Name: Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprende a analizar la distribución de anticuerpos terapéuticos en tumores y tejidos usando modelos de xenoinjertos. Este protocolo permite seleccionar anticuerpos con mínima unión inespecífica y enriquecer su localización tumoral de forma rápida y económica.

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Estamos agradecidos a la instalación de imágenes principales del Centro Oncológico de la Universidad de Virginia, a la Instalación de Análisis Biomolecular, a la Instalación de Microscopía Avanzada y a la Instalación Core Vivarium para asistencia. J. T-S es un investigador de carrera temprana de la Academia de Cáncer de Ovario (OCA-DoD). Este trabajo fue apoyado por la subvención NCI/NIH (R01CA233752) a J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) premio de nivel 1 de gran avance a J. T-S (BC17097) y U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) premio de financiación (OC180412) a J. T-S

Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales y estudios de xenoinjertos tumorales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aquí en la Universidad de Virginia y se ajustan a las normas regulatorias pertinentes
1. Expresión y purificación de anticuerpos
<ol><li>Mantenimiento de células CHO<ol>
<li>Cultivar células CHO en FreeStyle CHO Media complementado con suplemento de glutamina 1x disponible comercialmente a 37 oC agitando a 130 rpm con 5% CO2 usando matraz Delong Erlenmeyer ya sea de vidrio o desechable. NOTA: Se recomienda utilizar un matraz desconcertado con tapa ventilada para aumentar la agitación y mejorar la transferencia de gas durante la condición de agitación. Se ha obtenido un rendimiento de anticuerpos significativamente reducido con matraces regulares (no desconcertados) debido a la agitación limitada del cultivo de suspensión.</li>
		<li>Mantenga el número de celda entre 1-5 x 106 células/ml con &gt;95% de viabilidad celular. Si el número de celda aumenta más de 5 x 106 celdas/ml, divida las celdas. Nunca permite que las células CHO alcancen por debajo de 0,2 x 106 células/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfección de células CHO<ol>
<li>Cultivar células CHO en 200 ml de medios (2 x 106 células/ml) en matraces deslong Erlenmeyer desconcertados. NOTA: Los cultivos de suspensión cultivados en matraces desconcertados siempre han producido mayores rendimientos proteicos en comparación con cuando se cultivan en matraces no desconcertados.</li>
		<li>En un tubo de 15 ml, toma 5 ml de medios CHO FreeStyle y añade 50 g de ADN clon de VH y 75 g de ADN clon de VL. Vórtice para mezclar bien.</li>
		<li>Incubar la mezcla de ADN a temperatura ambiente durante 5 min. NOTA: Una incubación más larga reduce los rendimientos proteicos.</li>
		<li>Añadir 750 l de 1 mg/ml de material de polietilenimina (PEI) a la solución de ADN y vórtice agresivamente la mezcla durante 30 s. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min adicionales. NOTA: PEI debe hacerse fresco. El ciclo de deshielo de congelación múltiple de PEI reduce significativamente el rendimiento general.</li>
		<li>Añadir toda la mezcla de ADN y PEI en las células mientras agita manualmente el matraz. Incubar inmediatamente los matraces deslong Erlenmeyer desconcertados con células a 37oC agitando a 130 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expresión NOTA: El anticuerpo tiene péptido de señal secretora diseñado para su extremo N-terminal, que ayuda a los anticuerpos a ser secretados en los medios.<ol>
<li>Cultivar las células trans infectadas a 37 oC, con temblores a 130 rpm en el día 1.</li>
		<li>En el Día 2, agregue 2 ml de 100x agente anti-clumping y 2 ml de solución antibacteriana anti-micótica 100x. Cambie el matraz a una temperatura más baja (32-34 oC), con agitación a 130 rpm.</li>
		<li>En cada quinto día, añadir 10 mL de pienso de triptona N1, y 2 ml de suplemento de glutamina 100x.</li>
		<li>Siga contando las células cada tercer día usando hemocitociómetro después de manchar una alícuota de células con mancha azul tripano. Asegúrese de que la viabilidad celular permanezca por encima del 80%.</li>
