Name: Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Aprende a correlacionar actividad de calcio con expresión génica en células individuales de Xenopus laevis mediante imagen fluorescente e hibridación in situ. Este protocolo permite estudiar relaciones autónomas celulares en neurociencia.

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Agradecemos a Wendy Herbst y Lindsay Schleifer por sus contribuciones al desarrollo de estos protocolos. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 y 1R15HD096415-01) a MSS.

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</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Se han observado patrones característicos de actividad cálcica en las células que componen el sistema nervioso en desarrollo, con tipos específicos de actividad asociados con procesos de neurodesarrollo distintos. Sin embargo, una mayor comprensión de los mecanismos por los cuales estos patrones de actividad de gran densidad de información se traducen en respuestas transcripcionales requiere que la información sobre la actividad del calcio y la expresión génica se recopile con resolución de una sola célula. Mientras que los sistemas que exhiben más actividad estereotipada del calcio, como las neuronas maduras, se pueden ensayo razonablemente a granel, los patrones irregulares que caracterizan el sistema nervioso embrionario se enmascaran fácilmente con grabaciones menos precisas.
El marco experimental establecido en este protocolo es fácilmente adaptable a una amplia variedad de tipos de células y reporteros fluorescentes. El tejido que contiene prácticamente cualquier tipo de célula o combinación de tipos de células se puede diseccionar de un organismo modelo de interés y chapado para imágenes de una sola célula. Además de permitir la identificación celular y aislar el efecto de los procesos autónomos de células, un enfoque de cultivo celular primario permite al experimentador definir los componentes de medios como desee. Por ejemplo, se han realizado experimentos que comparan la actividad de precursores neuronales en la solución de 2 mM Ca2+ para investigar si las relaciones entre la frecuencia de los picos y el fenotipo de neurotransmisores en la médula espinal embrionaria pueden recapitularse sin la influencia de las interacciones célula-célula13,20.
Si bien este protocolo aprovecha el marcador fluorescente Fluo4-AM para detectar la actividad de calcio intracelular, dependiendo de los criterios de selección, los usuarios pueden seleccionar otros marcadores disponibles comercialmente21,incluyendo indicadores de calcio codificados genéticamente. Del mismo modo, se podrían utilizar marcadores alternativos para monitorear los cambios dinámicos en la concentración de un ion de interés (incluyendo K+, Na+, y Zn2+),potencial de membrana o pH celular. La configuración de imágenes y la duración de la imagen se pueden modificar según sea necesario.
Aunque correlacionamos la actividad del calcio y el fenotipo neuronal como una aplicación específica, este método también es aplicable para una variedad de otras propiedades celulares. Por ejemplo, la hibridación in situ por fluorescencia se puede realizar con sondas contra cualquier gen de interés, incluyendo el marcador neuronal ChAT o el factor de transcripción Engrailed, permitiendo la detección sensible de un panel personalizable de especies de ARNm. Estas sondas se pueden diseñar para ser específicas de isoformas, soportando la especificidad de destino adicional si se desea. Double FISH se puede realizar utilizando sondas conjugadas con varios dos fluoróforos diferentes, permitiendo la evaluación simultánea de la expresión de múltiples genes. Sin embargo, los lavados adicionales requeridos por este tipo de experimento se asocian con una mayor probabilidad de pérdida o movimiento celular y requieren experiencia y delicadeza para realizarse con éxito.
Independientemente de las modificaciones específicas del experimento realizadas en este protocolo, hay varios pasos clave que requieren una atención cuidadosa. Las disecciones deben realizarse con cuidado para eliminar todos los tejidos contaminantes o las poblaciones celulares; debido a que el patrón espacial se pierde cuando los explantes se disocian, las células restantes de los tejidos vecinos se intercalarán e indistinguibles de las células de interés. Después de que las células estén chapadas, las muestras deben manipularse con la la forma más suave posible para evitar que las células se desalojen. Lo más importante es que esto significa que todos los cambios en la solución deben realizarse lenta y cuidadosamente, con la pipeta colocada en el borde de la placa cuando la solución se está retirando y agregando. Esto asegurará que las células se puedan identificar con confianza en imágenes de calcio y FISH. Si las celdas se interrumpen durante el procesamiento, puede ser imposible identificar algunas o todas las celdas correspondientes entre las dos imágenes. Aconsejamos erring en el lado de la precaución con estas asignaciones, de tal manera que sólo inequívocamente las células correspondientes se utilizan para el análisis posterior.
