Name: Descubrimiento de objetivos reguladores de CsgD en biofilm de Salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Descubre los objetivos reguladores de CsgD en biofilms de Salmonella utilizando ChIP-seq. Este protocolo demuestra técnicas para analizar la unión diferencial de factores de transcripción en células de biofilm versus planctónicas.

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Esta investigación fue apoyada por una subvención del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) (#2017-05737) a AW y a través de la Cátedra Jarislowsky en Biotecnología. MP fue apoyado por una beca NSERC-CREATE a través del Programa Integrado de Capacitación en Enfermedades Infecciosas, Seguridad Alimentaria y Políticas Públicas (ITraP) en la Universidad de Saskatchewan.
Los autores quieren agradecer a Dani Dale por el rodaje y la edición.

1. Crecimiento de células de cultivo de frascos
<ol><li>A partir de caldos congelados, las cepas de Salmonella serovar Typhimurium en el agar LB (20 ml de medios sólidos en placa Petri de 100 mm) con el antibiótico adecuado e incuban a 37oC durante 16-20 h para obtener colonias aisladas.</li>
	<li>Inocular caldo LB de 5 ml que contiene el antibiótico adecuado en un tubo de cultivo de borosilicato de 25 mm x 150 mm con 1-3 colonias de placas de rayas del paso 1.1. Incubar a 37oC con agitación a 200 rpm durante 7 h.</li>
	<li>Mida OD600 de cultivo de caldo utilizando un espectrofotómetro. Diluir una alícuota del cultivo 1 en 4 en PBS en una cubeta de 2 ml y medir la absorbancia a 600 nm. Hemos encontrado que el factor más crítico en este paso es el momento del crecimiento. Los valores OD se utilizan para normalizar los cultivos para entregar el número deseado de celdas en el paso 1.4.</li>
	<li>Añadir el volumen de 1,0 OD600 equivalente del cultivo celular (es decir, 109 células) a un matraz Erlenmeyer que contenga 100 ml de 1% de triptona con el antibiótico adecuado. Incubar a 28oC con agitación a 200 rpm durante 13 h. Nota: Las células de Biofilm aparecerán como escamas agregadas y las células planctónicas individuales están en los medios turbios.</li>
</ol>2. Recolección sin células acondicionado 1% triptona
<ol><li>Recoger el cultivo de matraz para sin células acondicionado 1% tryptone. Cultivo de matraz de pipeta varias veces para mezclar antes de añadir a un tubo de centrífuga.</li>
	<li>Centrífuga a 12.000 x g durante 10 min a 10oC para peletizar todas las células.</li>
	<li>Decant sobrenadante en una unidad de filtro de 0,2 m, filtro de vacío y dispensa en un tubo nuevo. Nota: Los agregados de Biofilm son adherentes en soluciones convencionales (por ejemplo, PBS) y se adhieren a los lados de los tubos y las puntas de las pipetas. Dado que permite una manipulación más fácil, utilizamos medios acondicionados (1% de triptona) para mover biopelícula inicialmente y utilizar PBS caliente inmediatamente antes de la reticulación (paso 4.5) para eliminar cualquier sustrato reticulado de proteínas que pueda estar presente en los medios.</li>
</ol>3. Separar el biofilm y las células planctónicas de los cultivos matraz2
<ol><li>Utilizando una pipeta estéril de 25 ml, el cultivo de matraz de alícuota en tubos de 15 ml. Centrífuga a velocidad lenta (210 x g) durante 2 min, para separar los dos tipos de celda. Nota: Las células de Biofilm deben formar un pellet suelto en la parte inferior del tubo</li>
	<li>Pipetear el sobrenadante que contiene células planctónicas en dos tubos centrífugos de 40 ml para más adelante (paso 5). Retire todo el líquido restante, teniendo cuidado de no molestar el pellet. Repita el proceso hasta que los tipos de celda se hayan separado de todos los medios de cultivo del matraz.</li>
</ol>4. Preparación de agregados de biopelículas
Nota: La biopelícula se cosecha por peso húmedo para producir 25 g de ADN, el material de partida mínimo recomendado para ChIP. El factor de conversión de Biofilm (BCF) de S. Typhimurium es 1.73 x 108 CFU/mg2. Los investigadores que preparen otros tipos de biopelículas tendrán que definir empíricamente el número de células por unidad de peso de biopelícula, que se utiliza para encontrar el peso de la biopelícula necesaria para 25 g de material de partida de ADN utilizando esta ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60736/60736eq1.jpg">
<ol><li>Pesar con precisión una tapa de presión de 2 ml o un tubo de tapa de tornillo.</li>
	<li>Resuspenda el pellet de biopelícula en 1 ml de triptona condicionada. Mueva la biopelícula resuspendida en una tapa de presión de 2 ml o un tubo de tapa de tornillo prepesados.</li>
	<li>Centrífuga durante 1 min a 11 000 x g a 20oC</li>
	<li>Retire con cuidado todo el sobrenadante del tubo y pese el tubo con precisión. Restar el peso del tubo del peso del tubo con biopelícula para encontrar el peso de la biopelícula. Debe ser del 10% del peso de la biopelícula objetivo.</li>
	<li>Lave las células para eliminar la triptona condicionada restante. Añadir 1 ml de PBS caliente al tubo y al vórtice suavemente para resuspender el pellet. Centrífuga durante 3 min a 8 000 x g a biopelícula de pellets y retire el sobrenadante. Añadir 1 ml de PBS al tubo y al vórtice para resuspender el pellet.</li>
</ol>5. Preparación de células planctónicas
<ol><li>Registre el volumen y la OD600 del sobrenadante planctónico a partir de centrifugación de velocidad lenta (paso 3.2) utilizando un espectrofotómetro</li>
	<li>Calcule el volumen requerido para un ODfinal 600 de 6.0: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60736/60736eq2.jpg">
</li>
	<li>Enfriar la centrífuga a 10oC y las células planctónicas de sedimentos por centrifugación (10.000 x g,10 min a 10oC)</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en el volumen final de PBS calculado en el paso 5.2.</li>
	<li>Remeasure la OD600 de las células plancttónicas utilizando un espectrofotómetro y dispensar el volumen de 6.0 OD600 células planctónicas en una tapa de presión de 2 ml o tubo de tapa de tornillo.</li>
	<li>Lleve el volumen a 1 ml con PBS.</li>
</ol>6. Homogeneización de células
<ol><li>Añadir una perla de acero inoxidable esterilizado de 5 mm a cada uno de los tubos.</li>
	<li>Homogeneizar utilizando un molino mezclador durante 5 min a 30 Hz. Observe los tubos agregados para confirmar que el biofilm se ha roto.</li>
	<li>Transfiera las células homogeneizadas a un nuevo tubo de 1,5 ml, evitando el cordón metálico. Lleve el volumen a 1 ml con PBS. Nota: Realice diluciones en serie para enumerar las celdas de entrada y compruebe que el número de celda final está cerca del número deseado o predicho.</li>
</ol>7. La retitulación de proteínas al ADN
<ol><li>Dispensar formaldehyde fresco en tubos de muestra a una concentración final del 1%. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Precaución: El formaldehído es corrosivo, una piel, un ojo e irritante respiratorio, e inflamable. Dispensar en una capucha de humo.</li>
	<li>Añadir 1 M de glicina a una concentración final de 125 mM para detener el entrecruzado. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente en una rueda giratoria.</li>
</ol>8. Lavar las celdas para eliminar el exceso de retitulador cruzado
<ol><li>Sedimenta las células a 8.000 x g durante 3 min y retira el sobrenadante</li>
	<li>Resuspenda el gleta en 20 sL de 25 inhibidores de la proteasa y 500 l de PBS esterilizado por filtro.</li>
	<li>Tubo centrífugo durante 3 min a 8000 x g y retire el sobrenadante.</li>
</ol>9. Células de lisiado
<ol><li>Resuspenda el pellet en un tampón de Lysis de 600 ol (consulte la Tabla 1)e incubar sobre hielo durante 10 min.</li>