		<li>En el Día 10 u 11, cosecha el medio para la purificación de anticuerpos. Gire el cultivo a 3000 x g,4 oC durante 40-60 min y luego filtre los medios transparentes utilizando filtros de botella de 0,22 oM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificación NOTA: La purificación de anticuerpos se realiza utilizando una columna Protein-A disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales),utilizando una bomba peristáltica.<ol>
<li>Equilibrar la columna con un volumen de dos columnas de tampón de unión (fosfato sódico de 20 mM a pH 7,4).</li>
		<li>Pasar el medio filtrado que contiene anticuerpos (obtenidos en el paso 1.3.5) a través de la columna a un caudal de 1 ml/min.</li>
		<li>Lave la columna con un volumen de dos columnas del búfer de enlace.</li>
		<li>Eluir el anticuerpo en fracciones de 500 ml utilizando un tampón de elución de 5 ml (30 mM de acetato de sodio a pH 3,4).</li>
		<li>Neutralizar el pH del anticuerpo eluido añadiendo 10 ml de tampón de neutralización (3 M de acetato de sodio a pH 9) por fracción. NOTA: La fracción número 3-6 contiene la mayor parte del anticuerpo. Es aconsejable mantener todas las fracciones en caso de que el anticuerpo se eluda en una fracción posterior de lo esperado.</li>
		<li>Mida la concentración de anticuerpos purificados utilizando un espectrofotómetro seleccionando el protocolo predeterminado para IgG. La concentración final del anticuerpo se obtiene en mg/ml teniendo en cuenta el peso molecular y el coeficiente de absorción.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Etiquetado fluorescente
NOTA: Los anticuerpos se etiquetan con el tinte infrarrojo que contiene un grupo reactivo de éster DEL NHS, que se acopla a las proteínas y forman un conjugado estable. Esta reacción es sensible al pH y funciona mejor a pH 8,5. Los conjugados fluorescentes etiquetados con el tinte muestran un máximo de absorción de 774 nm, y un máximo de emisión de 789 nm. pH 8.5 es clave para una conjugación efectiva.
<ol><li>Dialyze 0,5 ml del anticuerpo utilizando un casete de diálisis (0,1-0,5 ml) en 1 L de tampón de conjugación (tampón de fosfato de 50 mM a pH 8,5). Después de 4 horas, transfiera el cassette de diálisis a un tampón fresco y dialyze durante la noche.</li>
	<li>Configure una reacción de conjugación añadiendo 0,03 mg de IRDye 800CW por 1 mg de anticuerpo en un volumen de reacción de 500 l. NOTA: IRDye 800CW se disuelve en DMSO a una concentración de 10 mg/ml.</li>
	<li>Llevar a cabo reacciones de etiquetado durante 2 h a 20oC. NOTA: Aumentar el tiempo más allá de 2 h no mejora el etiquetado.</li>
	<li>Purificar conjugados etiquetados por diálisis extensa contra 1x PBS.</li>
	<li>Estimar el grado de etiquetado midiendo la absorbancia del tinte a 780 nm y absorbancia de la proteína a 280 nm. La contribución del tinte a la señal de 280 nm es del 3%.</li>
	<li>Calcule la relación colorante/proteína utilizando esta fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ01.jpg"> donde 0,03 es un factor de corrección para la absorbancia del tinte utilizado a 280 nm (igual al 3,0 % de su absorbancia a 780 nm), εDye y εProtein son coeficientes de extinción molar para el tinte y la proteína (anticuerpo) respectivamente. NOTA: εDye es 270,000 M-1 cm-1 y εProtein es 203,000 M-1 cm-1 (para un IgG típico) en 1:1 mezcla de PBS: metanol. Las proteínas distintas de IgG pueden tener coeficientes de extinción molar muy diferentes. El uso del coeficiente de extinción correcto para la proteína de interés es esencial para la determinación precisa de la relación D/P.</li>
	<li>Calcule la concentración final de proteína utilizando esta fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ02.jpg"> NOTA: Confirme siempre la eficacia de unión a antígenos de anticuerpos etiquetados y no etiquetados utilizando ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) o citometría de flujo antes de proceder a estudios in vivo.</li>
</ol>3. Estudios de xenoinjertos de ratón
<ol><li>Preparación de células tumorales inyectables<ol>
<li>Cultivar células OVCAR-3 en RPMI-1640 Medio, complementado con 10% de FBS y 1x penicilina-estreptomicina.</li>