Dependiendo de la cuestión biológica que se trate, una variedad de enfoques de análisis pueden ser apropiados. La actividad de calcio en serie temporal se puede procesar y cuantificar de diversas maneras, con flexibilidad del experimentador a la hora de elegir parámetros de destendencia, métricas de análisis y parámetros de análisis (por ejemplo, el % del umbral de línea base utilizado para definir un pico de calcio). Las correlaciones entre la actividad del calcio y el nivel de expresión génica se pueden dibujar analizando la expresión génica como un valor de fluorescencia absoluto o relativo extraído de la imagen FISH. Alternativamente, las correlaciones entre la actividad del calcio y la expresión génica (presencia/ausencia) se pueden extraer definiendo un umbral de fluorescencia para la señal de expresión génica positiva y asignando identificadores de "sí" o "no" a células individuales. En su conjunto, este esquema experimental proporciona una canalización increíblemente flexible para la recopilación y el análisis preliminar de datos de series temporales junto con datos de expresión génica coincidentes con células. Tales experimentos serán críticos para comprender mejor las complejas relaciones entre la dinámica celular y los cambios transcripcionales, como lo ejemplifica la identificación de patrones de actividad de calcio característicos de los precursores neuronales con engorde inhibidor y excitatorio en Xenopus laevisembrionario.

El calcio citosólico libre es fundamental para una variedad de procesos biológicos, que van desde la proliferación celular y la migración a la apoptosis y la autofagia1,2,3. Dentro de estas vías, el calcio puede ejercer efectos aguas abajo sobre la expresión génica interactuando con dominios de unión al calcio para inducir cambios conformacionales que modulan la actividad proteica y las interacciones. Por ejemplo, un sensor de calcio neuronal conocido como el modulador antagonista del elemento regulador descendente (DREAM) se mantiene en una conformación intermedia desdoblada cuando está unido por calcio, evitando que interactúe con sus objetivos de proteína y ADN4. Sin embargo, más allá de servir como una molécula de señalización simple, la naturaleza dinámica de los transitorios de calcio intracelular permite que estos patrones de actividad codifican señales más complejas basadas en amplitud o frecuencia5,6. La translocación nuclear del factor de transcripción nuclear de las células T activadas (NFAT) se ve reforzada por oscilaciones de calcio de alta frecuencia, pero inhibida por oscilaciones de baja frecuencia7. Con tende de ello, un trabajo reciente ha sugerido que NFAT puede responder a la exposición acumulativa al calcio8. Tanto la calcineurinacomola proteína quinasa II dependiente de La calmodulina /calmodulina II (CaMKII) también presentan respuestas distintas a los transitorios de calcio de una frecuencia, duración o amplitud9específicas. Para añadir un nivel adicional de complejidad regulatoria, los modelos computacionales sugieren que muchas proteínas de unión al calcio aguas abajo se vuelven más o menos dependientes de la frecuencia en respuesta a la presencia o ausencia de competidores de unión10,11.
Dentro del sistema nervioso en desarrollo, dos clases principales de comportamientos de actividad del calcio se han definido y asociado con procesos biológicos específicos. Las afluencias de calcio se clasifican como "picos" si se producen dentro de las células individuales, alcanzan una intensidad máxima del 400% de la línea de base en cinco segundos y presentan una doble decaimiento exponencial12. Este tipo de señal se asocia principalmente con neurotransmisor fenotipo especificación13. Por el contrario, las "ondas" se definen como transitorios de calcio más lentos y menos extremos en los que la concentración de calcio intracelular de una célula se eleva a 200% de la línea de base durante un período de treinta segundos o más, y luego se descompone durante varios minutos12. Estas señales a menudo se propagan a través de múltiples células vecinas, y su presencia se ha asociado con el crecimiento de neurita y la proliferación celular14,15. Sin embargo, aunque estas dos clases se han definido en función de perfiles cinéticos característicos, sigue sin estar claro exactamente qué características de estos patrones están siendo detectadas por las células y traducidas por los efectores descendentes.