	<li>Agregue 1,4 ml de búfer de dilución IP (consulte la Tabla 1) a un tubo estéril de 15 ml y mueva las células lysed al tubo de 15 ml. Mantenga el tubo sobre hielo durante 1,5–2 h, y vórtice suavemente y ocasionalmente. Nota: Algunos materiales celulares resistentes pueden permanecer en tubos. Un largo período de incubación sobre hielo con vórtice ocasional romperá el material. El resto se romperá a través de la sonicación.</li>
</ol>10. Fragmentación del ADN por sonicación
<ol><li>Coloque el tubo de 15 ml en un vaso de hielo y coloque la sonda de 3 mm dentro del tubo.</li>
	<li>Realiza 5 rondas de sonicación de 30 s en 20-40% de 400 W con 2 minutos de enfriamiento en hielo entre ráfagas.</li>
	<li>Material precipitado por sedimento por centrifugación (8000 x g,10 min a 4oC). Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.</li>
	<li>Opcionalmente, realice el desenlace a 65 oC durante 30-60 min y digiere el ARN y la proteína a 45 oC durante 30-60 min antes de correr con un gel de agarosa del 2% para comprobar si hay fragmentos de tamaño adecuado. Nota: Sumerja la sonda en el caso de la célula. Mantenga la solución en hielo mientras sonica y descansa. No retire el tubo mientras la sonda sónica esté pulsando. La solución debe aparecer en la presonicación turbia y una clara post-sonicación.</li>
</ol>11. Complejos inmunoprecipitados de anticuerpos de PROTEÍNA-ADN
<ol><li>Preparación<ol>
<li>Dispensar una alícuota de 1,35 ml para inmunoprecipitación y una alícuota de 200 l como control de entrada. Almacene el control de entrada a -80 oC hasta que se realicen los pasos de desentrelazado y digestión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inmunoprecipitación con anticuerpo primario<ol>
<li>Añadir 10 g de anticuerpo primario específico de proteína purificada a la alícuota de 1,35 ol. Incubar durante la noche a 4oC en una rueda giratoria. Nota: El anticuerpo primario puede ser un anticuerpo monoclonal, suero policlonal de alta calidad o anticuerpo epítopo comercial (es decir, anti-FLAG).</li>
		<li>Añadir 50 s de perlas magnéticas de proteína G a los tubos del paso 11.2.1 e incubar a 4 oC durante 3 h en una rueda giratoria.</li>
		<li>Coloque el búfer de lavado IP 1, el búfer de lavado IP 2 y EL pH 8.0 (consulte la Tabla 1)en un cubo de hielo. Tampón de elución caliente a 65 oC. Nota: No coloque la solución que contenga el tampón de elución en el hielo.</li>
		<li>Enlazar las perlas magnéticas de proteína G al lado de los tubos utilizando un soporte magnético</li>
		<li>Realizar lavados: lavar 2x con tampón de lavado de IP frío de 750 ml 1, lavar 1x con tampón de lavado de IP frío de 750 l 2 y lavar 2 x con TE frío de 750 l a pH 8.0. Mantenga los tubos en el soporte magnético durante los lavados.</li>
		<li>Añadir 450 l de búfer de elución IP (consulte la Tabla 1) a cada tubo e incubar a 65 oC durante 30 minutos con un suave vórtice cada 5 min.</li>
		<li>Enlazar las perlas al lado de los tubos usando un soporte magnético. Espere al menos 2 minutos hasta que la solución esté clara.</li>
		<li>Dispensar el sobrenadante despejado a un nuevo tubo de 1,5 ml, teniendo cuidado de no molestar el pellet de perlas magnéticas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. Desentrelazando los complejos de proteínas de ADN y digieris el ARN y las proteínas co-purificantes
<ol><li>Añadir 2 g de RNase A y NaCl a una concentración final de 0,3 M a cada tubo.</li>
	<li>Incubar a 65oC, durante 6 h o durante la noche.</li>
	<li>Completa la digestión proteica añadiendo 180 g de Proteinase K a cada tubo, luego incubando a 45oC durante 3-5 h.</li>
</ol>13. Preparación y secuenciación de la biblioteca
<ol><li>Purificar el ADN usando cuentas magnéticas Nota: Los perlas magnéticas son preferidas para aislar las pequeñas cantidades de ADN generalmente recuperadas durante ChIP con células bacterianas.</li>
	<li>Prepare bibliotecas utilizando un kit compatible con la plataforma de secuenciación seleccionada.</li>
	<li>Compruebe la concentración de la biblioteca con un fluorómetro y un kit dsDNA de amplia gama o un kit de cuantificación de la biblioteca qRT-PCR. Nota: En nuestra experiencia, las mediciones del fluorómetro pueden sobreestimar la concentración de ADN.</li>
	<li>Bibliotecas de grupos, que tienen en cuenta la cobertura adecuada para cada muestra de biblioteca. Para la secuenciación de Illumina con Salmonella,agrupamos de 10 a 12 bibliotecas. Añadir Tris-HCl pH 8.0 a una concentración final de 1 mM.</li>
	<li>Secuencia de acuerdo con las especificaciones de la plataforma seleccionada.</li>
</ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).</li>
<li>MacKenzie, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+Expression+of+CsgD+in+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Connects+Virulence+to+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence.</a> Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).</li>
<li>Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+expression+of+CsgD+in+biofilm+development+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).</li>
<li>MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+Link+between+Biofilm+Formation+and+the+Ability+of+Pathogenic+Salmonella+Strains+to+Colonize+Multiple+Host+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, 307(2017).</li>
<li>Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+biofilms%3A+an+overview+on+occurrence%2C+structure%2C+regulation+and+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Research+International%22%5BJournal%5D)">Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication.</a> Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).</li>
<li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+differential+transcription+factor+binding+in+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq.</a> Frontiers in Genetics. 6, 169(2015).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+protein-DNA+interactions+by+chromatin+immunoprecipitation+and+DNA+microarray+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+map+of+active+promoters+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A high-resolution map of active promoters in the human genome.</a> Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).</li>
<li>Dillon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H-NS+and+Sfh+regulatory+networks+in+Salmonella+Typhimurium+identifies+a+plasmid-encoded+transcription+silencing+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism.</a> Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).</li>
<li>Perkins, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+transcriptome+analysis+of+the+OmpR+regulon+of+Salmonella+enterica+serovars+Typhi+and+Typhimurium+reveals+accessory+genes+implicated+in+host+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization.</a> Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).</li>
<li>Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Immunoprecipitation+Sequencing+Technology+Reveals+Global+Regulatory+Roles+of+Low-Cell-Density+Quorum-Sensing+Regulator+AphA+in+the+Pathogen+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus.</a> Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).</li>
<li>Peano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Escherichia+coli+%CF%83%28S%29+core+regulon+by+Chromatin+Immunoprecipitation-sequencing+%28ChIP-seq%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis.</a> Scientific Reports. 5 (1), 10469(2015).</li>
<li>Blasco, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+regulator+EspR+of+Mycobacterium+tuberculosis+is+a+nucleoid-associated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein.</a> PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621(2012).</li>
