Perfilado en todo el transcriptoma de las interacciones entre proteínas y ARN por enlace cruzado e inmunoprecipitación mediada por la purificación en tándem FLAG-Biotin
May 18th, 2020
Aquí presentamos un protocolo CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq con purificación en tándem FLAG-biotina para determinar los objetivos de ARN de proteínas de unión al ARN (RPP) en células de mamíferos.
Sólo y sólo proteínas de unión controlan múltiples procesos biológicos. Este método FLAG-Biotin CLIP-seq, por lo tanto, para perfilar globalmente la disposición especial y temporal de RNAs y RBP en células de mamíferos. Este método permite la detección eficiente de ARN directos unidos a proteínas sin SDS-PAGE y los procedimientos de transferencia de membrana.
En comparación con el CLIP-seq tradicional es libre de isótopos y no requiere anticuerpo específico para proteínas. Comience por enchapar alrededor de 3 millones de células STEM embrionarias de ratón en una placa de 10 centímetros e incubarlas durante la noche. Al día siguiente, retire el medio con un vacío y trate las células con dos mililitros de 0,25% de trippsina EDTA durante dos minutos a temperatura ambiente.
Aprieta la tripina con cuatro mililitros de medio MESC fresco, y transfiere las células a un tubo centrífugo de 15 mililitros. Luego, centrifugarlos a 300 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados y quitar el sobrenadante. Suspenda las células en cuatro mililitros de PBS frío y transfiérelos de vuelta a la placa de 10 centímetros para la reticulación.
Radiar las células con una luz UV de 254 nanómetros, luego transferir las células reticuladas a un tubo de 15 mililitros. Gire hacia abajo estas células a 300 veces G durante tres minutos a cuatro grados celsius, luego retire el sobrenadante ylyse las células con 500 microlitros de búfer A preparados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros libre de RNAse, e incubarlas a cuatro grados Celsius con rotación suave durante 30 a 60 minutos.
Tratar el liso con 30 microlitros de DNAse 1 a 37 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, detenga la reacción añadiendo cuatro microlitros de 0,5 molares EDTA. Gire hacia abajo el pellet insoluble centrifugando a 12.000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo precalentado de 1,5 mililitros.
Transfiera el izado celular a cuentas FLAG preequilibadas, e incuba la muestra a cuatro grados centígrados mientras gira durante dos a cuatro horas. Después de la incubación, centrifugar las perlas durante dos minutos a 3000 veces G y retire el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de Buffer A a la muestra, e incubar a 4 grados Celsius durante cinco minutos, luego girar hacia abajo las cuentas y quitar el sobrenadante.
Repita el lavado con Buffer A, seguido de dos lavados con Tampón precaleado B.To eluido con un péptido FLAG X, prepare la solución de elución como se describe en el manuscrito de texto y gire hacia abajo las cuentas FLAG. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta de extremo estrecho y agregue 200 microlitros de la solución de tres laución X FLAG a cada muestra. Incubar las muestras durante 30 minutos a cuatro grados centígrados con rotación suave.
A continuación, gire hacia abajo las cuentas durante dos minutos a 3000 veces G.Transferir el supernado a un tubo fresco y repetir la elución dos veces. Ahorre el 5% de los eluyentes para el análisis de manchas occidentales o la tinción de plata para comprobar la eficiencia de la inmunoprecipitación FLAG. Transfiera los eluyentes tirados a las cuentas de estreptavidina preparadas y gire suavemente las muestras a cuatro grados centígrados durante una a tres horas o durante la noche.
A continuación, recoger las perlas en un soporte magnético y quitar el sobrenadante. Lave las perlas dos veces con 500 microlitros de Tampón C con rotación suave durante cinco minutos por lavado. A continuación, lave las perlas dos veces con 500 microlitros de Buffer D, y dos veces con 500 microlitros de tampón PNK helado, recogiendo las perlas en el soporte magnético y quitando el sobrenadante entre lavados.
Para realizar la digestión parcial del ARN, añada 100 microlitros de solución de MNA a cada muestra y el vórtice se ajuste a 37 grados Centígrados con un mezclador térmico durante 10 minutos. Recoger las perlas con un soporte magnético durante 30 segundos y quitar el sobrenadante. A continuación, lávelos con el búfer PNK-EDTA, el búfer Tampón C y el búfer PNK según las instrucciones del manuscrito.
Recoger las perlas con el soporte magnético y quitar el tampón. A continuación, agregue la mezcla de reacción CIP y el vórtice las perlas a 37 grados Celsius con un mezclador térmico durante 10 minutos. Lave rápidamente las cuentas dos veces con 500 microlitros de tampón PNK EDTA helado, seguidos de dos lavados con 500 microlitros de tampón PNK helado.
Después de los lavados, agregue 40 microlitros de tres mezclas de ligadura de enlace principal a las perlas, y vórtice a 16 grados Celsius con un mezclador térmico durante tres horas o durante la noche. La ligadura eficiente del vinculador a los aliados es fundamental para este experimento. Compruebe el tubo de reacción ocasionalmente para asegurarse de que estos no se precipitan durante la ligadura.