Comprender la relación entre las oscilaciones de calcio intracelular y la expresión génica proporcionaría una visión crucial de uno de los mecanismos reguladores que garantiza el desarrollo y el patrón adecuados del sistema nervioso. Con este fin, los estudios de la médula espinal embrionaria han demostrado que el aumento de la actividad del pico de calcio durante el desarrollo se asocia con niveles más altos de neuronas inhibitorias, mientras que la disminución de la actividad del pico de calcio se asocia con niveles más altos de neuronas excitatorias13. Sin embargo, estos ensayos a nivel de población no se han utilizado para asociar la actividad del calcio con la expresión génica a nivel de una sola célula.
Abordar estas preguntas en el nivel de la celda única ofrece varias ventajas distintas sobre el trabajo anterior. Por un parte, la capacidad de evaluar la actividad del calcio y la expresión génica en muchas células individualmente permite observar el repertorio completo de patrones de actividad distintos sin ser ofuscado por una medición a granel. Además, el estudio de estas relaciones en el cultivo primario de una sola célula significa que se mantendrán los vínculos autónomos celulares entre la actividad del calcio y la expresión génica, mientras que las interacciones que requieran comunicación de células celulares serán abrogadas. Por lo tanto, este enfoque permite que estos mecanismos autónomos celulares se estudien de forma aislada. Sin embargo, también permite que el papel de la actividad de calcio no autónoma de las células sea esclarecido e interrogado. Por ejemplo, las células se pueden diseccionar de un embrión en la etapa de la placa neural, cultivadas hasta que los controles del hermano alcanzan la etapa del tubo neural y luego se comparan con las células que se han diseccionado recientemente desde un embrión en etapa del tubo neural. Esto permite la comparación directa de las células que retuvieron la comunicación de células celulares a través de un período clave de desarrollo con aquellas en las que se abolió la comunicación de células celulares.
Al tratar de abordar las limitaciones de los enfoques experimentales anteriores, desarrollamos un protocolo que permitiría evaluar tanto la actividad del calcio como la expresión génica en células progenitoras neuronales individuales, facilitando la correlación de patrones de actividad específicos con programas de diferenciación posteriores. El tejido neural se diseccionó de Xenopus laevis en varias etapas del desarrollo neuronal, se disociaba en células individuales e se imageó mediante microscopía confocal en presencia de un indicador de calcio fluorescente. Después de las imágenes de células vivas, las muestras se fijaron y analizaron mediante hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de un gen o isoforma de interés. Es importante destacar que las células individuales se pueden realizar un seguimiento de ambos experimentos de diagnóstico por imágenes, lo que significa que el perfil de actividad de calcio de una célula y su nivel de expresión génica se pueden asociar entre sí(Figura 1). El protocolo aquí indicado está destinado a sondear las relaciones entre los patrones de actividad del calcio y la expresión génica a través del neurodesarrollo embrionario en Xenopus laevis. Sin embargo, el marco experimental más amplio (imágenes de curso de tiempo de una sola célula seguidas de FISH y el registro de imágenes) se puede modificar y aplicar a prácticamente cualquier tipo de célula, reportero fluorescente y gen de interés.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Para la cría de animales & Cultivo celular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHORULON (gonodotropina coriónica)</td><td>Merck Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal de sulfato de gentamicina</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri Pyrex, 100 mm x 20 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3160102</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos Corning Falcon de fácil agarre, 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos Corning Falcon de fácil agarre, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placas de cultivo de tejidos estándar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Placas de Petri, plato de 35x10 mm, Nunclon Delta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables estándar de Fisherbrand, no graduadas; Longitud: 5.875 pulg.; Capacidad: 7.7 mL</td><td>Pinzas Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato</td><td>Millipore Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa B</td><td>Millipore Sigma</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzas, Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5, Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Cellattice Superficie de cultivo celular microrrayada</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CLS5-25D-050</td><td></td></tr><tr><td>para imágenes de calcio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, permean células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0.2 y micro; m filtrado (solución al 10% en agua)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P6866</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>para la generación de sondas de ARN</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de minipreparación de plásmidos