<li>Jones, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+and+RNA-Seq+reveal+an+AmrZ-mediated+mechanism+for+cyclic+di-GMP+synthesis+and+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS pathogens. 10 (3), 1003984(2014).</li>
<li>Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+identifies+genes+under+direct+VraSR+regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus.</a> Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).</li>
<li>Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf">https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf</a> (2017).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>MacKenzie, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+evolution+leading+to+impaired+biofilm+formation+in+invasive+Salmonella+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains.</a> PLoS Genetics. 15 (6), 1008233(2019).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%3A+revisiting+the+efficacy+of+sample+preparation%2C+sonication%2C+quantification+of+sheared+DNA%2C+and+analysis+via+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR.</a> PloS One. 6 (10), 26015(2011).</li>
<li>Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H2A.Z+nucleosome+organization+in+the+human+and+yeast+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes.</a> Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).</li>
<li>Geertz, M., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+strategies+for+studying+transcription+factor-DNA+binding+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+welcome+to+the+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: welcome to the new frontier.</a> Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).</li>
<li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulatory+networks+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 298 (5594), 799-804 (2002).</li>
<li>Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+protein-DNA+interactions+in+bacteria%3A+insights+into+transcription+and+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization.</a> Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).</li>
<li>Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+bacterial+regulons+using+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Defining bacterial regulons using ChIP-seq.</a> Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).</li>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este protocolo describe una técnica para realizar ChIP-seq con Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm y células planctónicas de cultivo puro, para encontrar objetivos reguladores del regulador maestro de biopelículas, CsgD. Esperamos información de unión diferencial debido a la biestabilidad de CsgD en los dos tipos de células, con altos niveles en agregados de biopelículas y niveles bajos en células planctónicas2,3. Sin embargo, esta técnica también se puede aplicar a otros factores de transcripción bacteriana, tipos de células o condiciones de crecimiento. En particular, esta técnica se puede adaptar a otras biopelículas bacterianas utilizando un factor de conversión experimentalmente determinado para la CFU por unidad de peso de las células de biopelícula.
ChIP-seq puede ser propenso a la amplificación de errores técnicos a través de la secuenciación; sin embargo, la confirmación en pasos críticos puede prevenir este27. La especificidad primaria de los anticuerpos es importante para seleccionar sólo el factor de transcripción objetivo y el ADN que controla durante la inmunoprecipitación7. En este experimento, csgD se fusionó con una etiqueta 3xFLAG codificada por plásmido en el extremo 3' del gen, correspondiente al término C de CsgD22. El plásmido p3xFLAG sin csgD se utilizó como un "control" (S. Typhimurium 14028 écsgD + p3xFLAG). Las directrices ENCODE recomiendan realizar inmunoblots con anticuerpos primarios contra la proteína de interés, y lisados de cepas ChIP y cepas de deleción21. Es importante asegurarse de que las condiciones de crecimiento sean coherentes entre las réplicas para reducir la variabilidad en los resultados de unión de factores de transcripción y secuenciación posterior. Si uno es cuidadoso para asegurar que los tamaños de inóculo y las condiciones de crecimiento pre-inóculo sean consistentes, el crecimiento de biopelículas en el cultivo del matraz es consistente4. Es importante confirmar que todo el biofilm se ha roto después de la homogeneización, para garantizar el acceso igualitario de los reactivos, particularmente el enlace cruzado formaldehído, a todas las células.
Varias modificaciones pueden permitir a los investigadores utilizar este protocolo para otras proteínas de unión al ADN, tipos de células, cepas, condiciones de crecimiento o equipos de laboratorio. Si se utiliza para especies formadoras de biopelículas que no sean S. Typhimurium, el factor de conversión de las unidades formadoras de colonias por unidad de peso de biopelícula, debe determinarse experimentalmente mediante la recolección de diferentes cantidades de biopelícula, la homogeneización completa de la biopelícula y la realización de diluciones en serie y el recuento de placas para crear una curva estándar, que puede no ser precisa en pesos de biopelícula inferiores2. La transferencia de energía del Sonicador y la resistencia al tipo de célula pueden diferir; por lo tanto, se recomienda un ensayo de sonicación para encontrar el número de ráfagas de sonicación que producirán el rango de tamaño de fragmento necesario para la preparación y secuenciación de la biblioteca aguas abajo11. La fragmentación de la cromatina por nucleasa microcócica es una alternativa a la sonicación que produce una alta resolución de los sitios de ocupación; sin embargo, este método puede introducir sesgo de fragmentación7,28. El rango de tamaño de ADN puede modificarse dependiendo de los kits de preparación de bibliotecas posteriores y las plataformas de secuenciación. Otros métodos de homogeneización se pueden utilizar en lugar del molino mezclador. Por ejemplo, un homogeneizador de tejido de vidrio puede ser sustituido, pero puede aerosolizarse o romper incompletamente el biofilm. En términos de controles, el ADN pre-inmunoprecipitado se puede normalizar en el procesamiento y análisis posteriores a la secuenciación. También se puede utilizar como control13un control de IP simulado con suero de anticuerpos normales emparejado con especies.
Los investigadores deben tener en cuenta las limitaciones a este método al considerar un experimento ChIP-seq. Pueden ser necesarias modificaciones significativas para adaptarla a otros tipos de biopelículas. Por ejemplo, con Salmonella Typhimurium la suspensión inmediata de biopelícula en PBS conduce a una pérdida mensurable de agregados de biopelícula. La inmunoprecipitación dirigida a los objetivos reguladores de los factores de transcripción en bacterias puede resultar en cantidades muy pequeñas de ADN, lo que es un desafío para la purificación y detección en pasos posteriores. El sesgo se puede introducir durante el cizallamiento y la manipulación aguas abajo durante la detección de la biblioteca9. Además, este método no revela los niveles de expresión in vivo en respuesta a la unión del factor de transcripción. Los investigadores que tienen poca experiencia en bioinformática pueden ser desafiados por la canalización de análisis. Este método puede ser costoso y de tiempo intensivo; sin embargo, el costo de la secuenciación es a menudo menor que un microarray y está disminuyendo con el tiempo a medida que se siguen realizando mejoras tecnológicas.
