Name: Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprende a diseñar sistemas de dimerización de proteínas como biosensores para pequeñas moléculas mediante selección de fagos. Este método eficiente permite controlar el comportamiento celular y monitorear metabolitos en tiempo real sin equipo especializado.

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Este trabajo fue apoyado por el Premio a la Innovación de la Universidad de Washington (a L.G.), una subvención de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (1R35GM128918 a L.G.), y un fondo de inicio de la Universidad de Washington (a L.G.). H.J. fue apoyado por una beca de pregrado de la Washington Research Foundation. K.W. fue apoyado por una beca de pregrado del Instituto de Diseño de Proteínas de la Universidad de Washington.

1. Construcción de bibliotecas
<ol><li>Utilice una biblioteca de anticuerpos combinatoria sintética de un solo dominio con una diversidad de 1,23 a 7,14 x 109, como se ha descrito anteriormente19. Aunque este protocolo no incluye la construcción de bibliotecas, se puede aplicar a otras bibliotecas de carpetas combinatorias.</li>
</ol>2. Biotinylación de ligando objetivo o ligando
<ol><li>Biotinylate el ligando seleccionado, por ejemplo, CBD y tetrahidrocannabinol (THC)19, a través de diversas estrategias de síntesis química, dependiendo de los sitios de biotinylación adecuados de un objetivo.</li>
</ol>3. Detección de aglutinante de anclaje
<ol><li>Inicio de la selección<ol>
<li>Comience cada ronda de selección inoculando una sola colonia de células TG1, recién cultivada en 6 ml de 2YT a 37 oC y 250 revoluciones por minuto (rpm) a una absorbancia de 600 nm (OD600) de 0,5 euros. Incubar las células sobre hielo para su uso en el paso 3.5.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Selección negativa con perlas de estreptavidina ligadas a la biotina<ol>
<li>Preparar las "perlas de selección negativas" lavando 300 l de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina utilizando un bastidor de separación magnética, 3x con 0.05% de solución salina con fosfato con tampón De weno (PBST, 1 x PBS con 0.05% vol/vol Tween 20%) y 2x con 1 x PBS.</li>
		<li>Resuspenda las perlas con 1 ml de caseína del 1% en 1 x PBS (pH a 7,4) y satura las perlas añadiendo 5 veces la capacidad de unión reportada utilizando biotina. Incubar a temperatura ambiente (RT) en un rotador durante 1 h.</li>
		<li>Lave las perlas 5x usando 0.05% PBST y 3x usando 1 x PBS, para un total de ocho lavados.</li>
		<li>Añadir 1013 partículas de fago en 1% de caseína/1% de BSA en 1 x PBS (pH a 7,4) e incubar a RT en un rotador durante 1 h.</li>
		<li>Después de la incubación, recoja el sobrenadante que se utilizará en el paso 3.3.6.</li>
	</ol></li>
	<li>Selección positiva con perlas de estreptavidina ligadas biotiniadas<ol>
<li>Prepare las "cuentas de selección positiva" usando 1/2 el volumen de las cuentas utilizadas para las "cuentas de selección negativa" siguiendo los pasos 3.2.1.</li>
		<li>Vuelva a suspender las perlas con 1 ml de caseína de 1 ml en 1 PBS, pH 7,4 y saturar las perlas añadiendo 5 veces la capacidad de unión completa calculada sobre la base del manual utilizando el ligando biotintilado de elección. Incubar a RT en un rotador durante 1 h.</li>
		<li>Lave las perlas 5x usando 0.05% PBST y 3x usando 1 x PBS, para un total de ocho lavados.</li>
		<li>Bloquear las perlas con 1 ml de 1% de caseína/1% de BSA en 1 x PBS (pH a 7,4) e incubar a RT en un rotador durante 1 h para evitar la unión inespecífica entre los fagas y las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina.</li>
		<li>Lave las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina 3 veces usando 0.05% PBST y una vez usando 1 x PBS, para un total de cuatro lavados.</li>
		<li>Resuspenda las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina utilizando los fagos no atados tomados del paso 3.2.5 e incubar a RT en un rotador durante 1 h.</li>
		<li>Extraiga el sobrenadante sin perturbar las cuentas magnéticas. Guarde los fagos no enlazados como entrada, que se utilizarán en el paso 3.5.1.</li>
		<li>Lave las perlas 10x usando 0.05% PBST y 5x usando 1 x PBS. Entre cada tres lavados los transfieren a un tubo nuevo para evitar los fagos no específicamente unidos a las paredes del tubo.</li>
	</ol></li>
	<li>Elución de nanocuerpos expuestos en fago<ol>