		<li>El día antes de la inyección, las células de la subcultura se convierten en nuevos platos de cultivo de 100 mm con 10 ml de medio/plato completo. Utilice el número de celda de 0.5-1 x 106 células/plato.</li>
		<li>Incubar cultivos a 37oC de temperatura, 95% de humedad y 5% deCO2 durante 20-24 h.</li>
		<li>El día de la inyección, retire el medio de crecimiento de los platos de cultivo. Enjuague bien la capa celular con Ca2+/Mg2+ la solución salina libre de Dulbecco (DPBS) para eliminar las células muertas, los desechos celulares y todos los rastros de suero, que pueden interferir en la acción de la tripsina.</li>
		<li>Pruebe las células añadiendo 1,0-1,5 ml de solución de Trypsin-EDTA a cada plato y trate de extender la solución inclinando el plato por todas partes seguido de incubación a 37 oC durante 5-10 min. NOTA: Observe las células bajo un microscopio invertido para comprobar el estado real de la tripsinación. Bajo la tripsinación resulta en un menor número de desprendimiento celular de la superficie de la placa de cultivo, sobre la tripinanización induce estrés celular. Por lo tanto, la tripsinación adecuada es importante.</li>
		<li>Añadir 1.0-1.5 mL de medio de crecimiento completo a cada plato para detener la acción de la trippsina, después de que re-suspenda las células por pipeteo suavemente. NOTA: El pipeteo suave es importante para mantener la salud celular.</li>
		<li>Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y girar a 250 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Recoger el pellet celular después de quitar el sobrenadante y lavar las células mediante la re-suspensión del pellet en 1x DPBS.</li>
		<li>Gire la suspensión celular a baja velocidad 250 x g durante 5 min.</li>
		<li>Agregue 500 l de DPBS y vuelva a suspender las células mediante pipeteo suave para obtener una sola celda de suspensión.</li>
		<li>Recuento de células mediante hemocitociómetro o contador automático de células. NOTA: Para una mejor precisión, repita el conteo tres veces y tome un promedio.</li>
		<li>Ajuste el volumen de tal manera que la densidad final de la celda sea de 1 x 108 celdas/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyección subcutánea de células para desarrollar xenoinjertos de ratón NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete de seguridad BSL2. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ ratones se han utilizado en el estudio actual.<ol>
<li>Tome 50 l de la suspensión celular en un tubo de 1,5 ml y mezcle con 50 ml de medio de matriz de membrana del sótano. NOTA: El medio de matriz de membrana sótano tiende a formar un gel como estado a temperatura ambiente, así que mantenga cuidadosamente las células y la mezcla media de matriz en hielo. Es aconsejable mantener tubos, puntas y jeringas en la nevera y luego transferirlos en hielo antes de la inyección animal.</li>
		<li>Agitar la mezcla para evitar cualquier aglutinamiento celular. A continuación, tome este 100 l de la mezcla media de matriz de suspensión celular que contiene 5 x 106 células, en una jeringa de 1 cc.</li>
		<li>Levante suavemente la piel del animal para separar la piel de la capa muscular subyacente e inyecte lentamente la suspensión celular (100 l) debajo de la piel (5 x 106 células), con una aguja de 26 G. Espere unos segundos antes de sacar la aguja, para que el medio de matriz del sótano pueda formar el gel semisólido como estructura junto con las células debajo de la piel, evitando que la mezcla salga del lugar de la inyección. NOTA: Las células deben ser probadas antes de la inyección para detectar cualquier contaminación que pueda dañar a ratones inmunodeficientes. Durante la inyección no coloque la aguja demasiado profunda en la piel, ya que esto puede formar el tumor más profundo de lo esperado.</li>
		<li>Mantener al animal en una jaula estéril y observar durante unos 20 minutos.</li>
		<li>Observe a los ratones durante 2-3 semanas y permita que el tumor crezca hasta 500 mm3 de tamaño.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Localización de anticuerpos mediante un sistema de imágenes in vivo
