Localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de mosca blanca por inmunofluorescencia y PCR cuantitativa

Aclarar la espacialidad y la cantidad de virus en los vectores de mosca blanca puede ayudar a comprender las interacciones begomovirus-mosca blanca y en el desarrollo de nuevas estrategias para controlar las enfermedades begomovirales graves. Las ventajas de esta técnica son que podemos aislar rápidamente los tejidos de la mosca blanca, co-localizar proteínas virales y moscas blancas, y cuantificar los virus en cuerpos enteros de mosca blanca y plantas infectadas por el virus. En el momento experimental apropiado, después de la adquisición del virus, coloque las moscas blancas hembra anestesiadas con hielo en una gota de PBS en un portaobjetos del microscopio y utilice una aguja de acupuntura fina para abrir el abdomen de la mosca blanca bajo un microscopio estéreo.

Utilice la aguja para extraer el intestino medio y colocar el en la parte media en un plato de colección de PBS. Para recoger los PSG, divida el cuerpo en el tórax del lado dorsal cerca de la cabeza y fije la mosca blanca con una aguja a través del tórax. Usa una segunda aguja para agitar la mosca blanca hasta que las dos glándulas salivales se separen del cuerpo y transfiera las glándulas a un nuevo plato de PBS.

Para recoger los ovarios, abra completamente el abdomen y use una aguja para separar los ovarios de los otros tejidos. Use una pipeta para eliminar el exceso de tejido y transferir los ovarios a un nuevo plato de PBS. Para recoger una muestra de hemofinada, agregue 10 microlitros de PBS en una nueva diapositiva del microscopio y coloque una nueva mosca blanca en la gota.

Use una aguja de acupuntura fina para hacer suavemente un agujero en el abdomen. A continuación, aplique una ligera presión sobre el abdomen para liberar la hemolímpido en el tampón y recoja una muestra de ocho microlitros del líquido. Para visualizar la localización de TYLCV en PSG de mosca blanca, midgut o tejidos ováricos cosechados, transfiera de 15 a 20 especímenes a un plato de Petri de 3,5 centímetros de vidrio y aspire el exceso de tampón.

Fije los tejidos en un mililitro de 4%paraformaldehído durante dos horas a temperatura ambiente antes de lavar cuidadosamente las muestras tres veces durante dos minutos en un mililitro de TBS fresco por lavado. Después del último lavado, permeabilizar las muestras con un mililitro de 0.5%Triton X-100 durante 30 minutos antes de lavar tres veces como se acaba de demostrar con un mililitro de TBST por lavado. Después del último lavado, bloquee cualquier unión inespecífica con un mililitro de albúmina sérica bovina al 1% durante dos horas a temperatura ambiente seguida de tres lavados en TBST como se ha demostrado.

Después del último lavado, etiquete las células con los anticuerpos primarios de interés durante la noche a cuatro grados centígrados protegidos de la luz. A la mañana siguiente, lave las muestras tres veces con TBST antes de añadir los anticuerpos secundarios apropiados durante dos horas a temperatura ambiente protegidos de la luz. Al final de la incubación, lave las placas medias tres veces y transfiera las muestras a un portaobjetos limpio.

Retire tanto tampón como sea posible y manche los núcleos con una gota de DAPI antes de montarlos con un cubreobjetos y examinar los tejidos etiquetados mediante microscopía confocal. Para la cuantificación de TYLCV, lave las muestras de tejido de mosca blanca cosechadas de dos a tres veces en PBS fresco y transfiera 20 fálicas medianas, 20 HPG o un ovario en cinco microlitros de PBS en tubos de PCR individuales que contengan 25 microlitros de solución de lysis. Agregue de cinco a siete perlas cerámicas de dos milímetros de diámetro a cada tubo y muele las muestras en un homogeneizador.

Agregue una muestra de ocho microlitros de hemólimpa en un nuevo tubo de PCR y agregue 10 microlitros de lysis al tubo con una mezcla exhaustiva. Incubar todas las muestras a 65 grados centígrados durante una hora seguida de una incubación de 10 minutos a 100 grados centígrados y una breve centrifugación. A continuación, añada 18 microlitros de mezcla maestra en los viales de tubos cuantitativos de tiras de PCR y añada dos microlitros de cada muestra de ADN a al menos tres viales.

Una vez cargadas todas las muestras, cierre los tubos y la centrífuga para sedimentar la solución en el fondo de cada vial. Cargue los viales en un ciclor térmico en tiempo real para PCR cuantitativo, seleccionando cibernética como el tinte de fluoróforo y desconocido como el tipo de muestra. A continuación, exporte los datos cuantitativos a una hoja de cálculo para el análisis de la cantidad relativa de ADN viral en cada muestra.

Aquí, se muestran imágenes representativas de TYLCV en la tinción DAPI en PSG de mosca blanca, midguts y ovarios. Como se observó, TVLCV demuestra una mayor acumulación dentro de los PSG y midguts que en los ovarios. La cuantificación del virus en PSG de moscas blancas, midguts, hemolymph y ovarios después de alimentarse de tomate infectado por TYLCV durante 24, 48 y 72 horas indica que la cantidad de virus aumenta en diferentes tejidos de mosca blanca en correlación directa con el aumento del período de acceso a la adquisición.

Lo mejor es utilizar moscas blancas frescas, ya que los insectos muertos aumentarán la dificultad de la disección. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros análisis, como la hinchazón occidental y la inmunoprocipitación, para responder preguntas adicionales sobre la expresión de proteínas virales y las interacciones virales y de proteínas vectoriales.