<li>Eluir los fagos unidos competitivamente añadiendo 450 l del ligando no biotinilado,utilizando una concentración en el rango micromolar (por ejemplo, 10-50 m) e incubando a RT en un rotador durante 30 minutos. La concentración de ligando seleccionada para la elución competitiva de fagos enlazados depende de la KD deseada del "aglutinante ancla". Las concentraciones de ligando pueden ser relativamente altas en las rondas de selección iniciales y luego disminuir en rondas posteriores.</li>
		<li>Recoger sobrenadante y guardar los fagos elustres como salida, para ser utilizado en el paso 3.5.2.</li>
	</ol></li>
	<li>Valoraciones de entrada/salida e infección<ol>
<li>Para la valoración de entrada, prepare diluciones seriales de 10x en 1 x PBS hasta 109veces con el fago de entrada del paso 3.3.7. Utilice las 107–109 diluciones en serie para hacer infecciones transfiriendo un fago de entrada de 10 l de cada dilución a células TG1 de 70 l (OD600 de 0,5). Incubar a 37 oC durante 45 minutos, placar las células TG1 infectadas en tres platos de agar 2YT de 90 mm que contengan 100 g/ml de ampicilina y 2% (wt/vol) glucosa, e incubar durante la noche a 37 oC. A partir de las placas de la noche, la entrada de fago se puede calcular de la siguiente manera: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60738/60738eq1.jpg">
</li>
		<li>Para la infección de salida y la valoración, transfiera los fagos elustres del paso 3.4.2 a 3 mL de las células TG1 (OD600 de 0,5). Incubar en un baño de agua a 37oC durante 45 min. A continuación, prepare diluciones en serie 10x en 2YT hasta 103veces, placa cada dilución en 90 mm 2YT-agar platos, e incubar durante la noche a 37 oC. A partir de las placas de la noche, la salida de fago se puede calcular de la siguiente manera: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60738/60738eq1.jpg">
</li>
		<li>Divida las células TG1 infectadas restantes en tres placas de agar 2YT de 150 mm que contengan 100 g/ml de ampicilina y un 2% (wt/vol) de glucosa. Incubar placas durante la noche a 37oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificación y recuperación de la biblioteca para nuevas rondas de selección<ol>
<li>Añadir 3 ml de 2YT por placa, raspar con un rascador de celda estéril y recoger todas las células en un tubo cónico de 50 ml. Mezclar las células recolectadas con glicerol estéril (20% wt/vol concentración final). Mida la OD600 de la mezcla y haga 3-5 alícuotas en stock. Conservar a -80 oC para un almacenamiento a largo plazo.</li>
		<li>Para el rescate de fagos, diluir la mezcla bacteriana TG1 que contiene fagomi utilizando 25 ml de medios 2YT complementados con 2% de glucosa y 100 g/ml de ampicilina a una DO600 de 0,1 euros. Células de cultivo a 37 oC y 250 rpm a una OD600 de 0,5.</li>
		<li>Superinfectar las células mediante la adición de FAgo auxiliar CM13 a 5 x 109 pfu/ml e incubar a 37 oC y 250 rpm durante 45 min. El fago auxiliar CM13 proporciona las proteínas de capa de fago necesarias para el montaje de partículas completas de fago.</li>
		<li>Centrifugar el cultivo a 8.000 x g durante 10 min para eliminar la glucosa. Resuspenda las células utilizando 50 ml de medios 2YT suplementados con 100 g/ml de ampicilina y 50 g/ml de kanamicina e incubar a 25 oC y 250 rpm durante la noche.</li>
		<li>Centrifugar las células del cultivo nocturno a 9.000 x g, 4 oC durante 30 min. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y precipite los fagos en el sobrenadante utilizando la solución de 1/5 volumen PEG/NaCl (20% wt/vol polietilenglicol-6,000 y 2,5 M NaCl). Mezclar suavemente y colocar sobre hielo durante 1 h.</li>
		<li>Recoger las partículas de fago por centrifugación utilizando 12.000 x g a 4 oC durante 30 min. Resuspender los pellets usando 1 ml de 1 x PBS, y transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar el tubo a 20.000 x g y 4 oC durante 10 min para eliminar las bacterias residuales.</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga sin alterar el pellet bacteriano. Utilice una dilución de 1:100 para medir la absorción a 269 nm y 320 nm. El número total de fagos se puede calcular utilizando la siguiente fórmula23: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60738/60738eq3.jpg">
</li>
		<li>Almacene la biblioteca de fagos a 4 oC para uso a corto plazo o con un 25% de glicerol a -80 oC para un almacenamiento a largo plazo.</li>
		<li>Repita las rondas de selección (pasos 3.1–3.6) durante 3-6 rondas o hasta que se observe el enriquecimiento deseado (consulte la sección Resultados). Placa y recoger clones individuales (sección 4) con el fin de caracterizar su afinidad y especificidad con el ligando (secciones 5–7).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Aislamiento de clon único