Pocos métodos en la literatura describen ChIP con bacterias, y la mayoría de los experimentos bacterianos comienzan con una condición de crecimiento simple13,14,15,17,18. La preparación de muestras ChIP con células individuales es sencilla y presenta menos desafíos que la preparación de muestras ChIP con agregados de biopelícula. En cuanto a ChIP-seq, los métodos anteriores de estudio de los circuitos cis-reglamentarios, incluida la evolución sistemática de los ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX), los ensayos de cambio de movilidad electroforético (EMSA), ChIP-chip, la eliminación del promotor y el análisis de reporteros han sido complementados o reemplazados por ChIP-seq29. ChIP-seq está reemplazando ChIP-chip debido al avance de las tecnologías y la disponibilidad de secuenciación. La secuenciación profunda proporciona a los investigadores cantidades masivas de datos que pueden identificar sitios con menor afinidad de enlace y mayor resolución de par base con menos material de partida que ChIP-chip11,30. El análisis de los datos de ChIP de organismos con genomas de referencia de alta calidad es generalmente rápido y específico. Además, ChIP-seq es un método exhaustivo para descubrir en silico sitios de enlace predichos que pueden no estar ocupados en todos los tipos de células, fase de crecimiento, o condiciones ambientales31.
En el futuro, este protocolo se puede utilizar para facilitar la comprensión de la patogénesis bacteriana, en particular los organismos formados por biopelículas. La amplia adopción de esta técnica y la disponibilidad de nuevos conjuntos de datos pueden conducir a la integración de datos para identificar grupos de proteínas que se colocalizan para controlar los procesos celulares en microorganismos formadores de biopelículas32. Además, los datos ChIP-seq y RNA-seq se pueden integrar para construir modelos de sistema regulador33.

Las biopelículas bacterianas, los agregados estructurales de las células incrustadas en una matriz autoproducida, son resistentes a la desecación, los antibióticos y las respuestas inmunitarias del huésped1. Como tal, causan infecciones persistentes y crónicas y presentan desafíos únicos a los investigadores debido a sus soluciones a la supervivencia y la transmisión. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) se ha encontrado para establecer poblaciones fenotípicamente heterogéneas de agregados de biopelículas que son resistentes a la desecación y antibióticos, y células planctónicas que expresan factores de virulencia en el cultivo puro cuando se exponen al estrés ambiental (28 oC, limitando los nutrientes)2. Estos dos tipos de células surgen debido a la expresión biestable del regulador maestro de biopelícula, CsgD3. Hemos planteado la hipótesis de que esta puede ser una estrategia de cobertura de apuestas para Salmonella,donde las células planctónicas participan en la transmisión a corto plazo y las células de biopelícula son capaces de persistir a largo plazo en el medio ambiente hasta que surja una oportunidad de infectar a un nuevo huésped2,4. Muchos de los elementos reguladores que controlan la expresión csg operon están bien caracterizados5. Sin embargo, aparte de adrA y el csg operon6, se conocen pocos objetivos reglamentarios de CsgD. Identificar la red reguladora de CsgD nos ayudaría a comprender mejor el ciclo de vida de Salmonella y el papel que desempeñan las biopelículas en la transmisión.
La inmunoprecipitación de cromatina seguida de la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) es una potente técnica in vivo para la identificación de interacciones proteína-ADN en todo el genoma y proporciona información sobre procesos reguladores que implican factores de transcripción, modificaciones de histona o nucleosomas7. Estudios más recientes han utilizado esta técnica para evaluar la unión diferencial a proteínas entre las condiciones de crecimiento y los tipos de células8. En la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), los fragmentos de ADN con proteínas que interactúan se enriquecen a través de la selección de anticuerpos de las proteínas diana. Las células se cosechan y las proteínas de unión al ADN se retuercen al ADN in vivo a través del tratamiento entre lancantes formaldehide. Las células se lysed, liberando el contenido celular, y la cromatina se cizalla en aproximadamente 200–600 bp fragmentos7. Los fragmentos de ADN unidos a la proteína diana se inmunoprecipitan mediante anticuerpos y se aíslan por la desvinculación seguida de la digestión proteica9. Estos fragmentos de ADN representan sitios de unión a proteínas emparejados por hibridación a un microarray (ChIP-chip) o mediante secuenciación profunda y mapeo a la secuencia del genoma10,11. Aunque los experimentos con chip ChIP producen datos reglamentarios adecuados, son limitados debido al uso de sondas costosas, así como la hibridación y el sesgo de matriz12. ChIP-seq tiene un rango dinámico más grande con mayor resolución y cobertura de nucleótidos, mejor relación señal-ruido, y menos artefactos en comparación con ChIP-chip7.
ChIP se ha utilizado para analizar la regulación Sfh y OmpR en Salmonella serovar Typhimurium13,14, regulación AphA con sensación de quórum en Vibrio alginolyticus15, Regulación RpoS en Escherichia coli16, regulador de virulencia Regulación EspR en Mycobacterium tuberculosis17, posibles citoclasas de dicguanilato a través de la regulación AmrZ en Pseudomonas aeruginosa18, así como VraSR regulación en Staphylococcus aureus19. Los experimentos bacterianos ChIP-seq que se han descrito comienzan con el crecimiento de células en medios líquidos y la cosecha en forma de una sola célula. Sin embargo, el análisis de las biopelículas y la correspondiente regulación genética representan un nuevo conjunto de desafíos para generar un protocolo ChIP-seq exitoso. En este protocolo, ChIP-seq se utiliza para encontrar objetivos regulatorios diferenciales de CsgD, la S. Regulador de biopelícula maestro Typhimurium en biopelículas y tipos de células planctónicas. Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las cantidades apropiadas de biopelícula para ChIP-seq, la biopelícula de cosecha del cultivo del matraz, normalizar muestras de biopelícula y control de células únicas, homogeneizar el biofilm y la inmunoprecipitación completa. Esto será útil para el estudio de los objetivos reguladores en biopelículas bacterianas y se puede adaptar para muchas especies.