PureYield</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>rATP</td><td>Promega</td><td>P1132</td><td></td></tr><tr><td>rCTP</td><td>Promega</td><td>P1142</td><td></td></tr><tr><td>rGTP</td><td>Promega</td><td>P1152</td><td></td></tr><tr><td>rUTP</td><td>Promega</td><td>P1162</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-UTP</td><td>Millipore Sigma</td><td>3359247910</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la rnasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>T3 ARN polimerasa</td><td>Promega</td><td>P2083</td><td></td></tr><tr><td>T7 ARN polimerasa</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>SP6 ARN polimerasa</td><td>Promega</td><td>P1085</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Dnasa sin ARNasa</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>LiCl Solución de precipitación (7,5 m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9480</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>para hibridación in situ de fluorescencia</anhídrido acético fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Thermo 320102Fisher</td><td></td><td></td>Scientific<td></td></tr> <tr><td>reactivo bloqueante</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>11096176001</tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-POD, Fab Fragments</td><td>Millipore Sigma</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td><td>Millipore Sigma</td><td>GEPA13105</td><td></td></tr><tr><td>Solution Components</td>Cloruro de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>calcio, 96% extra puro, en polvo, anhidro, ACROS Organixs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC349610</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hidratado</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Denhardt (50X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>DTT, grado molecular (DL-ditiotreitol)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético</td><td>Millipore Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Formamida (desionizada)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Herparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (ultra puro)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>Millipore Sigma</td><td>H1109</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Millipore Sigma</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio, puro, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio, 97% puro, ACROS Organixs, anhidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC413480050</td><td></td></tr><tr><td>Ácido maleico, 99%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>ACS125231000</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (Cristales Blancos Finos/Biología Molecular), Fisher BioReactivos</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ribonucleico de levadura torula, Tipo IX</td><td>Millipore Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Millipore Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow</td><td>Hood modelo de</td><td></td><td></td>elección</tr><tr><td>Microscopio</td><td>de</td><td></td><td></td> disección</tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida</td><td>Nikon</td><td>TE200</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Software de imagen</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitación</td><td>modelo de</td> elección Centrífuga refrigerada modelo de <td></td><td></td></tr><tr><td>elección</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Varios</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtro de vacío con tapa de botella Corning, 0.22 &mu; mporo, capacidad de botella de 500 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

La actividad espontánea del calcio intracelular se puede observar en una variedad de tipos de células y se propone desempeñar un papel crítico en una variedad de procesos fisiológicos. En particular, la regulación adecuada de los patrones de actividad del calcio durante la embriogénesis es necesaria para muchos aspectos del desarrollo neuronal de vertebrados, incluyendo el cierre adecuado del tubo neural, la sinaptogénesis y la especificación del fenotipo del neurotransmisor. Si bien la observación de que los patrones de actividad del calcio pueden diferir tanto en frecuencia como en amplitud sugiere un mecanismo convincente por el cual estos flujos podrían transmitir señales codificadas a los efectores aguas abajo y regular la expresión génica, enfoques a nivel de la población han carecido de la precisión necesaria para seguir explorando esta posibilidad. Además, estos enfoques limitan los estudios del papel de las interacciones células-células al excluir la capacidad de determinar el estado de la determinación neuronal en ausencia de contacto entre células. Por lo tanto, hemos establecido un flujo de trabajo experimental que combina imágenes de calcio de lapso de tiempo de explantes neuronales disociadas con un ensayo de hibridación in situ de fluorescencia, permitiendo la correlación inequívoca del patrón de actividad del calcio con el patrón molecular fenotipo en un nivel de una sola célula. Pudimos utilizar con éxito este enfoque para distinguir y caracterizar patrones específicos de actividad de calcio asociados con la diferenciación de células neuronales y células progenitoras neuronales, respectivamente; más allá de esto, sin embargo, el marco experimental descrito en este artículo podría adaptarse fácilmente para investigar correlaciones entre cualquier perfil de actividad de serie temporal y la expresión de un gen o genes de interés.