<ol><li>Para aislar clones individuales de una subbiblioteca enriquecida, prepare diluciones en serie 10 veces de las células TG1 infectadas por fago (paso 3.5.2). Diluciones en serie de placas en platos de agar de 90 mm 2YT que contienen 100 g/ml de ampicilina y 2% (wt/vol) de glucosa e incuban a 37 oC durante la noche.</li>
	<li>A partir de las placas de perno, recoger colonias individuales en 250 l de medios 2YT complementados con 100 g/ml de ampicilina por pozo en placas estériles de pozo profundo y crecer a 37 oC durante la noche.</li>
	<li>A partir de los cultivos nocturnos, inocular 10 l en 500 ml de medios frescos 2YT complementados con 100 g/ml de ampicilina.</li>
	<li>Cultivar las células a un OD600 de 0,5, añadir el fago auxiliar CM13 a 5 x 109 pfu/ml e incubar a 37 oC y 250 rpm durante 45 min.</li>
	<li>Añadir 500 s de medios 2YT suplementados con 100 g/ml de ampicilina y 50 g/ml de kanamicina. Incubar a 25oC y 250 rpm durante la noche.</li>
	<li>Centrifugar las placas de pozo profundo de los cultivos nocturnos a 3.000 x g durante 10 min. Recoger el sobrenadante que contiene las partículas de fago sin perturbar el pellet celular.</li>
	<li>Las partículas de fago se pueden utilizar para ELISA para determinar la especificidad de los clones seleccionados al ligando. La biotina o un homólogo estructural del objetivo se puede utilizar como un control negativo.</li>
</ol>5. Validación del aglutinante de anclaje por ELISA
<ol><li>Recubrir 96 placas ELISA de pozo sin 100 ml de estreptavidina de 5 g/ml en tampón de recubrimiento (100 mM de tampón de carbonato, pH a 8,6) a 4 oC durante la noche.</li>
	<li>Lave las placas ELISA 3 veces con 0.05% PBST y agregue 100 sL de objetivo biotintilado de 1 M a los pocillos objetivo. Añadir 100 s de biotina de 1 m o seleccionar el homólogo a los pozos de control. Incubar a RT durante 1 h.</li>
	<li>Lave las placas 5 veces con 0.05% PBST y bloquee la unión inespecífica añadiendo 300 sl de 1% de caseína en 1 x PBS. Incubar a RT durante 1 h.</li>
	<li>Lave las placas ELISA 3x usando 0.05%-PBST y agregue el sobrenadante de fago purificado. Incubar durante 1 h a RT.</li>
	<li>Lavar las placas ELISA 10veces usando 0.05% PBST y añadir 100 l de peroxidasa de rábano picante (HRP)-M13 anticuerpo de proteína de capa principal (1:10,000 dilución con 1 x PBS con 1% de caseína). Incubar a RT durante 1 h.</li>
	<li>Lavar las placas ELISA 3x usando 0.05% PBST y añadir 100 éL de sustrato de tetrametilbenzidina (TMB). Incubar durante 10 min o hasta que se observe un cambio de color visible. Detenga la reacción añadiendo 100 ml de 1 M De HCl. Lea la placa a 450 nm en un espectrofotómetro.</li>
	<li>Para la expresión y purificación de proteínas, elija los clones que muestren alta afinidad y especificidad para el objetivo (ver Discusión).</li>
</ol>6. Expresión de proteínas, purificación y biotinylación
<ol><li>Como se informó anteriormente19, subclone seleccionó clones de la sección 5 y expresar como C-terminal Avi-tagged y His-tagged nanobodies.</li>
	<li>Expresar nanocuerpos seleccionados en el periplasma de las células de E. coli WK6 (normalmente en cultivo de 1 L), liberar por choque osmótico y purificar utilizando una columna de níquel-NTA (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Búfer de intercambio con una columna de desalación (1 x PBS con 5% de glicerol; véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Biotinylate nanocuerpos utilizando un kit comercial (ver Tabla de Materiales)para su uso posterior.</li>
</ol>7. Caracterización del aglutinante de anclaje por BLI
<ol><li>Analizar la afinidad de unión y la cinética de los aglutinantes de anclaje seleccionados mediante la inmovilización de aglutinantes de anclaje biotinylados de 200 nM en biosensores de estreptavidina (ver Tabla de Materiales)con tampón de ensayo de unión (1 x PBS (pH a 7,4), 0,05% Tween 20, 0,2% BSA, 3% de metanol).</li>
	<li>Calcular las constantes de disociación (KD) de las interacciones de anglutinante-ligand mediante análisis de estado estacionario mediante software de análisis de datos (véase Tabla de materiales). Los valores KD obtenidos suelen oscilar entre micromolarde de uno a dos dígitos.</li>
</ol>8. Detección de aglutinantes de dimerización