NOTA: El equipo de imágenes in vivo (ver Tabla de Materiales)utilizado en este experimento utiliza un conjunto de filtros de alta eficiencia y algoritmos espectrales de desmezcla para la visualización no invasiva y el seguimiento de la actividad celular y genética dentro de un organismo vivo en tiempo real. El sistema proporciona capacidad de monitoreo de fluorescencia y bioluminiscencia.
<ol><li>Inyectar 25 g de anticuerpos etiquetados con tinte a través de la vena de la cola.<ol>
<li>Anestesia a los ratones con tumor usando 2% de isoflurano. Compruebe la falta de respuesta a los reflejos del pedal.</li>
		<li>Una vez que los ratones dejen de moverse, dilate la vena lateral de la cola aplicando agua de gusano.</li>
		<li>Inyectar 25 g (en 100 oL) de anticuerpo etiquetado utilizando jeringa de insulina de 1 cc con una aguja de 26 G.</li>
		<li>Del mismo modo, como control negativo, etiquete e inyecte el anticuerpo isotipo IgG1 no específico que no se dirige a las células cancerosas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar imágenes en vivo in vivo después de 8, 24, 48 h, etc. de inyecciones de anticuerpos.<ol>
<li>En el software asociado, haga clic en Inicializar ubicado en el panel de control y confirme que la temperatura de la etapa es de 37 oC.</li>
		<li>Encienda el suministro de oxígeno, todas las bombas en el sistema de anestesia, el suministro de gas isoflurano a la cámara anestésica y ajuste la válvula vaporizadora de isoflurano al 2%.</li>
		<li>Transfiera los ratones a la cámara anestésica y espere a que los ratones estén completamente anestesiados. Aplique la pomada lubricante para los ojos para evitar el secado de sus ojos.</li>
		<li>Vaya al panel de control,configure la imagen de fluorescencia a través de la opción Asistente de imágenes y seleccione la excitación a 773 nm y la emisión a 792 nm. NOTA: Los ajustes de exposición automática predeterminados proporcionan una buena imagen fluorescente. Sin embargo, las preferencias de exposición automática se pueden modificar según las necesidades.</li>
		<li>Transfiera los ratones anestesiados a la cámara de imágenes y enséñelos en el campo de la imagen usando cono nasal. La etapa de diagnóstico por imágenes ofrece la opción de acomodar 5 ratones a la vez. NOTA: Haga que los ratones de control sean imageados junto con los ratones de prueba para tener una cantidad similar de exposición y otros ajustes durante el análisis.</li>
		<li>Una vez que todo esté listo, seleccione la opción Adquirir en el panel de control para la adquisición de la imagen.</li>
		<li>Con la configuración de Autoexposición, el sistema genera la imagen en un minuto. La imagen generada es la superposición de fluorescencia en la imagen fotográfica con intensidad de fluorescencia óptica mostrada en unidades de recuentos o fotones, o en términos de eficiencia.</li>
		<li>Después de adquirir la imagen, transfiera los ratones de la cámara de imágenes de vuelta a su jaula y observe su recuperación durante 1 a 2 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste la imagen aún más con las herramientas y funciones proporcionadas dentro del software para el análisis de imágenes. Las herramientas de análisis de imágenes se encuentran en la barra de menús y la paleta de herramientas.<ol>
<li>En Ajuste de imagen, ajuste el brillo, el contraste u opacidad y seleccione la escala de color.</li>
		<li>Utilice las Herramientas de ROI para especificar una región de interés (ROI) en una imagen óptica y medir la intensidad de la señal dentro del ROI. Si es necesario, exporte los datos de señal cuantificados a un software de hoja de cálculo y trace los datos.</li>
		<li>Para estudios de seguimiento, analice las necropsias en ratones de diversos tejidos (por ejemplo, hígado, pulmón, corazón, riñón, bazo, cerebro, etc.) lado a lado para una distribución detallada no específica de anticuerpos con etiqueta fluorescente. NOTA: Los datos se pueden seguir apoyando con elISA específico del tejido haciendo uso del antígeno (FOLR1 en este caso) en 96 ensayos de pozos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