<table><tbody><tr><td>Agarosa en polvo</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Balance (Explorer pro)</td><td>Centrífuga</td> de sobremesa <td>Ohaus EP214</td><td></td></tr><tr><td>(8510R)</td><td>Eppendorf</td><td>022627023</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>BR dsDNA kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9006</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, sin EDTA Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>COEDTAF-RO ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico 15 mL</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico 50 mL</td><td>FroggaBio</td><td>TB50-500</td><td></td></tr><tr><td>DC Kit de ensayo de proteínas II</td><td>BioRad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta Desechable, 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Equipo de electroforesis (mini-PROTEAN)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de suelo (Sorvall Evolution RC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>728211</td><td></td></tr><tr><td>Fluorómetro (Qubit 3.0)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>GelRed&reg; Tinción de gel de ácido nucleico 10 000x en agua</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora (agitación)</td><td>VWR</td><td>1570-ZZMFG</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora (agitación en baño de agua)</td><td>New Brunswick</td><td>G76D</td><td></td></tr><tr><td>LB media</td><td>VWR</td><td>90000-808</td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético (DynaMag)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga (refrigerada)</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Kit de reactivos v3 (150 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>Molino mezclador</td><td>Retsch</td><td>MM400</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 115 mL Unidades de filtro, estériles, 0,2 y micro; m tamaño de poro</td><td>Thermo Scientific</td><td>73520-980</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit de preparación para Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NGS Limpieza y tamaño Seleccionar perlas magnéticas</td><td>Machery-Nagel</td><td>744970.5</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ratón normal</td><td>AbCam</td><td>ab188776</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri con tapa transparente (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipetas</td><td>FroggaBio</td><td>MP001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2542</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Conejo Anticuerpo policlonal anti-FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A (10 mg/mL; Libre de DNasa y proteasa)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Rueda giratoria</td><td>Crystal Technologies & Industrias</td><td>TR 01A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Safe-Lock (2,0 mL, incoloros)</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 25 mL</td><td>FroggaBio</td><td>94024</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Montreal Biotech Inc.</td><td>Libra S22</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de acero inoxidable, 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Micropunta cónica 1/8" (3 mm) Sonda</td><td>Sonicator Sonics & Materiales, Inc.</td><td>630-0418</td><td></td></tr><tr><td>Medios de triptona</td><td>VWR</td><td>90000-286</td><td></td></tr><tr><td>Procesador de líquido ultrasónico (Sonicator)</td><td>Sonics & Materiales, Inc.</td><td>VC300</td><td></td></tr><tr><td>Equipo de vacío (Vacufuge plus)</td><td>Eppendorf</td><td>022820001</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua 1 (baño de agua de línea de laboratorio)</td><td>Thermo Scientific</td><td>18000-1</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua 2 (precisión)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221044</td><td></td></tr></tbody></table>

descubrimiento de objetivos reguladores de csgd en biofilm de salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (chip-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

La inmunoprecipitación de cromatina seguida de la secuenciación (ChIP-seq) es una técnica que se puede utilizar para descubrir los objetivos reguladores de los factores de transcripción, las modificaciones de la histona y otras proteínas asociadas al ADN. Los datos ChIP-seq también se pueden utilizar para encontrar la unión diferencial de factores de transcripción en diferentes condiciones ambientales o tipos de células. Inicialmente, ChIP se realizaba a través de la hibridación en un microarray (ChIP-chip); sin embargo, ChIP-seq se ha convertido en el método preferido a través de avances tecnológicos, la disminución de las barreras financieras a la secuenciación y cantidades masivas de producción de datos de alta calidad. Las técnicas para realizar ChIP-seq con biopelículas bacterianas, una fuente importante de infecciones persistentes y crónicas, se describen en este protocolo. ChIP-seq se realiza en Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm y células planctónicas, apuntando al regulador maestro de biopelícula, CsgD, para determinar la unión diferencial en los dos tipos de células. Aquí, demostramos la cantidad adecuada de biopelícula para cosechar, normalizando a una muestra de control planctónica, homogeneizando el biofilm para el acceso entre enlaces y realizando pasos rutinarios ChIP-seq para obtener resultados de secuenciación de alta calidad.

La preparación de muestras de inmunoprecipitación de cromatina a partir de biopelícula bacteriana implica varios pasos, como se muestra en la Figura 1. Estos incluyen el cultivo de biopelículas en el cultivo de matraz, la recolección de medios acondicionados, la recolección de una cantidad adecuada de biopelícula y células planctónicas como control, lavado de células en PBS, homogeneización, proteínas reticulantes al ADN, lisiamiento de células, fragmentación del ADN por sonicación, inmunoprecipitación de ADN con los anticuerpos adecuados y cuentas de proteína G, lavado y elución de ADN inmunoprecipitado, y purificación del ADN inmunoprecipitado para la preparación y la secuenciación de la biblioteca.
S. Las células de Typhimurium cultivadas en cultivos líquidos en condiciones de inducción de biopelículas se someten a cambio según el fenotipo para formar agregados de biopelícula multicelular y células planctónicas. Esta población contendrá aproximadamente un 40% de agregados de biopelícula, que expresan niveles más altos de temperaturas dinilosas (DCC) y reguladores de biopelículas, y 60% de células planctónicas, que expresan niveles más altos de genes asociados a la virulencia2,4 (Figura 2A). En este protocolo, describimos un método para cosechar ambos tipos de células para comparar sitios de transcripción a través de ChIP-seq; sin embargo, este protocolo se puede adaptar para otros tipos de biopelículas formadas por otras especies bacterianas. Los agregados de biopelícula y las células planctónicas están separados por centrifugación a velocidad lenta, que pellets biopelícula y deja células planctónicas en el sobrenadante2 (Figura 2B). A continuación, los tipos de celda se tratan por separado para los pasos posteriores del protocolo.
La cantidad recomendada de entrada de ADN para ChIP-seq es de 10-25 g20. En S. El cultivo del matraz de Typhimurium, 30 mg de biopelícula produce aproximadamente 25 g de ADN. Dado que los agregados de biopelículas tienen una abundancia de material extracelular proteico, hipotetizamos que esto interferiría con la eficiencia de la reticulación. Si simplemente normalizamos los diferentes tipos de células por número celular, el tratamiento de las células planctónicas puede resultar en una cantidad desigual de producto reticulado presentado para la inmunoprecipitación. Se realizó un ensayo proteico para determinar la cantidad equivalente de material celular planctónico para que coincida con 30 mg de biopelícula(Figura 3). 6.0 OD600 de células planctónicas se cosecharon para que coincidan con 30 mg de biopelícula.
Los agregados de Biofilm primero deben separarse para permitir el acceso igualitario del retivíador a todas las celdas. Encontramos que la forma más uniforme y de alto rendimiento de homogeneizar las células era utilizando un molino mezclador y una perla de acero inoxidable de 5 mm(Figura 4A). Las células planctónicas se tratan de la misma manera para reducir variables en el experimento ChIP-seq(Figura 4B).
Una vez que el ADN ha sido fragmentado por sonicación, reticulado, y tratado con RNase y Proteinase K, se puede visualizar en un gel de agarosa del 2%. El ADN sonicado se descompone en una colección de fragmentos que aparecen como un frotis en el gel de agarosa. El tamaño medio del fragmento disminuye con un número creciente de ráfagas de sonicación(Figura 5). La transferencia de energía variará para diferentes unidades de sonicadores, por lo que se recomienda un ensayo de sonicación para determinar el número de ráfagas de sonicación necesarias para fragmentar el ADN a un promedio de menos de 1 kb. Para nuestro experimento ChIP-seq, elegimos 5 ráfagas.
Las directrices ENCODE recomiendan una confirmación de la actividad de unión diana de anticuerpos con un inmunoblot21. En este caso, medimos la especificidad y la fuerza de unión de nuestros anticuerpos por inmunoblot en los lysaatos de células enteras preparados para ChIP(Figura 6). Confirmamos que el anticuerpo se une a CsgD-3xFLAG; las señales anti-FLAG y anti-CsgD colocalizan al peso molecular esperado (28 kDa)22.
Los procedimientos de ChIP a menudo producen bajas concentraciones de ADN. Por lo tanto, se eligió un método de purificación que elimina contaminantes y conserva una alta proporción del ADN. La purificación de perlas magnéticas se eligió sobre la purificación basada en columnas porque retuvo mejor las bajas concentraciones de ADN ChIP de entrada(Figura 7)y eliminó contaminantes (datos no mostrados).
Debido a la reducción de las cantidades iniciales de ADN, la preparación de la biblioteca de ADN ChIP puede requerir adaptadores diluidos y enriquecimiento de PCR. Antes de la secuenciación, las bibliotecas pueden ser visualizadas por el seguimiento del Bioanalyzer para confirmar la distribución correcta del tamaño antes y después del enriquecimiento de PCR(Figura 8). Además, si existe un objetivo reglamentario conocido del factor de transcripción, se debe utilizar qPCR para confirmar el enriquecimiento de las regiones de unión comparando el cambio de pliegue (-Ct) entre la abundancia de secuencia de genes de referencia y objetivo conocido en el ADN de entrada inmunoprecipitado y sonicado.