NOTA: El cribado de biopausa de los "aglutinantes de dimerización" es similar al de los aglutinantes de anclaje, excepto por dos pasos críticos: 1) Los aglutinantes de dimerización se seleccionan utilizando un aglutinante de anclaje biotinilado seleccionado y el complejo de aglutinantes de anclaje para el complejo negativo de aglutinante para el y selecciones positivas, respectivamente. 2) Durante el paso de elución, la trietilamina de 100 mM se utiliza para eluir fagos seleccionados positivamente que sólo estaban unidos al aglutinante de anclaje--ligand complejo objetivo. La solución de trimetilamina de 100 mM (pH a 11,5) se utiliza para eluir clones positivos al interrumpir las interacciones proteicas.
<ol><li>Inicio de la selección<ol>
<li>Comience cada ronda de selección inoculando una sola colonia celular TG1, recién cultivada en un medio mínimo, en 6 mL 2YT a 37 oC y 250 rpm a una OD600 de 0,5 euros. Incubar células sobre hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminación de nanocuerpos seleccionados negativamente<ol>
<li>Preparar el "tubo de resta" utilizando 400 s de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina y siga el paso 3.2. Sin embargo, en lugar de saturar con biotina, agregue 5 veces la capacidad de unión completa calculada utilizando el aglutinante de anclaje biotintilado seleccionado y guarde los fagos no unidos que se utilizarán en el paso 8.3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selección de nanocuerpos seleccionados positivamente<ol>
<li>Preparar el "tubo de captura" utilizando 1/2 el volumen de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina utilizadas para el "tubo de resta" y siguiendo los pasos 3.3.2 a 3.3.3. Sin embargo, en lugar de saturar con el ligando biotinilado, agregue cinco veces la capacidad de unión completa calculada utilizando el aglutinante de anclaje biotiniladoseleccionado.</li>
		<li>Para formar el complejo de anglutinantes de anclaje para la selección de aglutinantes de dimerización positiva, agregue una concentración suficientemente alta de ligando no biotinilado. Esto permitirá que la mayoría del aglutinante de anclaje ligado a la estreptavidina forme el complejo ligando al ligando.</li>
		<li>Siga los pasos 3.3.3 a 3.3.8, utilizando los fagos no unidos tomados del "tubo de resta".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elución de nanocuerpos seleccionados positivamente<ol>
<li>Eluir los fagos unidos al complejo de anglutinantes de anclaje añadiendo 450 éL de trietilamina de 100 mM, e incubando a RT en un rotador durante 10 min.</li>
		<li>Recoge los fagos esumiantes competitivos y sigue los pasos 3.4.1 a 3.4.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Otras rondas de selección de aglutinantes de dimerización<ol>
<li>Siga los pasos 3.5 y 3.6 para amplificar y recuperar la biblioteca con el fin de realizar más rondas de selección. Repita las rondas de selección durante 3-6 rondas o hasta que se observe el enriquecimiento deseado. Placa y selección de clones individuales (consulte la sección 4) para caracterizar su afinidad y especificidad con el objetivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Caracterización del aglutinante de dimerización por ELISA
<ol><li>Siga los pasos de la sección 4 para aislar clones individuales para su caracterización a través de ELISA.</li>
	<li>Para probar la afinidad de los candidatos de aglutinante de dimerización al complejo de aglutinantes de anclaje, cubra la placa diana ELISA utilizando 100 ml de aglutinante de anclaje biotinilado de 100 nM. Después de la incubación durante 1 h, agregue 1 m del objetivo de ligando para formar el complejo de anclarón-ligand de anclaje.</li>
	<li>La placa de control debe ser recubierta usando el aglutinante de anclaje biotinylated solo para analizar clones que también pueden unirse al aglutinante de anclaje libre. Añadir 100 l de aglutinante de anclaje biotinylado de 100 nM e incubar a RT durante 1 h.</li>
	<li>Siga las secciones 5.3–5.7.</li>
</ol>10. Caracterización del aglutinante de dimerización por BLI
<ol><li>La afinidad de unión y la cinética de los aglutinantes de dimerización para el aglutinante de anclaje- complejo de ligando se puede analizar mediante la inmovilización de aglutinantes de dimerización biotinilados en biosensores de estreptavidina (SA) con el búfer de ensayo de unión y luego se ensayo con 1 Aglutinante de anclaje preequilibrado con diluciones en serie del ligando. El KD, kon, y kfuera de las interacciones se puede calcular utilizando nuestro método reportado19.</li>
</ol>