La administración selectiva y específica del tejido tumoral del agente terapéutico contra el cáncer es la clave para medir la eficacia y la seguridad de una terapia dirigida determinada13. Aquí hemos descrito un enfoque rápido y eficiente para investigar la distribución detallada del tejido y tumoral de la clínica, farletuzumab y un anticuerpo BaCa no clínico. El enfoque descrito es aplicable a cualquier anticuerpo recién generado y se puede utilizar junto con un anticuerpo clínicamente eficaz (co...

Fda aprobó el primer anticuerpo monoclonal dirigido a CD3 (OKT3, Muromonab) en 19861,2. Desde entonces durante los siguientes veinte años, ha habido una rápida explosión en el campo de la ingeniería de anticuerpos debido al éxito abrumador de los anticuerpos contra los inhibidores del punto de control inmune3. Además de la activación indirecta del sistema inmunitario, los anticuerpos están destinados a marcar directamente las células cancerosas para atacar con precisión las células del efector inmune, desencadenar la citotoxicidad a través del agonista del receptor de la muerte, bloquear la señalización de supervivencia de las células tumorales, obstruir la angiogénesis (crecimiento de los vasos sanguíneos), restringir los reguladores del punto de control inmune, entregar radioisótopos, medicamentos de quimioterapia y siRNA como agentes conjugados2. Además, el estudio de los fragmentos variables de cadena única (scFv) de varios anticuerpos en la superficie de células T y células NK derivadas del paciente (CAR-T y CAR-NK) es un área de rápido crecimiento de las investigaciones clínicas para terapias basadas en células4.
La afinidad ultra alta de los fármacos basados en anticuerpos que proporciona selectividad a los antígenos que expresan las células tumorales lo convierten en un agente atractivo. Del mismo modo, la administración dirigida y la retención tumoral de un anticuerpo terapéutico (o un fármaco químico) es la clave para equilibrar la eficacia sobre la toxicidad. Por lo tanto, un gran número de estrategias basadas en la ingeniería de proteínas que incluyen pero no se limitan a biespecíficos5 y anticuerpos tri-específicos6 están siendo explotados para mejorar significativamente la avidez optimizada de la retención tumoral de la terapia inyectada por vía intravenosa (IV)5,7. Aquí, describimos un método simple basado en la fluorescencia para abordar la distribución del tumor y el tejido de anticuerpos contra el cáncer potencialmente eficaces.
Debido a que los tejidos animales poseen autofluorescencia cuando se excitan en el espectro visible, los anticuerpos fueron inicialmente etiquetados con un tinte infrarrojo cercano (por ejemplo, IRDye 800CW). Para las pruebas de investigaciones conceptuales, hemos hecho uso del receptor de folato alfa-1 (FOLR1) dirigido a anticuerpos llamados farletuzumab y su derivado llamado activador de citotoxicidad de anclaje biespecí (BaCa)7 anticuerpo que se dirige a FOLR1 y receptor de muerte-5 (DR5)8 en un anticuerpo recombinante. FOLR1 es un receptor diana sobreexpresado bien definido en células cancerosas de ovario y TNBC, xenoinjertos tumorales y tumores de pacientes9. En particular, existen múltiples esfuerzos para explotar clínicamente FOLR1 utilizando enfoques basados en anticuerpos para involucrar células efectos inmunes y conjugados de fármacos de anticuerpos (ADC) para cánceres de ovario y de mama10,11.
En este documento de métodos, clonamos, expresamos y purificamos anti-FOLR1 clínicos (farletuzumab) junto con otros anticuerpos de control utilizando el sistema de expresión CHO. El isotipo IgG1 y un anticuerpo clínico anti-idiotipo mucina-16 llamado abagovomab12 se utilizaron como controles negativos. Tras la purificación de proteínaS A, los anticuerpos indicados se etiquetaron con IRDye 800CW y se administraron en la vena de la cola de ratones desnudos que tenían xenoinjertos tumorales de ovario o se trans infectaron establemente FOLR1 humano que expresan xenoinjertos de cáncer de colon murino. La localización de anticuerpos fue rastreada por imágenes en vivo utilizando espectro de imágenes in vivo en múltiples puntos de tiempo diferentes7. Este método no requiere ninguna modificación genética o inyección del sustrato para permitir la emisión de luz y es significativamente más rápido, rentable y eficiente. El protocolo general de clonación, expresión, purificación y etiquetado descrito a continuación se puede aplicar a cualquier anticuerpo clínico y no clínico si hay secuencias de cadena pesadas y ligeras disponibles.