En la Figura 2Ase puede ver un ejemplo exitoso de células disociadas preparadas para la toma de imágenes de calcio. Las celdas están densamente chapadas, lo que permite recopilar la máxima cantidad de información de cada imagen, pero no tan densamente chapadas que las celdas individuales no se pueden distinguir con confianza entre sí. La fluorescencia se detecta para cada célula definida durante el período de imágenes de 2 h. La visualización de una gráfica compuesta que contiene las trazas de todas las celdas registradas en un experimento revela el grado en que las mediciones a granel o de población pueden oscurecer patrones más matizados de comportamiento de pico(Figura 2B). Cuando se aíslan los perfiles registrados de células individuales, se pueden identificar claramente ejemplos de la actividad irregular de picoteo característica de las células progenitoras neuronales. A diferencia de las neuronas maduras, las células neuronales embrionarias presentan naturaleza irregular, altamente variable y compleja de la actividad del calcio(Figura 2B). Para cuantificar esta complejidad, se ha aplicado la aplicación de diferentes métodos de análisis de datos17,18, incluyendo diversos parámetros para definir un pico(Figura 2C).
La hibridación in situ por fluorescencia exitosa, incluido el diseño y la síntesis exitosos de una sonda de ARNm antisentido, se puede evaluar comparando la placa experimental con un control de fondo incubado con un control de ARN de detección no vinculante(Figura 3A,B). Un control de sonda positivo también se puede realizar procesando un tipo de celda conocido por expresar el ARNm de destino en niveles detectables.
La identificación de la misma célula a través de imágenes de calcio y FISH requiere que las células conserven aproximadamente la misma posición durante la hibridación y el procesamiento de la sonda. Si las placas se manipulan de forma aproximada o los lavados se realizan con demasiada fuerza, las células se pueden desalojar de la superficie de la placa y se pueden perder cuando la solución se desecha o se deposita en una ubicación diferente en la placa, lo que hace imposible que se hagan coincidir a través de las imágenes(Figura 4A). Si esta interrupción afecta solamente algunas de las celdas en el campo de visión, todavía puede ser posible detectar y asignar algunas celdas dentro de la imagen(Figura 4B). Sin embargo, la cantidad máxima de datos se obtiene de un experimento en el que FISH se realiza cuidadosamente y pocas celdas se pierden o se reposicionan entre imágenes(Figura 4C).
Una vez que se han recopilado datos para describir tanto la actividad del calcio como la expresión génica de un número razonable de células en la etapa de desarrollo de interés, se pueden realizar análisis adicionales para evaluar las correlaciones entre estas dos características(Figura 1). Se han aplicado una serie de métricas para cuantificar los patrones de actividad del calcio, incluyendo el recuento de picos/frecuencia, la potencia media, la estimación del exponente de Hurst y la medición de la entropía de Markovian17,18. La expresión génica puede definirse cuantitativamente por nivel absoluto de fluorescencia o calificarse en una escala binaria (sí/no), dependiendo de las preguntas experimentales que se aborden.
Los resultados de experimentos que cotejaron la actividad del calcio con la expresión de genes marcadores progenitores neuronales revelaron numerosas asociaciones entre patrones específicos de actividad del calcio y fenotipos de neurotransmisores. En la etapa de la placa neural (etapa 14), las células GABAérgicas que expresan el marcador de neurona inhibitoria gad1.1 exhiben actividad de calcio que es más regular y de mayor amplitud que la de las células que carecen de expresión gad1.1 (Figura 5A). Además, mientras que estas células gad1.1-expressing se asocian con niveles más altos de pico de gran amplitud, el pico de baja amplitud es más frecuente en las células glutamatérgicas que expresan el marcador de neurona excitatoria slc17a7.