<ol><li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li>
<li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li>
<li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li>
<li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li>
<li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside%2C+digoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li>
<li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+natural+antibodies%3A+the+power+of+in+vitro+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+%28PECS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li>
<li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li>
<li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li>
<li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li>
<li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li>
<li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li>
<li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li>
<li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475(2014).</li>
<li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li>
<li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li>
<li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COMBINES-CID%3A+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies%3A+natural+single-domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li>
<li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li>
<li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li>
<li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDenhardt%2C+DT+%22The+Single-Stranded+DNA+Phages%22">The Single-Stranded DNA Phages</a>. , 605-625 (1978).</li>
<li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+phosphoramidites%3A+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li>
<li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li>
</ol>

La Universidad de Washington ha presentado una patente provisional relacionada con esta obra.

Es fundamental elegir las concentraciones correctas de las bibliotecas de fagos de entrada para diferentes rondas de bioparnning. Por lo general, comenzamos a partir de una biblioteca de entrada de 10a 12–10 13 partículas de fago con una diversidad >109,lo que permite que se presenten en el ensayo desplegable las copias de cada clon de fago. Si la concentración de fago en un ensayo de unión es demasiado alta o baja, la probabilidad de unión inespecífica o pérdida de clones positivos aumen...

Los sistemas CID, en los que dos proteínas dimerize sólo en presencia de un ligando de moléculas pequeñas(Figura 1),ofrecen herramientas versátiles para disecar y manipular vías metabólicas, de señalización y otras vías biológicas1. Han demostrado el potencial en el accionamiento biológico, como la activación de células T controlada por fármacos2 y la apoptosis3,4,para mejorar la seguridad y eficacia de la terapia adoptiva de células T. Además, proporcionan una nueva metodología para la detección in vivo o in vitro de objetivos de moléculas pequeñas. Por ejemplo, las proteínas CID pueden fusionarse genéticamente con sistemas de reporteros de fluorescencia (por ejemplo, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)5 y proteínas fluorescentes permutadas circularmente)6 para mediciones in vivo en tiempo real, o servir como reactivos de afinidad para ensayos similares a inmunoabsorbentes ligados a enzimas sándwich (ELISA).
A pesar de sus amplias aplicaciones, la creación de nuevos sistemas CID que pueden ser controlados por un ligando de moléculas pequeñas determinado tiene grandes desafíos. Los métodos establecidos de ingeniería de aglutinantes de proteínas, incluida la inmunización animal7, la selección in vitro8,9,y el diseño de proteínas computacionales10 pueden generar proteínas de unión de ligando que funcionan a través de interacciones binarias proteína-ligand. Sin embargo, estos métodos tienen dificultades para crear un complejo de CID ternario inducido por ligando. Algunos métodos crean CID mediante la vinculación química de dos ligandos que se unen de forma independiente a las mismas o diferentes proteínas11,12,13,14,15,16 o dependen de la selección de proteínas aglutinantes como anticuerpos dirigidos a pequeños complejos de moléculas-proteínas preexistentes17,18, y por lo tanto tienen una opción limitada de ligandos.
Recientemente desarrollamos un método de ingeniería denovo de los sistemas CID19. Este método puede obtener la alta especificidad de la dimerización inducida por ligando (por ejemplo, una constante de disociación de aglutinante de anclaje-dmerización, KD (sin ligando) /KD (con ligando) > 1.000). La especificidad de la dimerización se logra utilizando aglutinantes de anclaje con sitios de unión flexibles que pueden introducir cambios de conformación sobre la unión de ligandos, proporcionando una base para la selección de aglutinantes selectivos de conformación que sólo reconocen aglutinantes de anclaje ligandos. Demostramos una prueba de principio mediante la creación de heterodímeros inducidos por cannabidiol (CBD) de nanocuerpos, un fragmento de anticuerpo funcional de 12-15 kDa de camión que comprende un andamio universal y tres bucles CDR flexibles(Figura 2)20,que pueden formar un bolsillo de unión con tamaños adaptables para epítopos de moléculas pequeñas21,22. En particular, la selección in vitro de una biblioteca de proteínas combinatorias debe ser rentable y generalizable para la ingeniería CID, ya que la misma biblioteca de alta calidad se puede aplicar a diferentes ligandos.
En este protocolo y vídeo, nos centramos en describir la selección y validación in vitro en dos pasos del anclaje(Figura 3A)y los aglutinantes de dimerización(Figura 3B)mediante la selección de la biblioteca combinatorial de nanobody con una diversidad superior a 109 utilizando el CBD como objetivo, pero el protocolo debe ser aplicable a otras bibliotecas de proteínas o objetivos de moléculas pequeñas. El cribado de aglutinantes CID suele tardar de 6 a 10 semanas(Figura 4).

<table><tbody><tr><td>Solución de sustrato ELISA Ultra TMB de 1 paso</td><td>Agar Thermo Fisher Scientific</td><td>34029</td><td></td></tr> Unidad de filtro centrífugo <tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 (corte de 3 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>ampicilina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Kit de ensayo de proteínas II</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>5000002</tr><tr><td>Kit de reacción estándar de biotina-proteína ligasa BirA</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Caseína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CM13 Fago auxiliar</td><td>Laboratorios de diseño de anticuerpos</td><td>PH020L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa monohidrato</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11090</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Estreptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Imán</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ADN rápida</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>N3238S</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest BglI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0074</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Columna de Desalinización GE</td><td>Healthcare</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap-FF-1ml</td><td>GE Healthcare</td><td>11000458</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Alfa Aesar</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>M13 Cubierta Principal Anticuerpo Proteico Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>SC-53004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C Espectrofotómetros</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-Pocillos Polipropileno DeepWell Placas de almacenamiento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Octet RED96</td><td>ForteBio</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design</td><td>Labs</td><td>PD0111</td><td></td></tr><tr><td>PEG-6000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Platino SuperFi ADN Polimerasa</td><td>Invitrogen</td><td>12351010</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Kit de purificación de PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin M13 Kit</td><td>Qiagen</td><td>27704</td><td></td></tr><tr><td>Medio de recuperación</td><td>Lucigen</td><td>80026-1</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super estreptavidina (SSA) Biosensores</td><td>ForteBio</td><td>18-5057</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 75 aumento 10/300 GL Columna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>TG1 Células Electrocompetentes</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP9726-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Columna de desalinización</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr></tbody></table>

creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Los eventos de dimerización de proteínas que se producen sólo en presencia de un ligando de moléculas pequeñas permiten el desarrollo de biosensores de moléculas pequeñas para la disección y manipulación de vías biológicas. Actualmente, sólo existe un número limitado de sistemas de dimerización inducida químicamente (CID) y la ingeniería de otros nuevos con sensibilidad y selectividad deseadas para ligandos específicos de moléculas pequeñas sigue siendo un desafío en el campo de la ingeniería de proteínas. Aquí describimos un método de cribado de alto rendimiento, combin binders-enabled selección de CID (COMBINES-CID), para la ingeniería de novo de sistemas CID aplicables a una gran variedad de ligandos. Este método utiliza la selección en dos pasos de una biblioteca combinatoria nanobody mostrada por fago para obtener 1) "aglutinantes de anclaje" que primero se unen a un ligando de interés y luego 2) "aglutinantes de dimerización" que solo se unen a los complejos de anglutinante-ligando. Para seleccionar aglutinantes de anclaje, una biblioteca combinatoria de más de 109 nanocuerpos aleatorizados de región determinante de complementariedad (CDR) se examinan con un ligando biotinilado y los hits se validan con el ligando sin etiquetar mediante interferometría de capa biológica (BLI). Para obtener aglutinantes de dimerización, la biblioteca de nanobody se analiza con complejos de anclarios de anclaje como objetivos para el cribado positivo y los aglutinantes de anclaje no enlazados para el cribado negativo. COMBINES-CID es ampliamente aplicable a aglutinantes de CID seleccionados con otras inmunoglobulinas, no inmunoglobulina o andamios diseñados computacionalmente para crear biosensores para la detección in vitro e in vivo de fármacos, metabolitos, moléculas de señalización, etc.

Describimos la selección in vitro en dos pasos y la validación de aglutinantes de anclaje y dimerización mediante la selección de la biblioteca combinatorial nanobody con una diversidad superior a 109 utilizando CBD como objetivo. Evaluar el enriquecimiento de la biopanning del fago durante las sucesivas rondas de selección para aglutinantes de anclaje y de dimerización es importante. Los resultados de enriquecimiento típicos después de 4-6 rondas de selección como se muestra en la Figura ...

La creación de sistemas de dimerización de proteínas inducidos químicamente con la afinidad y especificidad deseadas para cualquier ligando de moléculas pequeñas dado tendría muchas aplicaciones de detección y accionamiento biológico. Aquí, describimos un método eficiente y generalizable para la ingeniería de novo de sistemas de dimerización inducidos químicamente a través de la selección escalonada de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio visualizada por fago.