<table><tbody><tr><td>Medios FreeStyle CHO</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 12651-014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Agente antiaglomerante</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 01-0057DG</td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringa de insulina</td><td>BD BioSciences</td><td>Cat #329420</td><td></td></tr><tr><td>Pinza IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>Cat #124262</td><td></td></tr><tr><td>CHO CD EfficientFeed B</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat #A10240-01</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-13-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 conjugado Anti-Human IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Cat # 709-175-149</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Maxiprep de plásmido HiPure</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # K21007</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe Columna</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat # 11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>Infusión</td><td>Takara BioScience</td><td>STO344</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW NHS Ester</td><td>LI-COR</td><td>Cat # 929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Covetrus</td><td>Cat # 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Ungüento lubricante para los ojos</td><td>Refresh Lacri-Lube</td><td>Cat #4089</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354234</td><td></td></tr><tr><td>reactivo de transfección PEI</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat # BMS1003A</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Casetes de diálisis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat # 66333</td><td></td></tr><tr><td>Steritop Vacuum Filtros</td><td>Millipore Express</td><td>Cat #S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15400-054</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experimental Models: Líneas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human: OVCAR-3</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>Humano: Células CHO-K</td><td>Estables transformado en nuestro laboratorio</td><td>ATCC CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Ratón: 4T1</td><td>Amable regalo del Dr. Chip Landen, UVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón: MC38</td><td>Amable regalo de la Dra. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td><td>Autenticado por STR</td><td></td>perfilado</tr><tr><td>Ratón: MC38 hFOLR1</td><td>Generado en nuestro laboratorio (Este artículo)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Modelos experimentales: Animales</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones: Desnudo atímico Foxn1nu/Foxn1+</td><td>Envigo</td><td>Órdenes Múltiples Ratones</td><td></td></tr><tr><td>: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>Órdenes Múltiples</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Los anticuerpos monoclonales son fármacos multifuncionales de alta afinidad que funcionan mediante mecanismos independientes variables para eliminar las células cancerosas. En las últimas décadas, el campo de los conjugados de anticuerpos y fármacos, anticuerpos biespecíficos, receptores de antígenos quiméricos (CAR) e inmunoterapia contra el cáncer ha surgido como el área más prometedora de las investigaciones básicas y terapéuticas. Con numerosos ensayos en humanos exitosos dirigidos a receptores de punto de control inmune y células CAR-T en leucemia y melanoma a un ritmo revolucionario, es muy emocionante para las terapias oncológicas derivadas de variaciones de la ingeniería de anticuerpos. Lamentablemente, un número significativamente grande de anticuerpos y terapias basadas en CAR también han demostrado ser decepcionantes en los ensayos en humanos de cánceres sólidos debido a la limitada disponibilidad de células de efector inmune en el lecho tumoral. Es importante destacar que la distribución inespecífica de anticuerpos terapéuticos en tejidos distintos de los tumores también contribuye a la falta de eficacia clínica, toxicidad asociada e insuficiencia clínica. Como la traducción fiel de estudios preclínicos en senderos clínicos en humanos se basa en gran medida en los estudios de eficacia y seguridad del xenoinjerto tumoral de ratones, aquí destacamos un método para probar el tumor y la distribución general del tejido de los anticuerpos terapéuticos. Esto se logra mediante la etiqueta del anticuerpo purificado de proteína A con un tinte fluorescente infrarrojo cercano seguido de imágenes en vivo de ratones portadores de tumores.

