregue la solución salina del marcador de insectos a la piscina de disección para proteger los embriones de la desceración.Utilice una aguja de vidrio bajo un microscopio de disección para arrastrar el embrión fuera de la membrana de inclinación media de la cinta al vidrio, teniendo cuidado de no dañar los tejidos interiores del embrión. Luego corta a través de la línea media de un solo embrión en su superficie desde su extremo posterior hasta el extremo anterior. Voltee los tejidos epiteliales desde el centro y conecte el borde epidérmico sobre la superficie del portaobjetos de vidrio.Utilice una aguja conectada al tubo con una abertura de punta de unos 300 micrómetros para aspirar o soplar aire para extraer los troncos traqueales longitudinales dorsales, así como los intestinos restantes. Utilice 4%PFA y PBS para fijar los embriones durante cinco minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital. A continuación, lávelos tres veces con PBS.Mancha los embriones con un microlitro de anticuerpo antirábano peroxidasa conjugado con tinte Cyanine3 y 200 microlitros de PBS durante una hora en el agitador orbital. Y repite los lavados en PBS. Para llenar la micropipeta de inyección, colóquela en el soporte capilar.A continuación, coloque el tinte deslizar en el escenario y utilice el micromaniprógrafo para colocarlo sobre la diapositiva. A continuación, ajuste el escenario para colocar la micropipeta en el tinte. Recoger el tinte en la micropipeta ajustando la presión de inyección a entre 200 y 500 hectopascal, el tiempo de inyección entre 0,1 y 0,5 segundos y la presión de compensación a cero durante cinco minutos.Una vez recogido el tinte, retire el tobogán del tinte y coloque la muestra en la etapa del microscopio. A continuación, aumente la presión de compensación a un rango de 30 a 60 hectopascale y baje la micropipeta en la muestra. Utilice la lente objetivo 10 veces para localizar el embrión y alinear la micropipeta con el embrión.Cambie la lente objetivo a una lente de inmersión en agua 40 veces. Y sumerge la lente en el PBS. Utilice microscopía de fluorescencia para comprobar la morfología neuronal marcada por anti-HRP Cy3 y determinar el lugar de inyección.Cuando el embrión está enfocado, cambie la posición de la micropipeta para hacer contacto suave con la punta del axón de interés. A continuación, utilice una microscopía de campo brillante durante la inyección para ver la gota de tinte. Suelte el tinte en el hemisegmento abdominal derecho en la unión neuromuscular de aCC o RP3 con DiD o DiO.Utilice el control manual para liberar el tinte y retirar la micropipeta. A continuación, pase al siguiente lugar de inyección. Incubar la muestra durante una hora a temperatura ambiente en un agitador orbital antes de la toma de imágenes.Con fórceps finos, retire las cintas de la corredera de vidrio. Para montar la muestra, prepare un resbalón de cubierta con una pequeña cantidad de grasa al vacío en las cuatro esquinas. Lo colocó cuidadosamente en la muestra, asegurándose de evitar las burbujas de aire.Empuje hacia abajo el resbalón de la cubierta para ajustar el espacio de la muestra para permitir la distancia de trabajo entre la lente objetivo y la diapositiva. Elimine cualquier exceso de PBS con toallitas de tareas. Selle completamente los bordes del resbalón de la cubierta con esmalte de uñas.Imagen a 10 veces y 100 veces la ampliación con un microscopio confocal y procesar las imágenes, con el software imageJ. Este protocolo se utilizó para retrógrado etiquetar la neurona motora aCC inervando músculo uno y la neurona motora RP3 inervando los músculos seis y siete. Las ramas dendríticas de las neuronas motoras ACC y RP3 muestran una superposición extensa.Ambas neuronas son bipolares, estableciendo dos poblaciones diferentes de dendritas. Para demostrar las capacidades cuantitativas de este método, el número total de puntas de dendrita se contó en mutantes de tipo salvaje y Dscam1. Las dendritas ipsilaterales de aCC se muestran para el tipo salvaje, pero se observaron pocas dendritas ipsilaterales para el mutante Dscam1.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tamaño de la gota de tinte es crucial, que es aproximadamente 10 a 20 micrómetros. Pruebe el tamaño en la cinta de doble cara y luego aplíquelo en el lugar de inyección. Usando este procedimiento, podemos aprovechar la propiedad foto conmutable de la sonda DiD para obtener imágenes de súper resolución de la membrana plasmática.De esta manera podemos estudiar la caracterización ultra estructural de las membranas sinápticas en la unión neuromuscular. Hicimos el clic. Realizamos análisis fenotípicos de las dendritas de ACC en cepa mutante, y descubrimos que una inyección Dscam1-Dock-Pak define el sitio del crecimiento de dendrita en aCC.

retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describen las características estructurales de la sinapsis neuromuscular Glia-en una nueva preparación de tejidos de adentro hacia afuera de las larvas de mosca en directo con tintes fluorescentes con microscopía confocal. Hemos marcado terminales de las neuronas en vivo con anticuerpos fluorescentes primaria de HRP, y también se visualiza el espacio perisynaptic con dextranos fluorescentes.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

Este protocolo describe la disección en vivo...

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Este video muestra un protocolo para estudiar el reciclaje de vesículas sinápticas en las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila que expresan canalrodopsina utilizando un colorante fluorescente. La luz azul activa las canalrodopsinas, causando la entrada de calcio y la exocitosis de las vesículas sinápticas. El tinte se integra en las membranas neuronales y se internaliza durante la endocitosis, lo que da lugar a una mayor fluorescencia. Una mayor estimulación de la luz azul induce...

Análisis del reciclaje de vesículas sinápticas y la absorción de colorantes fluorescentes en larvas de Drosophila

Fuente: Inal, M. A. et. al., Trazado retrógrado de Drosophila neuronas motoras embrionarias utilizando tintes fluorescentes lipofílicos. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el método de etiquetado retrógrado de las neuronas motoras Drosophila utilizando tintes lipofílicos. El tinte entra en el axón, viaja retrógradamente y etiqueta las neuronas de color verde, lo que permite una visualización detallada de su morfología y proyecciones bajo un microscopio confocal.

Marcaje retrógrado de neuronas motoras de Drosophila mediante colorantes lipofílicos fluorescentes

Fuente: Guan, W., et. al. Visualiza Drosophila Axones de la neurona motora de la pierna a través de la cutícula adulta. J. vis. exp. (2018) Este video muestra imágenes de Drosophila patas con neuronas motoras fluorescentes verdes que expresan proteínas utilizando microscopía confocal. Un láser y dos detectores capturan la GFP y la autofluorescencia de la cutícula. Las imágenes se procesan dividiendo canales, restando la autofluorescencia y fusionándose en una imagen compuesta en color para...

Imágenes de neuronas motoras marcadas con fluorescencia en una pata adulta de Drosophila

Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Aquí se describe un protocolo para visualizar la orientación axonal con una proteína fluorescente en piernas de adultos del Drosophila por fijación, montaje, proyección de imagen y la proyección de imagen de pasos.

Visualizar Drosophila pierna axones de la neurona de Motor a través de la cutícula del adulto

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

Aquí, se describen métodos no invasivos para la localización de proteínas de membrana fotorreceptoras y la evaluación de la degeneración retiniana en el ojo compuesto de Drosophila utilizando fluorescencia eGFP.

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP

Aprende el trazado retrógrado de neuronas motoras en Drosophila utilizando colorantes lipofílicos fluorescentes. Esta técnica permite visualizar la morfología y conectividad neuronal en etapas embrionarias, larvarias y adultas.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

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