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Este protocolo es significativo porque proporciona un enfoque general para la ingeniería de sistemas de dimerización de proteínas como biosensores para una variedad de moléculas pequeñas. Además, utiliza una biblioteca de proteínas muy diversa para seleccionar biosensores para diferentes ligandos de una manera eficiente y rentable sin la necesidad de equipos especializados. El biosensor de ingeniería se puede utilizar para controlar químicamente el comportamiento celular y para monitorear los cambios en tiempo real en los metabolitos celulares.A través de esta demostración visual, los investigadores pueden observar una instrucción detallada de las técnicas con una clara expectativa de la producción experimental. Comience cada ronda de selección mediante el cultivo de una sola colonia celular competente en electroporación TG1 en seis mililitros de medio 2YT a 37 grados centígrados y 250 revoluciones por minuto a una absorbancia de 600 nanómetros de aproximadamente 0,5. Cuando se haya alcanzado la densidad óptica óptima, coloque las células sobre hielo.Para preparar las cuentas de selección negativas, lave 300 microlitros de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina tres veces con un mililitro de 05%PBS más Tween buffer y dos veces con un mililitro de PBS por lavado en un bastidor de separación magnética. Resuspender las perlas con un mililitro de 1%caseína en PBS, y saturar las perlas con biotina a cinco veces la capacidad de unión reportada de las perlas. Después de una hora a temperatura ambiente con rotación, lave las cuentas cinco veces con PBS más Tween y tres veces con PBS como se demuestra.Después del último lavado, agregue aproximadamente una vez 10 a las 13 partículas de fago en 1%caseína y 1%albúmina sérica bovina en PBS a las cuentas para una incubación de una hora a temperatura ambiente con rotación. Al final de la incubación, transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros. Para la selección positiva con las cuentas de estreptavidina ligand enlazadas biotiniladas, saturar la mitad del volumen de las cuentas utilizadas para la selección negativa en el ligando biotinilo de elección en cinco veces la capacidad de unión completa según se calcula de acuerdo con el manual.Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente con rotación, lave las cuentas cinco veces con PBS más Tween y tres veces con PBS solo como se ha demostrado, y bloquee las cuentas con un mililitro de 1% de caseína y 1%albúmina sérica bovina durante una hora con rotación. Al final de la incubación, lave las cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina tres veces en PBS más Tween y una sola vez en PBS, como se ha demostrado, y utilice un fago sin consolidar para recuperar las cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Extraiga el sobrenadante que contiene fagos sin perforar sin alterar las perlas y deje la muestra a un lado para ser utilizada como entrada.A continuación, lave las cuentas 10 veces con PBS más Tween y cinco veces con PBS como se ha demostrado, transfiriendo las cuentas a un tubo nuevo después de cada tres lavados para evitar la unión inespecífica de los fagos enlazados a las paredes del tubo. Para eluir competitivamente los fagos enlazados, agregue 450 microlitros de una concentración micromolar de ligando no biotinilado a las cuentas de selección positivas, y coloque las perlas en rotación durante 30 minutos. Al final de la incubación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo que se utilizará como salida.Para la valoración de entrada, prepare 10 diluciones en serie en PBS hasta una por 10 a la nueve veces con el fago de entrada. Transfiera 10 microlitros de fago de entrada de uno por 10 a siete a 10 a las nueve diluciones a alícuotas de 70 microlitros de las células TG1 preparadas. Después de 45 minutos a 37 grados Celsius, placa las células TG1 infectadas en platos individuales de agar 2YT de 90 milímetros que contienen 100 microgramos por mililitro de ampicilina y 2%glucosa para una incubación nocturna a 37 grados Celsius.A la mañana siguiente, utilice la fórmula para calcular la entrada de fagos. Para la infección de salida y la valoración, agregue los fagos eluidos a tres mililitros de células TG1 para una incubación de 45 minutos en un baño de agua Celsius de 37 grados. Luego prepare 10 diluciones en serie de las células infectadas en medio 2YT fresco hasta una vez 10 a la tercera concentración, y plato cada dilución en platos de agar 2YT de 90 milímetros para su incubación durante la noche a 37 grados Celsius.A la mañana siguiente, calcule la salida del fago de acuerdo con la fórmula. Para aislar clones individuales de una subbibliancia enriquecida, transfiera colonias individuales de las placas celulares TG1 infectadas por fagos durante la noche a 250 microlitros de medio 2YT complementados con ampicilina por pozo en placas estériles de pozo profundo para su cultivo nocturno a 37 grados centígrados. Cuando las células alcancen una densidad de 600 nanómetros de aproximadamente 0,5, agregue cinco veces 10 a las nueve unidades formadoras de placas por mililitro de fago auxiliar CM13 a cada pozo, e incubar las células durante 45 minutos a 37 grados Celsius a 250 rotaciones por minuto.Al final de la incubación, añadir 500 microlitros de 2YT medio complementado con ampicilina y 50 microgramos por mililitro de kanamicina a cada pocóter, y colocar la placa a 25 grados Celsius y 250 rotaciones por minuto durante la noche. A la mañana siguiente, sedimentar las células por centrifugación para permitir la recolección de las partículas de fagos. Para validar la unión de anclaje por ELISA, cubra las placas ELISA de 96 pozos con 100 microlitros de cinco microgramos por mililitro de estreptavidina en tampón de recubrimiento a cuatro grados centígrados durante la noche.A la mañana siguiente, lave las placas tres veces en 300 microlitros de PBS más Tween antes de añadir 100 microlitros de diana biotinilada de un micromolar a los pozos objetivo y 100 microlitros de biotina de un micromolar o homólogo objetivo a los pozos de control adecuados. Después de una hora a temperatura ambiente, lave las placas cinco veces con PBS más Tween por lavado, y bloquee cualquier unión no específica con 300 microlitros de 1% de caseína por pozo durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las placas tres veces en PBS fresco más Tween por lavado, y agregue el sobrenadante de fago purificado.Después de una hora a temperatura ambiente, lave las placas 10 veces con PBS fresco más Tween por lavado. Añadir 100 microlitros de rábano picante peroxidasa M13 anticuerpo de proteína de recubrimiento principal a cada pozo para una incubación de una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave las placas tres veces como se ha demostrado, y agregue 100 microlitros de sustrato de TMB a cada pozo para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente o hasta que se observe un cambio de color visible.A continuación, detenga la reacción con 100 microlitros de ácido clorhídrico de un molar por pozo, y lea la placa a 450 nanómetros en un espectrofotómetro. Después de la validación del aglutinante de anclaje, el cribado aglutinante de dimerización también debe realizarse utilizando la misma biblioteca de proteínas dirigida al complejo de aglutinante-ligand de anclaje. Los resultados típicos de enriquecimiento después de cuatro a seis rondas de selección son una buena indicación de que hay una alta proporción de golpes potenciales en los sublibrarios, en cuyo caso pueden no ser necesarias nuevas rondas de selección.ELISA de un solo clon es adecuado para analizar la afinidad de unión relativa y la selectividad de los aglutinantes de anclaje y dimerización y facilita la comparación de la selectividad de unión entre clones. Del mismo modo, la selección del aglutinante de dimerización permite la identificación de clones que forman un heterodémero con el aglutinante de anclaje inmovilizado sólo con o sin el ligando. Estos datos de unión dependientes de la concentración de ligandos sugieren que los nanocuerpos probados son adecuados para construir un sistema de dimerización inducido químicamente en comparación con la mala unión demostrada por las muestras de control.Además, se puede utilizar la cromatografía analítica de exclusión de tamaño para confirmar la formación de heterodímeros entre los aglutinantes de anclaje y dimerización en presencia del ligando. Por ejemplo, en este experimento, se observó un pico de dimerización cuando se mezclaron los aglutinantes de anclaje y dimerización y el cannabidiol. Por el contrario, no se detectó ningún pico de dimerización en ausencia de cannabidiol o cuando cada aglutinante se cargó solo en la columna.El sistema de dimerización proteica debe estar genéticamente codificado en células de levadura o mamíferos para permitir una mayor verificación de los biosensores seleccionados para el desarrollo de aplicaciones in vivo. Esperamos que este método proporcione a otros investigadores las herramientas efectivas y necesarias para detectar metabolitos importantes, moléculas de señalización o fármacos in vivo con una alta resolución espaciotemporal.