En la metodología descrita, primero clonamos anticuerpos dirigidos al receptor de folato alfa-1 (FOLR1) llamado farletuzumab, y un anticuerpo biespecífico llamado BaCa que consiste en farletuzumab y lexatumumab junto con anticuerpos de control como abagovomab (secuencias proporcionadas en el Archivo Suplementario 1). Los detalles de los dominios representativos de la variable pesada (VH) y de la luz variable (VL) en los clones de ADN (pVH, pVL) se muestran en la Figura 1A. P...

Aquí presentamos un protocolo para estudiar la localización in vivo de anticuerpos en modelos de xenoinjertos tumorales en ratones.

Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Este protocolo demuestra la expresión y purificación de anticuerpos y la monitorización en tiempo real de la distribución de anticuerpos en tumores y tejidos. Los anticuerpos de detección con el protocolo descrito ayudarán a seleccionar anticuerpos que tienen una distribución limitada de tejido no específico y enriquecerán las localizaciones tumorales. La técnica descrita es rápida y rentable.Otras técnicas, como la tomografía computarizada por emisión de un solo fotón y la tomografía por emisión de positrones, son muy costosas y requieren trazadores radiactivos y otros trazadores sofisticados. La técnica no se limita a los anticuerpos dirigidos al cáncer. Se puede aplicar a cualquier otra enfermedad, como enfermedades pulmonares o cardíacas, para el análisis de la distribución de anticuerpos en el cuerpo.Demostrando el procedimiento, estará Jeremy Gatesman, un técnico veterinario de mi universidad. Células CHO crudas en 200 mililitros de medios, en delong, Erlenmeyer desconcertado matraces. Combine cinco mililitros de medios de estilo libre CHO con 50 microgramos de ADN de clon pesado variable y 75 microgramos de ADN de clon ligero variable en un tubo de 15 mililitros.Luego, vórtice el tubo. Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos. Añadir 750 microlitros de un miligramo por mililitro de polietilenimina a la solución de ADN, y vórtice agresivamente durante 30 segundos.Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos adicionales. Agregue toda la mezcla a las células CHO mientras agita manualmente el matraz. Incubar inmediatamente las células a 37 grados centígrados mientras se agita a 130 RPM.Al día siguiente, agregue dos mililitros de agente anti-clumping de 100 X y dos mililitros de solución antibacteriana antimicótica a las células. Incubar los matraces a 32 a 34 grados celsius, con agitación a 130 RPM. Continúe cultivando las células durante 10 a 11 días, añadiendo 10 mililitros de alimento de triptona N1, y dos mililitros de suplemento de 100 X glutamina en cada quinto día.Cuente las células cada tercer día para asegurarse de que la viabilidad celular se mantenga por encima del 80% En el día 10 u 11, cosechar el medio para la purificación de anticuerpos centrifugando el cultivo a 3000 veces G, y grados cuatro Celsius durante 40 a 60 minutos. A continuación, filtre el medio transparente con un filtro de botella de 0,22 micrómetros. Para purificar los anticuerpos, equilibre la columna de proteína A con dos volúmenes de columna de tampón de unión.Pase el medio filtrado a través de la columna a un caudal de un mililitro por minuto. A continuación, lave la columna con dos volúmenes de columna de búfer de enlace. Utilice cinco mililitros de tampón de elución para eluir el anticuerpo en 500 fracciones de microlitro.Y neutralice el pH del anticuerpo aludido añadiendo 10 microlitros de tampón de neutralización para fracción. Mida la concentración del anticuerpo purificado con un espectrofotómetro utilizando el protocolo predeterminado para IgG. Dialyze 0,5 mililitros del anticuerpo utilizando un casete de diálisis en un litro de tampón de conjugación.Después de cuatro horas, transfiera el cassette de diálisis a un tampón fresco y dialyze durante la noche. Para configurar una reacción de conjugación, agregue 0,03 microgramos de tinte IRR 800 CWU por un miligramo de anticuerpo en un volumen total de 500 microlitros. Incubar la mezcla durante dos horas a 20 grados centígrados, luego purificar los conjugados etiquetados por diálisis extensa contra PBS.Estimar el grado de etiquetado midiendo la absorbancia del tinte 780 nanómetros, y la absorbancia de la proteína a 280 nanómetros. Para desarrollar xenogramas de ratón, levante suavemente la piel del animal y sepárela de la capa muscular subyacente. Inyecte lentamente 100 microlitros de suspensión celular debajo de la piel con una aguja de calibre 26.Espere unos segundos antes de sacar la aguja para que el medio de matriz del sótano informe la estructura semisólida similar al gel junto con las células debajo de la piel, lo que evitará que la mezcla salga del lugar de inyección. Para realizar imágenes in vivo, inyecte el anticuerpo etiquetado con el tinte a través de la vena de la cola. Después de anestesiar el ratón, compruebe la falta de respuesta a los reflejos del pedal y dilate la vena aplicando agua tibia.Utilice una jeringa de insulina de 1 cc con una aguja de calibre 26 para inyectar 25 microgramos del anticuerpo etiquetado en un volumen de 100 microlitros. Como control negativo, etiquete e inyecte el anticuerpo isotipo IgG no específico que no se dirige a las células cancerosas. Realizar imágenes in vivo ocho, 24 y 48 horas después de las inyecciones de anticuerpos.En el software de imágenes, haga clic en inicializar. Confirme que la temperatura de la etapa es de 37 grados centígrados. En el panel de control, configure imágenes de fluorescencia a través del asistente de imágenes y ajuste la excitación a 773 nanómetros, emisión a 792 nanómetros.Transfiera el ratón anestesiado a la cámara de imágenes. Colóquelo en el campo de imagen usando el cono nasal. Cuando esté listo, haga clic en adquirir en el panel de control para la adquisición de imágenes y haga clic en exponer automáticamente.La imagen generada es la superposición de la fluorescencia en la imagen fotográfica con fluorescencia óptica y densidad mostrada en unidades de recuentos o fotones. Se confirmaron clones positivos de ADNs con dominios de luz variable pesada y variable con PCR de colonia. Los resultados representativos de la ejecución de farletuzumab purificado en la página SDS no reductora y reductora se muestran aquí.Las cadenas pesadas y ligeras producían bandas de 50 y 25 kilodalton después de la reducción. También se confirmó la unión de anticuerpos a proteínas nativas en la superficie celular. Los anticuerpos con etiqueta fluorescente fueron inyectados en venas de cola, en ratones injertados con tumores completos de R1 que expresan tumores.Los animales se vivieron imagen en varios puntos de tiempo utilizando IVIS. el enriquecimiento selectivo de los inhibidores de datos de anticuerpos completos R1 y BaCa en los tumores. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que el mantenimiento de las células CHO es fundamental para el rendimiento de anticuerpos.Y es importante tener un grado similar de conjugación de tinte fluorescente para la localización de tumores competitivos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica de tejidos y el ELISA específico de tejidos o tumores para apoyar los datos de imágenes de ratones vivos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este vídeo describe la técnica de radioinmunoterapia predirigida o PRIT, en la que se administran inmunoconjugados seguidos de radioligandos para el tratamiento de tumores. Esta radioinmunoterapia reduce las dosis de radiación a los tejidos sanos y utiliza radionúclidos con vidas medias muy bajas incompatibles con los vectores basados en anticuerpos.