<img alt="Análisis de tejido neural; pasos: disección, siembra celular, imágenes de Ca²⁺, FISH, superposición de imágenes; diagrama." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Esquema del flujo de trabajo experimental. Barra de escala a 100 m. Las imágenes en los paneles 3-5 fueron tomadas de Paudel et al. (2019)17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Microscopía de fluorescencia, análisis espectral y cuantificación de señales; Diagrama de expresión de proteínas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Imágenes de calcio y perfiles de actividad de ejemplo. (A) Actividad de calcio intracelular según lo informado por Fluo4-AM. Cada imagen de 2 h se compone de 901 marcos, con un marco representativo mostrar aquí. (B) Gráfica compuesta de intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo en todas las células dentro del campo de visión de imagen. Los rastros indican claramente fotoblanqueo de las horas extras del tinte indicador (Fluo4). La gráfica ráster en la parte superior izquierda muestra rastros representativos de la actividad del calcio después de la aplicación de un algoritmo de destendencia desarrollado por Eilers y Boelen19,donde las células que se muestran aquí exhiben diverso patrón de comportamiento de pico. (C) Aplicación de diferentes umbrales (150% y 200% de la línea de base, donde la línea de base es el promedio de intensidad fluorescente destendencia) para definir un pico (flechas verdes y azules). Barra de escala a 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imagen de microscopía de fluorescencia que compara la captación celular; panel A bajo, panel B alta fluorescencia roja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Imagen FISH. (A) FISH realizado con una sonda de ARN de detección no vinculante como un control negativo. Los ajustes de imagen se han ajustado para que ninguna célula parezca fluorescente. Algunos campos de visión pueden incluir desechos no celulares con cierta fluorescencia, como se ve en las esquinas superior derecha e inferior derecha de (A); estos pueden ser ignorados con el propósito de la configuración de fondo. (B) Los mismos ajustes de imagen se utilizan para crear una imagen de una placa experimental (sonda de ARN antisentido). La fluorescencia en estas condiciones corresponde a la expresión génica por encima del fondo. Barra de escala a 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de celdas que muestra el análisis de agrupamiento en el proceso A, B, C; los círculos rojo y verde se superponen." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Superposición de imágenes y registro de registro. Representaciones esquemáticas de una muestra de actividad de calcio (células representadas por círculos verdes rellenos) y después de FISH (células representadas por círculos rojos sombreados). (A) Las celdas que se han movido significativamente durante el manejo y procesamiento de muestras no se pueden identificar de forma fiable en las dos imágenes. (B) La interrupción de la celda puede afectar solo a algunas celdas en el campo de visión. Algunas células se pueden identificar claramente en ambas imágenes, mientras que otras no se pueden emparejar con confianza. (C) Si las muestras se manejan cuidadosamente, la mayoría de las células permanecerán intactas y se pueden identificar en ambas imágenes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Comparación de la entropía de Markov y la frecuencia de picos; los diagramas de caja muestran la variabilidad de los datos entre GABA y glutamato." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Un ejemplo de aplicación de este método, diagramas de caja que muestran asociaciones entre la actividad del calcio y la expresión génica (GABA y Glut para genes gad1.1 y slc17a7 respectivamente) en la etapa de placa neural Xenopus laevis. En la etapa 14, las células postivas (GABA) gad1.1 presentan una actividad de calcio más alta y más regular según lo definido por (A) Entropía de Markovian18 y (B) recuentos de picos utilizando umbrales 125%, 150%, 200% y 300% del promedio de la intensidad fluorescente destendencia (línea de base)17 que las células positivas slc17a7 (Glut). Las estrellas indican diferencias estadísticamente significativas de acuerdo con la prueba Kolmogorov-Smirnov de dos muestras corregida por Bonferroni (p &lt; 0,05) y las estadísticas d de