Los datos de secuenciación de ChIP deben analizarse asignando puntuaciones de calidad, recortando bases de baja calidad, alineando lecturas hacia delante y hacia atrás (en secuenciación final emparejada), ensamblando a un genoma de referencia de alta calidad, encontrando picos por encima del fondo y realizando análisis posteriores(Figura 9A). El análisis posterior debe incluir la visualización y anotación de picos, la coherencia con las muestras de réplica biológica y el análisis de motivos, y podría incluir análisis de unión diferencial entre condiciones o tipos de células, e integración de datos con expresión génica de vías conocidas. Para los datos ChIP-seq como el nuestro, los picos deben identificarse como significativamente por encima del fondo(Figura 9B,C, barras rojas) con una determinación de valor p, no simplemente por cambio plegado. En el análisis final, las lecturas asignadas se visualizan con la anotación del genoma de referencia(Figura 9D). Un mal resultado de ChIP-seq aparecería como input-seq sin ningún pico significativo por encima del fondo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig1.jpg"> Figura 1: Ilustración de pasos en ChIP-seq con biopelículas bacterianas. En el procedimiento descrito, S. Las células de Typhimurium se cultivan en un cultivo de matraz de triptona al 1% a 28 oC con temblor (1), se recogen medios acondicionados sin células para manipular tipos de células de biopelícula (2), que se utiliza para recoger una cantidad adecuada de biopelícula y células planctónicas (3). Estas células se lavan con PBS y se homogeneizan para romper el biofilm (4). Las proteínas se recruzan al ADN con un reticulante de formaldehida, después de lo cual las células se lysed para liberar el contenido celular (5). El ADN en el islato celular se fragmenta por sonicación (6). El ADN reticulado a la proteína diana se selecciona a través de la inmunoprecipitación con un anticuerpo que se une a la proteína diana y a las cuentas magnéticas de la proteína G (7). El ADN seleccionado se lava y se eluye de las perlas magnéticas de la proteína G (8) y se purifica para la preparación y secuenciación de la biblioteca (9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig2.jpg"> Figura 2: Modelo de matraz in vitro para el estudio S. Desarrollo de biopelícula de Typhimurium. (A) S. Las células de Typhimurium cultivadas en 1% de triptona durante 13 h a 28 oC se someten a un cambio de fenotipo para formar agregados de biopelícula y células planctónicas en la fase líquida del cultivo del matraz. ( B ) Los agregadosdeBiofilm y las células planctónicas del cultivo del matraz en (A) se separaron mediante centrifugación a 210 x g durante 2 min. El sobrenadante fue cosechado para preparaciones de células planctónicas y el pellet fue cosechado para preparaciones celulares de biopelícula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig3a.jpg"> Figura 3: Concentraciones totales de proteínas para células planctónicas y muestras de células de biopelícula cosechadas de S. Cultivo de matraz Typhimurium. Se realizaron ensayos de proteínas colorimétricas y se midieron cantidades de proteínas en relación con una curva estándar de BSA a 750 nm. El contenido de proteínas de las muestras de células planctónicas lysed a 4.0, 6.0 y 8.0 OD600 se comparó con 30 mg de agregados de biopelícula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig4.jpg"> Figura 4: Homogeneización de muestras celulares de S. Cultivos de matraz de biopelícula Typhimurium. (A) Los agregados de Biofilm del cultivo del matraz resuspendidos en PBS (izquierda) se homogeneizaron utilizando un molino mezclador a 30 Hz durante 5 min (derecha). (B) Las células planctónicas del cultivo del matraz resuspendidas en PBS fueron procesadas por el molino mezclador a 30 Hz durante 5 min para asegurar la consistencia entre las muestras de tipo de celda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig5a.jpg"> Figura 5: Ensayo de sonicación con lisados de células pre-ChIP. Las muestras de agregados de biopelículas y células planctónicas fueron separadas, homogeneizadas, reticuladas y lysed. Los complejos de proteínas de ADN fueron sonicados hasta 8 veces a 30 s y 2 minutos de distancia en hielo para dividir el ADN en fragmentos más pequeños. Una porción del islao sonicado se separó en un gel de agarosa del 2%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig6a.jpg"> Figura 6: Especificidad de unión a objetivos del anticuerpo anti-FLAG utilizado en ChIP-seq. La especificidad de los anticuerpos se evaluó inmunoblotando contra los lysaatos de células enteras preparados a partir de los cultivos de matraz de la S. Las cepas de Typhimurium como se muestra. Las muestras de biopelícula sin tensión s/csgD +p3xFLAG/csgD y WT representan agregados de biopelícula cosechados a partir de matraces, mientras que las células planctónicas de la cepa decsgD a p3xFLAG y WT representan células planctónicas. El CsgD purificado de Su etiqueta fue cargado como control. Se normalizaron los lisatos de células enteras, de modo que se analizaron 30 g de proteína total en cada carril. Los números de la izquierda se refieren al tamaño (en kDa) de los marcadores de peso molecular preconfigurados. El anticuerpo primario utilizado para la mancha superior fue el anticuerpo policlonal rabbit-anti-FLAG (Sigma-Aldrich #F7425), mientras que la mancha inferior fue incubada con conejo-anti-FLAG junto con un anticuerpo monoclonal específico de CsgD2. Se utilizaron IgG anticonejo de cabra (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) y IgG antiratón de cabra (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) como anticuerpos secundarios. Las señales fluorescentes se visualizaron utilizando el sistema de imágenes Odyssey CLx y el paquete de software Image Studio 4.0 (Li-Cor Biosciences). Se muestran imágenes representativas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig7a.jpg"> Figura 7: Estrategias de purificación basadas en cuentas magnéticas o de columna para pequeñas cantidades de ADN resultantes de experimentos ChIP-seq. Las muestras de cantidades conocidas de ADN se purificaron utilizando kits basados en columnas o perlas magnéticas y la concentración del eluido se midió después de la purificación. Los perlas magnéticas mostraron una mejor recuperación a niveles bajos de ADN, similares a las bajas cantidades de ADN que normalmente se encuentran al final del protocolo ChIP-seq, pero antes de la preparación de la biblioteca NGS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig8.jpg"> Figura 8: Preparaciones de ADN ChIP y bibliotecas posteriores visualizadas por Bioanalyzer. (A) El tamaño medio del fragmento del ADN genómico después de la lisis celular y la sonicación fue de &lt;1000 bp, con la mayoría de los fragmentos en el rango de 200-500 bp. (B) El material de inicio para la preparación de la biblioteca estaba por debajo de la detección. (C) La ligadura del adaptador y el enriquecimiento de PCR permiten la amplificación de los fragmentos de la biblioteca. (D) Una mala preparación de la biblioteca tiene picos de ADN bajos, picos de peso molecular impar o alto, o picos de adaptador abundantes a aproximadamente 100 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60736/60736fig9a.jpg"> Figura 9: Los datos de ChIP-seq se analizan utilizando herramientas bioinformáticas y visualizados en un navegador genómico. A. Diagrama de flujo para el análisis bioinformático típico de los datos ChIP-seq. Las lecturas en bruto para biofilm (cepac-sgD + p3xFLAG/csgD) ycélulasplanctónicas (csgD + p3xFLAG) se limpiaron para lecturas y adaptadores de baja calidad, y se asignaron a S. Genomas de Typhimurium 14028s (NC_016856.1 para el cromosoma y NC_016855.1 para el plásmido) de Bowtie2 (v2.3.3.1) con los parámetros predeterminados23. MACS2 (v2.1.2) se utilizó para llamar a los picos con parámetros de '-q 0.01 -- nomodel', tomando réplicas de biopelículas como conjuntos de datos de prueba y plancónicos como control24. El módulo MACS2 bdgcmp se utilizó además para generar una pista de enriquecimiento plegable con parámetros de '-m FE'. El archivo de pico significativo con pista de enriquecimiento plegable se transformó en un archivo de peluca utilizando bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 y visualizado en el genoma de referencia utilizando Integrative Genomics Viewer v2.5.126. Se muestran picos representativos (barras rojas). (B) La región grande de 40 kbps, que contiene varios picos, es un resultado atípico pero todavía potencialmente valioso. (C) Este es un resultado más típico, que muestra dos regiones pico significativas. (D) Acercar el pico izquierdo en C, mostrando la asignación de lecturas a la región de la S. Typhimurium 14028s genoma que contiene promotores divergentes para uspA y uspB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60736/60736fig9alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Búferes de lisis celular</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer de Lysis</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl pH 8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA de 10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>inhibidores de la proteasa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Búfer de dilución IP</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mM Tris-HCl pH 8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA de 2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% Tritón X-100</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.01% SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>Búferes de inmunoprecipitación</td>
		</tr>
<tr>
<td>Búfer de lavado IP 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mM Tris-HCl pH 8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA de 2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% Tritón X-100</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1% SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>Búfer de lavado IP 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM Tris-HCl pH 8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>250 mM LiCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA de 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% NP-40</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% ácido desoxicólico</td>
		</tr>
<tr>
<td>TE (T10E1) pH 8,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM Tris-HCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA de 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Búfer de elución</td>
		</tr>
<tr>
<td>1% SDS</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mM NaHCO3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Recetas de búfer.