Radioinmunoterapia predirigida: un método para la administración dirigida de radionúclidos terapéuticos a los tumores

Este vídeo muestra una técnica para estudiar la localización in vivo de anticuerpos específicos de tumor en un modelo de xenoinjerto tumoral de ratón. Al inyectar células cancerosas por vía subcutánea en ratones para la formación de tumores, se inyectan anticuerpos marcados con fluorescencia que se unen a los receptores específicos del tumor, lo que permite la evaluación in vivo de la localización de anticuerpos mediante imágenes.

Una técnica para evaluar la localización in vivo de anticuerpos específicos contra tumores

La cicloadición de Diels-Alder de demanda de electrones inversos bioortogonales se ha aprovechado para crear una estrategia de imagen PET predirigida eficaz y modular para el cáncer. En este protocolo, los pasos de esta metodología se describen en el contexto de un sistema modelo que emplea el anticuerpo dirigido al cáncer colorrectal huA33 y un radioligando marcado con 64Cu.

El aprovechamiento de la demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder Cicloadición para Pretargeted TEP

Péptidos virales derivados juntados a conjugados de anticuerpos (ACs) es un enfoque ganando impulso debido a la posibilidad de entregar cargas moleculares con la acumulación de células de tumores aumentado. Utilizando métodos comunes para evaluar verbal de péptido, AC y acumulación intracelular de carga útil y tumor targeting, este protocolo ayuda a los investigadores durante las fases de desarrollo inicial clave.

Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Este protocolo describe cómo evaluar sinergismo entre un anticuerpo contra el cáncer y fármacos antineoplásicos en modelos preclínicos mediante la ecuación de índice de combinación de Chou y Talalay.

Potenciación de la eficacia del anticuerpo contra el cáncer por fármacos antineoplásicos: detección de anticuerpos-droga sinergia utilizando la ecuación de índice de combinación

Este protocolo describe un flujo de trabajo detallado para la generación y ex vivo de caracterización de virus oncolíticos para expresión de inmunomoduladores, usando virus de sarampión codificación tienen células T actores como ejemplo. Aplicación y adaptación a otras plataformas de vector y los transgenes acelerarán el desarrollo de nuevos immunovirotherapeutics para la traducción clínica.

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

Este protocolo describe la síntesis y caracterización de un transporte- cyclooctene (TCO)-modifica un radioligando de Lu-labeled tetrazina (Tz) 177para radioinmunoterapia pretargeted (PRIT) y el anticuerpo. Además, detalla el uso de estas dos construcciones en vivo biodistribución y estudios longitudinales de la terapia en un modelo murino de cáncer colorrectal.

Radioinmunoterapia pretargeted basada en la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa

El método de localización de inmunofluorescencia in vivo (IVIL) se puede utilizar para examinar la biodistribución in vivo de anticuerpos y conjugados de anticuerpos con fines oncológicos en organismos vivos utilizando una combinación de segmentación tumoral in vivo e inmunostainización ex vivo Métodos.

Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer

Este protocolo describe la generación quirúrgica de tumores pancreáticos ortotópicos y la rápida digestión de tumores pancreáticos murinos recién aislados. Después de la digestión, las poblaciones viables de células inmunitarias se pueden utilizar para análisis posteriores, incluida la estimulación ex vivo de las células T para la detección de citoquinas intracelulares por citometría de flujo.

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

Aquí, describimos un método para transducir células T humanas con luciferasa para facilitar el seguimiento in vivo del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos a tumores en estudios para evaluar la eficacia antitumoral y el mecanismo de anticuerpos biespecíficos que involucran a las células T.

Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa

Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.

Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Aprende a analizar la distribución de anticuerpos terapéuticos en tumores y tejidos usando modelos de xenoinjertos. Este protocolo permite seleccionar anticuerpos con mínima unión inespecífica y enriquecer su localización tumoral de forma rápida y económica.

Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

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