Cohen para el tamaño del efecto (n a 5 cultivos y &gt;100 células; * 0,2 a á d a &lt; 0,5). La cifra fue redibujada y adaptada del conjunto de datos obtenido de Paudel et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Este protocolo se puede utilizar para correlacionar los patrones de actividad del calcio con la expresión génica a nivel de célula única, lo que permite a los investigadores investigar preguntas novedosas sobre las relaciones entre estas dos características. A diferencia de los enfoques anteriores, que suelen estudiar tejidos enteros, nuestra técnica se acerca al nivel de una sola célula, lo que nos permite evaluar las relaciones autónomas celulares entre la actividad del calcio y la expresión génica. Comience por esterilizar UV dos platos Petri de plástico de 35 milímetros y un plato de cultivo celular de 35 milímetros durante aproximadamente 30 minutos.Trabajando en la capucha de flujo laminar, agregue 10 mililitros de dos solución de calcio mili evolucionador a cada uno de dos tubos cónicos de plástico de 50 mililitros, una placa Petri esterilizada con UV y la placa de cultivo celular esterilizada con UV. Añadir dos mililitros de solución libre de calcio y magnesio a la otra placa Petri esterilizada con UV y llenar dos platos Petri de plástico de 100 milímetros y un plato Petri de plástico de 35 milímetros con 0.1X MMR complementado con gentamicina. A continuación, llene un plato Petri de plástico de 60 milímetros con 70% de etanol.Inmediatamente antes de la disección, mezcle a fondo 0,01 gramos de colágeno B en un tubo de solución de calcio. Añadir la solución a una nueva placa Petri de plástico de 60 milímetros y utilizar un microscopio de disección para identificar embriones de la etapa de desarrollo deseada. Utilice una pipeta de transferencia estéril para mover al menos seis embriones apropiados en una placa de 100 milímetros que contenga MMR más gentamicina.A continuación, mueva un embrión de la placa de retención a la segunda placa de 100 milímetros de MMR más gentamicina y coloque esta placa de disección bajo el microscopio. Usando un par de fórceps contundentes para estabilizar el embrión, despeje cuidadosamente la membrana vitellina que rodea el embrión con un par de fórceps finos. Cuando se haya eliminado toda la membrana, utilice los fórceps finos para pellizcar el embrión a lo largo del eje posterior anterior para separar las regiones dorsal y ventral.Utilice la nueva pipeta de transferencia estéril para transferir la parte dorsal a la placa de 60 milímetros de solución de collageno durante uno a dos minutos antes de transferir cuidadosamente la muestra de nuevo a la placa de disección. Para completar la disección, retire cuidadosamente toda la contaminación endodérmica y mesodérmica residual del tejido neural presuntivo del ectodermo y transfiera suavemente el explant a la placa de 35 milímetros de solución de calcio. Cuando se hayan recogido tres explantes más, utilice una micropipeta P1000 para transferir los cuatro explantes a la placa de 35 milímetros de solución libre de calcio y magnesio teniendo cuidado de evitar cualquier contacto entre los explantes y la interfaz de agua de aire.A continuación, gire suavemente el plato para que todos los explantes se agrupen en el centro de la placa e incubar los especímenes durante una hora a temperatura ambiente para permitir que los tejidos se disocien. Durante esta incubación, transfiera los dos últimos embriones al segundo plato de MMR con gentamicina, y cubra el plato para permitir que estos especímenes se desarrollen sin perturbaciones. Al final de la incubación, utilice súper pegamento para fijar un cubreobjetos micro-reglado en la parte inferior de la placa de cultivo celular de 35 milímetros y utilice una micropipeta P100 para recoger los explantes disociados.Sosteniendo la pipeta en un ángulo poco profundo cerca de la superficie de la placa de cultivo celular, coloque la punta de la pipeta en la esquina de la rejilla orientada hacia adentro y expulse firmemente la suspensión de la celda a través del área cuadriculada. Idealmente, las células se asentarán en un racimo apretado y denso. Deje que las células se adhieran a la placa durante una hora a temperatura ambiente.Mientras las células se están asentando, determine y registre la etapa de desarrollo de los embriones de control de hermanos. Al final de la