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Investigación

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Bioquímica

En este video, demostramos la técnica de visualización de fagos para aislar fagos prediseñados que expresan proteínas con alta afinidad por la proteína objetivo.

Uso de la visualización de fagos para seleccionar proteínas con alta afinidad con una proteína objetivo

La presentación en fagos es una técnica poderosa para capturar las proteínas o restos de proteínas que interactúan con una molécula inmovilizada de interés. Una vez que se ha tomado una decisión del tipo de fago biblioteca de cDNA para crear y pantalla, el protocolo aquí descrito permite la selección por afinidad eficaz que conduce a la identificación de los interactores.

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Se describe un método con acompañamiento visual para conducir, las selecciones de rendimiento altos escalables de bibliotecas de anticuerpos sintéticos combinatorios fagos contra cientos de antígenos simultáneamente. El uso de este enfoque paralelo, hemos aislado fragmentos de anticuerpos que exhiben alta afinidad y especificidad para diversos antígenos que son funcionales en inmunoensayos estándar.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

Proporcionamos un método para cribar simultáneamente una biblioteca de fragmentos de anticuerpos para determinar la afinidad de unión y la solubilidad citoplasmática utilizando la vía de translocación de arginina gemela de Escherichia coli, que tiene un mecanismo de control de calidad inherente para el plegamiento de proteínas intracelulares, para mostrar los fragmentos de anticuerpos en la membrana interna.

Visualización interior de la membrana bacteriana para la selección de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos

Los protocolos descritos permiten la construcción, caracterización y selección (contra el blanco de la opción) de una biblioteca de "domainome" de cualquier fuente de ADN. Esto se logra mediante una tubería de investigación que combina diferentes tecnologías: exhibición phage, un reportero plegable y próxima generación la secuencia con una herramienta web de análisis de datos.

Interactoma-Seq: Un protocolo para la biblioteca de Domainome construcción, validación y selección de Phage Display y la siguiente secuencia de generación

Este protocolo describe un procedimiento detallado para la construcción de una biblioteca de fago que aparecen anticuerpos sintéticos con diversidad a medida. Anticuerpos sintéticos tienen amplias aplicaciones desde la investigación básica para diagnósticos de enfermedad y terapéutica.

Construcción de fagos sintético muestra fabulosa biblioteca con diversidad a medida

Este estudio tenía como objetivo presentar una estrategia para identificar las interacciones entre fármacos y péptidos. La estrategia consiste en la biopanning de péptidos cortos que reconocen fármacos basados en un biosensor de micropeso de cristal de cuarzo (QCM), seguido de análisis bioinformática para evaluar cuantitativamente la información obtenida para el reconocimiento de fármacos y la anotación de los sitios de unión a fármacos sobre proteínas.

Estrategia de análisis bioaformático y bioinformática basada en biosensores para la validación global de interacciones entre fármacos y proteínas

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Aquí, presentamos un protocolo para introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida, y posteriormente acoplar la azida con una sonda química mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC).

Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido

Este protocolo describe un método para probar la capacidad de una proteína para co-sedimentar con actina filamentosa (F-actina) y, si se observa unión, para medir la afinidad de la interacción.

Medición de la unión de proteínas a actina F por co-sedimentación

Aprende a diseñar sistemas de dimerización de proteínas como biosensores para pequeñas moléculas mediante selección de fagos. Este método eficiente permite controlar el comportamiento celular y monitorear metabolitos en tiempo real sin equipo especializado.

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio (Video) | JoVE Journal

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

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