La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de próxima generación (ChIP-seq) es un método utilizado para establecer interacciones entre los factores de transcripción y las secuencias genómicas que controlan. Este protocolo describe técnicas para realizar ChIP-seq con biopelículas bacterianas, utilizando Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm bacteriano como ejemplo.

Descubrimiento de objetivos reguladores de CsgD en biofilm de Salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

La inmunoprecipitación de cromatina seguida de la secuenciación, o ChIP-seq, es una técnica que se puede utilizar para descubrir los objetivos reguladores de los factores de transcripción, modificaciones de histonas y otras proteínas asociadas al ADN. En ChIP-seq, las células se cosechan y la proteína de unión al ADN. está ligado al ADN in vivo con formaldehído.Las células están a la an celosía, liberando el contenido de la célula y la cromatina se corta en fragmentos de menos de 1000 pares base, generalmente entre 200 y 600 pares base. El ADN, que interactúa con la proteína diana, se inmunoprecipita mediante anticuerpos y se aísla mediante desvinculación. Los reticulamientos de proteínas de ADN se invierten y se digieren el ARN y la proteína.El ADN se purifica, se convierte en bibliotecas y se secuencia. Los datos ChIP-seq también se pueden utilizar para encontrar la unión diferencial de factores de transcripción en diferentes condiciones ambientales o tipos de células. Inicialmente, ChIP se realizaba a través de la hibridación en un microarray.Sin embargo, la secuenciación de ChIP se ha convertido en el método preferido debido a los avances tecnológicos, la disminución de las barreras financieras a la secuenciación y la producción masiva de datos de alta calidad. En este protocolo, demostraremos técnicas de realización de ChIP-seq con biopelículas bacterianas, una fuente importante de infecciones persistentes y crónicas. ChIP-seq se realizará en la biopelícula de salmonela typhimurium y las células planctónicas, dirigidas al regulador maestro de biopelícula, CSGD, para determinar la unión diferencial en los dos tipos de células.En este vídeo, demostraremos técnicas para determinar la cantidad adecuada de biopelícula para cosechar, normalizar una muestra de control planctónico, homogeneizar biopelícula para el acceso entre reticulantes y realizar pasos rutinarios de ChIP-seq para obtener resultados de secuenciación de alta calidad. Plato de rayas salmonella enterica servir nuestro typhimurium en un plato de agar LB para aislar colonias e incubar a 37 grados Celsius durante la noche. Inocular el caldo LB de cinco ml con una a tres colonias de la placa de la raya e incubar a 37 grados centígrados con temblor durante siete horas o para registrar el crecimiento.Encuentre la densidad óptica del cultivo del matraz a 600 nanómetros, utilizando un espectrofotómetro y agregue un OD 600 equivalente de cultivo celular o 10 a las nueve células a un matraz Erlenmeyer que contenga 100 mililitros de un solo porcentaje de triptona. Incubar a 28 grados centígrados con temblor durante 13 horas. Las células de biopelícula aparecen como escamas agregadas y las células planctónicas individuales están en los medios nublados.Biofilm son altamente resistentes y se adhieren a los lados de los tubos y puntas de pipeta. Utilizamos medios acondicionados para mover biopelícula inicialmente y utilizar PBS caliente inmediatamente antes de reticular para eliminar sustratos de reticulación de proteínas en los medios. Es posible que los investigadores necesiten encontrar una solución adecuada para volver a suspender el biopelícula.Recoger el cultivo del matraz en un tubo centrífugo y centrifugar a 12.000 G durante 10 minutos a 10 grados centígrados. Decantar el sobrenadante en una unidad de filtro de 0,2 micrómetros y filtro de vacío. Cultivo de matraz alícuota en tubos y centrífuga a velocidad lenta para separar los dos tipos de células.Las células de biopelícula están en el pellet en la parte inferior del tubo y las células individuales están en el sobrenadante turbio. Pipetear el sobrenadante que contiene células planctónicas en un tubo de centrífuga para más adelante. Se recomiendan 25 microgramos de ADN como entrada para experimentos ChIP-seq.En nuestro caso, 30 miligramos de biopelícula producen aproximadamente 25 microgramos de ADN. Dado que los agregados de biopelícula tienen una abundancia de material extracelular proteínico, compite por el reticulante y puede dar lugar a un producto reticulado desigual presentado para inmunoprecipitación. Se sugiere un ensayo proteico para determinar el material celular equivalente por concentración de proteínas.En este caso, seis células planctónicas OD 600 se cosechan como control de 30 miligramos de biopelícula. Biofilm se cosecha por peso húmedo y las unidades de cultivo de colonias de biopelícula se pueden encontrar utilizando el factor de conversión mostrado. Se alienta a los investigadores a encontrar el factor de conversión de la especie formadora de biopelículas con la que trabajan mediante homogeneización y diluciones de caída.Vuelva a suspender el pellet de biopelícula en un mililitro de triptona acondicionada y muévase a una tapa de presión de dos mililitros prepesada o un tubo de tapa de tornillo. Centrifugar durante un minuto a 11.000 G.Retire el sobrenadante del tubo y pese el tubo con precisión. Restar el peso del tubo del peso del tubo con biopelícula para encontrar el peso de los agregados.Debe estar dentro del 10% del peso de la biopelícula objetivo. Agregue un mililitro de PBS y vórtice para volver a suspender los agregados de biopelícula. Dispensar el sobrenadante de centrifugación a velocidad lenta en tubos centrífugos.Mida la densidad óptica de las células planctónicas a 600 nanómetros utilizando un espectrofotómetro y calcule el volumen requerido para un OD final 600 de seis. Enfríe la centrífuga Flora a 10 grados Centígrados y pelete las células planctónicas usando la centrífuga Flora. Centrifugar a 10.000 G durante 10 minutos a 10 grados centígrados.