Después de la incubación, repita los lavados con tampones PNK EDTA y PNK, agregue 40 microlitros de PNK mezclados a las perlas, y vórquelos a 37 grados Celsius con el mezclador térmico durante 10 minutos. Lave las cuentas con los búferes PNK EDTA y PNK y, a continuación, proceda con el aislamiento de ARN como se describe en el manuscrito de texto. En comparación con la purificación de afinidad por un paso mediada por FLAG o streptavidina, la purificación en tándem FLAG-Biotin eliminó casi todas las proteínas purificadas principales, evitando la contaminación de las interacciones indirectas del ARN proteico.
LIN28 y WDR43, Fbio CLIP-seq se realizó utilizando células STEM embrionarias de ratón. En total, se recuperaron alrededor de 7,7 millones y 2,2 millones de lecturas únicas para LIN28 y WDR43 respectivamente. La comparación de las vistas de pista muestra diferentes patrones de encuadernación en el locus de RN45 pre-rRNA.
Los sitios reticulados en el motivo GGA G de ARN pre-let7-g de LIN28, Fbio CLIP-seq o identificados. Además, se determinaron motivos de ARN enriquecido en los sitios de unión y el porcentaje de nucleótidos mutados en diferentes tipos de mutaciones. Mostrando que LIN28 prefiere unirse al nucleótido genético.
Bueno, a las 10:00 PM, este protocolo, es importante confirmar la eficiencia de la inmunoprecipitación para asegurarse de que los complejos de proteínas sólo se purificaron con éxito.
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Información general
Este artículo presenta un protocolo CLIP-seq modificado llamado Fbio CLIP-seq, que utiliza la purificación en tándem de FLAG-biotina para identificar objetivos de ARN de proteínas que se unen a ARN (RBPs) en células de mamíferos. El método permite una detección eficiente de ARN directamente unidos a proteínas sin necesidad de procedimientos de SDS-PAGE y transferencia a membrana.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Biología molecular
Antecedentes
- Las proteínas que se unen a ARN (RBPs) desempeñan roles cruciales en la regulación de varios procesos biológicos.
- Los métodos CLIP-seq tradicionales a menudo requieren isótopos y anticuerpos específicos.
- Fbio CLIP-seq tiene como objetivo simplificar el proceso de perfilar RBPs y sus objetivos de ARN.
- Este método es particularmente útil para el estudio de células de mamíferos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método más eficiente para identificar objetivos de ARN de RBPs.
- Eliminar la necesidad de procedimientos complejos como SDS-PAGE.
- Proporcionar un protocolo que pueda aplicarse fácilmente en estudios de células de mamíferos.
Métodos utilizados
- Cultivo de células madre embrionarias de ratón en una placa de 10 cm.
- Incubación de células durante la noche antes del tratamiento.
- Tratamiento con tripsina EDTA para desprender las células.
- Utilización de la purificación en tándem de FLAG-biotina para el aislamiento de ARN.
Resultados principales
- El método Fbio CLIP-seq perfila con éxito las RBPs y sus objetivos de ARN.
- Demuestra eficiencia en la detección de ARN directamente unidos a proteínas.
- Muestra que el método no utiliza isótopos ni anticuerpos.
- Proporciona un enfoque simplificado para el estudio de interacciones ARN-proteína.
Conclusiones
- Fbio CLIP-seq es una herramienta valiosa para investigadores que estudian RBPs en células de mamíferos.
- El método mejora la capacidad de perfilar interacciones ARN sin las limitaciones tradicionales.
- Las aplicaciones futuras pueden expandirse a varios contextos biológicos y tipos de células.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Direct mapping of protein-RNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery pipelines. The Fbio CLIP-seq method enables transcriptome-wide identification of direct RNA-binding protein targets without reliance on isotopes or protein-specific antibodies, reducing confounding from indirect interactions. This capability enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in RNA-targeted drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables transcriptome-wide interrogation of direct protein-RNA interactions for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by eliminating indirect RNA-binding protein contaminants.
- Supports predictive confidence in target engagement and pathway mapping.
- Facilitates triage of RNA-binding proteins based on direct interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, antibody-free workflow for preparing validated protein-RNA complexes.
- Delivers quantitative readouts of direct binding events suitable for downstream screening.
- Improves reproducibility and scalability by removing isotope and antibody dependencies.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by profiling endogenous interactions in mammalian cells.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by mapping direct RNA targets.
- De-risks translational biomarker selection through high-specificity interaction data.
- Facilitates risk-adjusted advancement of RNA-targeted therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
The Fbio CLIP-seq method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing direct evidence of protein-RNA interactions for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping direct RNA-binding protein targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound screening and assay standardization.
- Analytics: Enables transcriptome-wide comparison of binding patterns and motif enrichment.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by profiling interactions in disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, antibody-independent platform for diverse RNA-binding protein studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through antibody-free, isotope-free, and scalable purification steps.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA-protein biochemistry and cross-linking techniques.
- Needs access to UV cross-linking, FLAG and streptavidin bead purification, and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various mammalian cell models with protocol optimization.
- Potential limitations include requirement for tagged protein expression and careful validation of purification efficiency.