incubación, mueva el plato de muestra a un lugar protegido por la luz y aspire 100 microlitros de solución desde el borde del plato. Mezclar esta solución con siete microlitros de una solución de ácido Fluo-4 AM Pluronic F127 recién preparada con pipeteo arriba y abajo antes de devolver el volumen completo al plato de muestra.Gire suavemente para mezclar y cubrir la placa con papel de aluminio. Después de una hora a temperatura ambiente, reemplace un mililitro del sobrenadante de la placa de cultivo explanta por tres mililitros de solución fresca de dos mililitros de calcio. A continuación, sustituya tres mililitros de sobrenadante por tres mililitros de solución de calcio fresco dos veces más.Para la toma de imágenes por actividad de calcio dentro de los explantes, coloque la placa de muestra en el escenario de un microscopio confocal invertido protegido de la exposición a la luz ambiental y utilice un marcador para etiquetar el punto frontal de la placa de modo que se pueda encontrar el mismo campo de visión en las sesiones de diagnóstico por imágenes posteriores. Utilice los objetivos 10 y 20 veces para localizar una muestra bajo el microscopio y seleccionar un campo de visión apropiado que sea denso en celdas pero no tan denso que las células estén agrupadas o sean difíciles de distinguir individualmente. Ajuste el enfoque del microscopio para que el cubreobjetos reglado por cuadrícula sea visible, cambiando el campo de visión original hasta que haya un número identificable en el marco según sea necesario.Obtenga una imagen de campo brillante del campo de visión seleccionado con el cubreobjetos reglado por cuadrícula en el foco y una imagen de campo brillante del campo de visión seleccionado con las celdas enfocadas. Sin una imagen clara del cubreobjetos cuadriculado y el campo de visión, no podrás co-registrar tus celdas con las de las imágenes de peces que generarás más adelante. A continuación, ilumine las muestras con un láser de 488 nanómetros.Para una imagen de dos horas, modifique la configuración de imágenes para grabar 901 fotogramas con un tiempo de escaneo de 3,93 segundos en un intervalo de ocho segundos antes de ejecutar la configuración para adquirir la imagen. Una vez completada la toma de imágenes, retire la placa de la etapa del microscopio y reemplace el sobrenadante de cultivo por un mililitro de 1X MEMFA durante una incubación de dos horas a temperatura ambiente teniendo cuidado de registrar la etapa de desarrollo de los embriones de control de hermanos al comienzo de la incubación. La visualización de una gráfica compuesta que contiene trazas para todas las celdas registradas en un experimento revela el grado en que las mediciones a granel o de población pueden ocultar patrones más matizados de comportamiento de punción.Cuando se aíslan los perfiles registrados de células individuales, se pueden identificar claramente ejemplos de la actividad irregular de picoteo característica de las células progenitoras neuronales. Para cuantificar esta complejidad, se pueden aplicar diferentes métodos de análisis de datos, incluidos diversos parámetros para definir un pico. Si las placas se manipulan aproximadamente o los lavados se realizan con demasiada fuerza durante la hibridación fluorescente in situ, las células se pueden desalojar de las superficies de la placa, lo que hace imposible que las células coincidan con las imágenes.Si esta interrupción afecta solamente a algunas de las celdas en el campo de visión, todavía puede ser posible detectar y asignar algunas de las celdas dentro de la imagen. Sin embargo, la cantidad máxima de datos se obtiene de un experimento en el que la hibridación se realiza con cuidado y pocas celdas se pierden o se reposicion entre imágenes. Los resultados de experimentos que recopilan la actividad del calcio con la expresión de genes marcadores de progenitores neuronales pueden revelar numerosas asociaciones entre patrones específicos de actividad de calcio y fenotipos neurotransmisores.Con estos datos, los investigadores pueden sondear características más complejas de estos patrones dinámicos de calcio y las relaciones con la expresión génica en lugar de limitarse al simple recuento de picos.

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Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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