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en PBS. Remesure el OD 600 de las células planctónicas utilizando un espectrofotómetro y dispensar el volumen de seis células planctónicas OD 600 en una tapa de presión de dos mililitros o tubo de tapa de tornillo. Los agregados de biopelícula deben separarse para permitir que el reticulador acceda a las células.Las células planctónicas se tratan de la misma manera que las células de biopelícula para reducir las variables. El uso de perlas metálicas en un molino mezclador puede ser más eficaz para romper la biopelícula que los homogeneizadores de tejido de vidrio. Adenúdamente, agregue un cordón de metal esterilizado a cada uno de los tubos.Homogeneizar utilizando un molino mezclador durante cinco minutos a 30 Hertz. Observe los tubos agregados para confirmar que la biopelícula se ha roto antes de transferir las células homogeneizadas a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, evitando el cordón metálico. Lleve el volumen a un mililitro con PBS.En este punto, es opcional realizar diluciones de colocación para enumerar las celdas de entrada. Dispensar formaldehído fresco en tubos de muestra a una concentración final del uno por ciento. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en una rueda giratoria.Añadir glicina a una concentración final de 125 mililitros para apagar la reticulación e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Para lavar las células y eliminar el exceso de reticulante, centrifugar durante tres minutos a las 8.000 G y retire el sobrenadante. Re-suspender el pellet en inhibidores de la proteasa y 500 microlitros de PBS esterilizado por filtro.Vuelva a suspender el pellet en 600 microlitros de tampón de lelisis e incubar sobre hielo durante 10 minutos. Mueva el izado parcial a un nuevo tubo que contenga 1,4 mililitros de búfer de dilución IP. Mantener en hielo durante una hora y media a dos horas y vórtice de vez en cuando.Algunos materiales resistentes pueden permanecer en los tubos. Sin embargo, un largo período de incubación y vórtices ocasionales romperán el material agregado y el resto se romperá durante la sonicación. Sintonice el sonicador.Coloque el tubo de 15 mililitros en un vaso de hielo y coloque la sonda dentro del tubo. Pulso de 20 a 40 por ciento para cinco ráfagas de sonicación de 30 segundos y enfríe entre las rondas de sonicación. El izado celular aparecerá turbio antes de la sonicación y aparecerá claro después de la sonicación.Para eliminar el material precipitado, centrifugar a 8.000 G durante 10 minutos a cuatro grados y dispensar el sobrenadante en un nuevo tubo, evitando el pellet negro. La transferencia de energía de Sonicator y la resistencia al tipo de célula pueden diferir, por lo que se recomienda un ensayo de sonicación para encontrar el número de rondas de sonicación que producirán el rango de tamaño de fragmento requerido para la preparación y secuenciación de la biblioteca aguas abajo. Dispensar ADN sonicado en una alícuota de 1,35 mililitros para inmunoprecipitación y una alícuota de 200 microlitios como ADN de entrada.Mantenga el control de entrada a menos 80 grados Centígrados hasta que se crucen los pasos de descruciente y digerido. Después de probar los anticuerpos para asegurar su especificidad para la proteína diana, agregue el anticuerpo a los tubos de inmunoprecipitación e incubar a cuatro grados Celsius durante la noche en una rueda giratoria. Añadir 50 microlitros de proteína G cuentas magnéticas e incubar a cuatro grados Celsius en una rueda giratoria durante tres horas.Enlazar las perlas a los lados de los tubos utilizando un soporte magnético y realizar lavados. Lavar dos veces con 750 microlitros de tampón de lavado IP en frío uno. Lave uno con 750 microlitros de tampón de lavado IP en frío dos.Y lavar dos veces con 750 microlitros de TE frío a pH ocho. Mantenga los tubos en el soporte magnético durante los lavados. Agregue 450 microlitros de tampón de elución IP a cada tubo e incubar a 65 grados Celsius durante 30 minutos con un vórtice suave cada cinco minutos.Une las perlas a los lados de los tubos usando un soporte magnético. Espere al menos dos minutos hasta que la solución esté clara y luego dispense la solución despejada a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Para revertir los reticulantes y digerir el ARN, agregue dos microgramos de RNase ocho y agregue cloruro de sodio a su concentración final de 0,3 molares en cada tubo.Incubar a 65 grados centígrados durante más de seis horas o durante la noche. Para digerir la proteína, agregue 180 microgramos de proteinasa K a cada tubo e incubar a 45 grados Celsius durante tres a cinco horas. Purificar el ADN.Se prefieren perlas magnéticas para aislar las pequeñas cantidades de ADN recuperadas durante el ChIP con células bacterianas. Sin embargo, la extracción a base de columnas o de fenilcloroformo puede recuperar adecuadamente el ADN ChIP. Después de la purificación, las bibliotecas se preparan a partir de ADN ChIP purificado utilizando un kit que es compatible con la plataforma de secuenciación seleccionada.Las bibliotecas de ADN ChIP a menudo requieren agregar la cantidad mínima de adaptadores y realizar el número máximo de ciclos de amplificación de PCR. Compruebe el tamaño de la biblioteca mediante un bioanalizador y compruebe la concentración de la biblioteca con un cubit o un kit de cuantificación de biblioteca QPCR. A la vez, a la piscina de las bibliotecas y proceda con la secuenciación de acuerdo con las especificaciones de la plataforma seleccionada.El análisis de los datos ChIP-seq requiere puntuar la calidad base, recortar bases de baja calidad, alinear las lecturas de un ensamblaje con un genoma de referencia, llamar picos, asociar picos con genes y analizar motivos de unión sobre-representados. Los datos ChIP-seq suelen tener un bajo nivel de fondo. El ADN controlado por la proteína a la que se dirige la inmunoprecipitación se enriquecerá y aparecerá como picos que son al menos dos veces por encima del fondo.En este video, hemos descrito métodos para realizar ChIP-seq en biopelícula de salmonela y células planctónicas únicas que producen picos de ADN enriquecido en genes controlados por el factor de transcripción de interés. Se cree que la mayoría de la vida bacteriana en la naturaleza existe en biopelículas y hasta el 40% de las enfermedades humanas están relacionadas con biopelículas. Así que tienen enormes impactos médicos y económicos.Sin embargo, el biofilm es resistente y más difícil de enumerar, abrir y manipular. Los investigadores pueden utilizar las técnicas ChIP-seq que describimos para cosechar una cantidad adecuada de biopelícula, homogeneizar la biopelícula, lyse cells, sonicar, realizar inmunoprecipitación, purificar y secuenciar ADN de otras especies bacterianas formadoras de biopelículas.

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Descubrimiento de objetivos reguladores de CsgD en biofilm de Salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) (Video) | JoVE Journal

Descubrimiento de objetivos reguladores de CsgD en biofilm de Salmonella utilizando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq)

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